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SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD的构建、筛选及免疫原性研究
1
作者 赵仁双 朱羿龙 +10 位作者 尚超 韩继成 刘子睿 修志儒 李善智 李雅茹 杨霞 李霄 金宁一 金鑫 李一权 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期19-25,共7页
目的 构建重组痘苗病毒载体疫苗rVTT△TK-RBD,并评价其安全性和免疫原性。方法 参考严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)基因序列合成受体结合域(RBD)基因,并将其插入自主构建的重组质粒pSTKE的多克隆位点上,构建重组痘苗病毒穿梭... 目的 构建重组痘苗病毒载体疫苗rVTT△TK-RBD,并评价其安全性和免疫原性。方法 参考严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)基因序列合成受体结合域(RBD)基因,并将其插入自主构建的重组质粒pSTKE的多克隆位点上,构建重组痘苗病毒穿梭载体pSTKE-RBD,并转染到预先感染天坛株痘苗病毒(VTT)的BHK-21细胞内,经多轮的荧光噬斑筛选成功获得重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD;通过滴鼻方式免疫小鼠后,检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠体质量的影响;通过肌肉免疫小鼠后,分析rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠产生的特异性抗体和中和抗体的水平;通过流式细胞术检测rVTT△TK-RBD对BALB/c小鼠T细胞亚群的影响。结果 利用同源重组、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)筛选标记和多次荧光噬斑筛选,成功筛选获得了表达RBD的胸腺激酶(TK)基因缺失型重组痘苗病毒rVTT△TK-RBD,且PCR验证成功。BALB/c小鼠体内实验表明rVTT△TK-RBD具有较好的抗SARS-CoV-2的免疫原性且相比于亲本株VTT明显降低了对机体的毒性作用。结论 成功构建并获得SARS-CoV-2重组痘苗病毒疫苗rVTT△TK-RBD并通过各项试验证明其安全性和免疫原性。 展开更多
关键词 严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2) 天坛株痘苗病毒 TK基因 同源重组
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pSETsac B质粒构建及其对达卡气单胞菌kdp E基因的有痕与无痕敲除效率评价
2
作者 凌博 陈丽青 +7 位作者 王宇 杨诺 范丽霞 郭桂英 李雪松 曾纪锋 李迁 郑继平 《热带生物学报》 2024年第4期452-459,共8页
为构建一种新型基因敲除质粒,以pSET4s和pK18mobsac B质粒为基础,通过PCR和酶切连接的方法,构建了新质粒pSETsac B,然后以pK18mobsac B质粒为对照,评价新建质粒对达卡气单胞菌kdp E基因的有痕敲除(带有四环素筛选标记)和无痕敲除效率。... 为构建一种新型基因敲除质粒,以pSET4s和pK18mobsac B质粒为基础,通过PCR和酶切连接的方法,构建了新质粒pSETsac B,然后以pK18mobsac B质粒为对照,评价新建质粒对达卡气单胞菌kdp E基因的有痕敲除(带有四环素筛选标记)和无痕敲除效率。结果表明,两种质粒在有痕敲除效率上无差别,但在无痕敲除上,pSETsac B的敲除效率显著高于对照质粒pK18mobsac B。由于p SETsac B为穿梭性温敏质粒,因此,该质粒可望在革兰氏阳性和阴性菌的遗传机制研究中皆可发挥作用,本研究同时也为检视kdp E基因在达卡气单胞菌中的功能提供了前期的突变体材料。 展开更多
关键词 pSETsac B kdp E基因 基因敲除
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基因回路在癌症检测与治疗中的应用
3
作者 杨炯 沈丽 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1374-1383,共10页
自然进化过程中,细胞为了适应环境变化,必须感知内外繁多的信号,进行逻辑处理并执行相应功能,完成这一过程的信号转导通路是由细胞内自然存在的分子构成的。应用合成生物学手段构建的基因回路是一个根据检测或治疗目的定制的人工信号转... 自然进化过程中,细胞为了适应环境变化,必须感知内外繁多的信号,进行逻辑处理并执行相应功能,完成这一过程的信号转导通路是由细胞内自然存在的分子构成的。应用合成生物学手段构建的基因回路是一个根据检测或治疗目的定制的人工信号转导通路,由工程化改造或从头设计的生物分子构成,包含传感器模块、逻辑处理模块和应答模块3部分。经过理性设计的基因回路可感知肿瘤生物学标志物或失衡的病理状态,根据设定的条件释放示踪分子或治疗产物来识别或杀伤癌细胞。这些在细菌或人类细胞中量身定制的基因回路具有前所未有的特异性,已在动物实验中用于检测或治疗癌症。应用基因回路治疗癌症有3类手段:基于工程菌、基于CAR-T细胞和直接导入核酸的治疗。在对基因回路的模块性、正交性、可调性、可组装性进行优化的探索中,蛋白质回路展现出了明显的优势:反应速度快、不引起永久的基因改变和整合性佳。多传感器基因回路设计和控制论指导的基因回路设计是当下基因回路发展的两大主流方向,而开发拥有多传感器及调节元件的复杂单转录本蛋白质回路为该方向上的重点。本文主要对基因回路在癌症检测与治疗中的研究进行综述,重点阐述蛋白酶及其特异性切割位点在基因回路中的应用,其调节的灵活性使得蛋白质回路的开发成为可能,为新一代基因回路的研究拓展思路。 展开更多
关键词 合成生物学 基因回路 信号通路 癌症
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柯乐猪PAEP基因单核苷酸多态性对繁殖性能的影响
4
作者 赵永 杨齐心 +6 位作者 李维 熊力 杨红文 王春源 吴燕 向进 张依裕 《贵州畜牧兽医》 2024年第3期20-24,共5页
为了分析孕激素相关子宫内膜蛋白(PAEP)基因单核苷酸突变位点(SNPs)对柯乐猪繁殖性状的影响,采用Sanger测序法筛选鉴定柯乐猪母猪PAEP基因的SNPs,SHEsis在线软件分析SNPs的群体遗传特性,SPSS 22.0软件分析SNPs单、双倍型与柯乐猪母猪群... 为了分析孕激素相关子宫内膜蛋白(PAEP)基因单核苷酸突变位点(SNPs)对柯乐猪繁殖性状的影响,采用Sanger测序法筛选鉴定柯乐猪母猪PAEP基因的SNPs,SHEsis在线软件分析SNPs的群体遗传特性,SPSS 22.0软件分析SNPs单、双倍型与柯乐猪母猪群体的总产仔数、初生窝重、初生平均重、断奶仔猪数、断奶窝重5个繁殖性状指标的相关性。结果:柯乐猪母猪PAEP基因第4内含子存在3个SNPs,分别为g.1885136 G>A、g.1885158 G>A、g.1885223 G>A,各SNPs均存在3种基因型。g.1885136 G>A和g.1885158 G>A位点完全连锁,3个位点均表现为中度多态(0.25<PIC<0.5)。3个位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。3个突变位点共产生3种单倍型和6种双倍型。g.1885136 G>A和g.1885158 G>A位点AA基因型个体的总产仔数、断奶仔猪数、断奶窝重显著高于GA、GG基因型(P<0.05),g.1885136 G>A和g.1885158 G>A位点GA和GG基因型个体的初生平均重显著高于AA基因型(P<0.05)。双倍型H2H2对总产仔数、断奶仔猪数、断奶窝重3个性状都达到了显著正相关,为较优双倍型。结论:PAEP基因可作为柯乐猪母猪繁殖性状选育的候选基因,其中双倍型H2H2可作为柯乐猪母猪繁殖性状分子标记。 展开更多
关键词 柯乐猪 PAEP基因 SNP 繁殖性状
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丙二酸盐克罗诺杆菌rpoS基因突变株与回补株的构建
5
作者 姚悦 叶应旺 +2 位作者 凌娜 王洋 李杨 《合肥工业大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第5期673-677,共5页
丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)在面对环境胁迫时,通过自身调节机制适应压力。rpoS基因作为一种稳定期σ因子和压力应答过程中的主要调节因子,在细菌抵抗或耐受环境胁迫压力中发挥重要作用。文章运用red同源重组技术和质... 丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)在面对环境胁迫时,通过自身调节机制适应压力。rpoS基因作为一种稳定期σ因子和压力应答过程中的主要调节因子,在细菌抵抗或耐受环境胁迫压力中发挥重要作用。文章运用red同源重组技术和质粒表达系统,构建C.malonaticus G362的rpoS基因缺失株ΔrpoS和回补菌株ΔrpoS-com,为研究丙二酸盐克罗诺杆菌中rpoS基因的功能提供遗传材料。生长曲线测定结果表明,rpoS基因缺失未对正常培养条件下细菌生长产生显著影响。 展开更多
关键词 丙二酸盐克诺罗杆菌 同源重组 质粒表达 rpoS基因
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不同来源的人血清白蛋白对1-磷酸鞘氨醇的结合运载作用研究
6
作者 刘卿 赵娅菲 +6 位作者 徐俊 程露 黄雨薇 杜晞 李长清 王宗奎 马莉 《中国输血杂志》 CAS 2024年第5期524-533,共10页
目的研究不同来源的人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)对1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)的结合运载作用。方法以人血浆来源HSA(plasma derived HSA,pHSA)和基因重组HSA(recombinant HSA,rHSA)样本为研究对象,首先利用L... 目的研究不同来源的人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)对1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)的结合运载作用。方法以人血浆来源HSA(plasma derived HSA,pHSA)和基因重组HSA(recombinant HSA,rHSA)样本为研究对象,首先利用LC-MS/MS技术,比较分析上述样本中S1P含量的差异;其次,在生理浓度条件下,向HSA样本中直接添加S1P进行负载处理,比较不同来源的HSA对S1P结合作用;在无血清培养条件下,将不同来源HSA样本与HUVEC细胞进行共培养,分析不同处理组的细胞培养上清中S1P含量的变化,比较不同来源的HSA对细胞中S1P的运载作用。利用表面等离子体共振SPR技术分析不同来源HSA与S1P分子的相互作用情况并计算其亲和力大小。利用AutoDock Vina软件和Molprophet平台,对HSA和S1P进行分子对接分析,并预测HSA中S1P的关键结合口袋域。结果S1P含量检测结果显示,所有pHSA样本中均含有一定水平的S1P(3.31±0.03~30.35±0.07)μg/L,且不同厂家生产的pHSA样本中的S1P含量差异显著(P<0.001);然而所有rHSA样本中均未检测出S1P。负载处理结果显示,不同来源HSA对S1P的结合作用存在显著差异(P<0.001),且rHSA对S1P平均负载量约为pHSA的2倍(ΔC_(rHSA)=801.75±142.45μg/L vsΔC_(pHSA)=461.94±85.73μg/L;P<0.001,t=5.006)。共培养处理结果显示,所有HSA样本处理组与HUVEC细胞共培养处理6h后上清中的S1P浓度均明显升高,而空白对照组上清中S1P浓度无变化;处理6 h、12 h和24 h后各处理组间上清中S1P浓度均存在显著差异(P<0.001)。SPR分析结果显示,与rHSA相比,pHSA与S1P之间的亲和力更高(KD_(pHSA-S1P):2.38E-06,KD_(rHSA-S1P):3.72E-06)。分子对接分析和结合口袋预测发现,HSA与S1P的关键结合口袋可能位于HSA分子的IB亚结构域。结论不同来源的HSA对S1P均具有一定的结合运载作用,但这种作用差异具有统计学意义,与HSA分子的IB亚结构域存在关联。 展开更多
关键词 人血清白蛋白 人血浆来源 基因重组 1-磷酸鞘氨醇 结合运载
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化学试剂对塔宾曲霉同源重组效率的影响
7
作者 梁丽存 刘文龙 +3 位作者 刘晓青 姚斌 黄火清 杨浩萌 《生物技术进展》 2024年第4期586-593,共8页
某些化学试剂可以通过调节细胞周期或胞内DNA修复途径来提高基因编辑效率。以塔宾曲霉作为研究对象,通过CRISPR/Cas9工具,对其孢子色素合成相关基因fwn进行基因编辑,在转化过程中分别加入8种化学试剂,最后通过统计孢子颜色和抗性基因PC... 某些化学试剂可以通过调节细胞周期或胞内DNA修复途径来提高基因编辑效率。以塔宾曲霉作为研究对象,通过CRISPR/Cas9工具,对其孢子色素合成相关基因fwn进行基因编辑,在转化过程中分别加入8种化学试剂,最后通过统计孢子颜色和抗性基因PCR验证,检测8种化学试剂对塔宾曲霉同源重组效率的影响。结果发现,与零添加对照组相比,在原生质体转化过程中,添加苯菌灵(benomyl)、RS-1、香草醛(vanillin)和氯丙嗪(chlorpromazine),同源重组效率分别达到85.45%、60.90%、59.45%、65.95%,比对照组提高了18.05%、9.35%、7.9%、14.4%;当苯菌灵与其他试剂叠加使用时,同源重组效率进一步提高,最高可达97.92%。因此,化学试剂在原生质体转化中的应用为提高丝状真菌的基因编辑效率提供了新的思路。 展开更多
关键词 化学试剂 同源重组效率 塔宾曲霉
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大肠杆菌诺氟沙星超敏感多基因敲除株KYAH06构建与功能验证
8
作者 姜巨全 宋阳 +1 位作者 Heba Abdel-Motaal 邹俏 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期49-55,86,共8页
以E.coli DH5α为出发菌株采用pKD46质粒提供λRed重组系统完成以下三步基因敲除:大肠杆菌中RND超家族多药物抗性蛋白acrAB基因并借助其与pKD3质粒的氯霉素抗性片段同源重组被敲除;大肠杆菌中MATE家族多药物抗性蛋白ydhE基因通过卡那霉... 以E.coli DH5α为出发菌株采用pKD46质粒提供λRed重组系统完成以下三步基因敲除:大肠杆菌中RND超家族多药物抗性蛋白acrAB基因并借助其与pKD3质粒的氯霉素抗性片段同源重组被敲除;大肠杆菌中MATE家族多药物抗性蛋白ydhE基因通过卡那霉素抗性筛选和蔗糖反向筛选被无痕敲除;大肠杆菌中主要负责诺氟沙星外排的MFS超家族转运蛋白mdtH基因通过与pK18mobSacB质粒中的抗性片段的同源重组被敲除。以上基因敲除不同程度导致大肠杆菌对诺氟沙星的敏感性变化,最终获得诺氟沙星敏感性为0.0125μg·mL^(-1)的E.coli KYAH06,为大肠杆菌MdtH详细转运机制以及其他诺氟沙星外排转运蛋白鉴定和功能分析奠定试验基础。 展开更多
关键词 诺氟沙星 λRed重组系统 多药物逆向转运蛋白 AcrAB YdhE MdtH
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裂殖壶菌pks2基因启动子序列扩增及其活性分析 被引量：1
9
作者 朱清 臧晓南 +1 位作者 王振东 马帅 《中国海洋大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期66-73,共8页
针对目前裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)基因工程相关研究中,对内源启动子的了解和利用仍处在初步阶段的现状,本研究从裂殖壶菌中产多不饱和脂肪酸的主要途径聚酮合酶(PKS)途径出发,利用热不对称交错PCR技术(TAIL-PCR),针对pks2... 针对目前裂殖壶菌(Aurantiochytrium limacinum)基因工程相关研究中,对内源启动子的了解和利用仍处在初步阶段的现状,本研究从裂殖壶菌中产多不饱和脂肪酸的主要途径聚酮合酶(PKS)途径出发,利用热不对称交错PCR技术(TAIL-PCR),针对pks2基因扩增出了未知的5’端侧翼序列,初步分析得到pks2基因启动子序列,并分别在原核宿主大肠杆菌(Escherichia coli)与真核宿主酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中对启动子活性做进一步研究,发现了pks2基因启动子可以在大肠杆菌和酿酒酵母中有效启动绿色荧光蛋白的表达,而且pks2基因启动子相较于pks1、pks3基因启动子具有更高的启动活性,显现出了其作为启动子用于基因工程研究的可操作性。 展开更多
关键词 启动子 热不对称交错PCR技术 裂殖壶菌 pks2基因 绿色荧光蛋白
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猕猴桃抗菌肽截短体原核表达载体的构建
10
作者 李蒙 《西安文理学院学报（自然科学版）》 2023年第1期68-72,共5页
抗菌肽是生物体先天防御系统中的多肽,协助机体抵御外源微生物的侵害.天然抗菌肽提取难度大,不利于其开发利用,其旨在探究猕猴桃抗菌肽体外高效制备方法.本研究通过生物信息学方法进行序列分析与基因克隆合成猕猴桃截短体抗菌肽(Truncat... 抗菌肽是生物体先天防御系统中的多肽,协助机体抵御外源微生物的侵害.天然抗菌肽提取难度大,不利于其开发利用,其旨在探究猕猴桃抗菌肽体外高效制备方法.本研究通过生物信息学方法进行序列分析与基因克隆合成猕猴桃截短体抗菌肽(Truncated Antimicrobial Peptide,TrAMP)序列,并将其连接到原核表达载体pET-47b(+)+Fa-AMP上,转化获得其BL21(DE3)pLysS工程菌,经PCR和测序鉴定,表明重组表达载体构建成功,并经生物信息学模型预测显示抗菌肽具有抑菌活性,为进一步研究猕猴桃抗菌肽体外诱导表达及生物学功能验证奠定基础. 展开更多
关键词 抗菌肽 载体构建 猕猴桃
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PuFAD8基因过表达载体的构建及其在番茄中的遗传转化 被引量：1
11
作者 宋慧慧 颜龙飞 +3 位作者 苟莎莎 姚改芳 胡康棣 张华 《合肥工业大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2023年第3期392-396,共5页
脂肪酸去饱和酶8(fatty acid desaturase 8,FAD8)是FAD基因家族成员,可参与催化不饱和脂肪酸的合成进而影响果实香气。为进一步研究PuFAD8基因的功能及其与番茄果实挥发性物质的关系,文章构建了模式植物番茄PuFAD8基因的过表达载体,通... 脂肪酸去饱和酶8(fatty acid desaturase 8,FAD8)是FAD基因家族成员,可参与催化不饱和脂肪酸的合成进而影响果实香气。为进一步研究PuFAD8基因的功能及其与番茄果实挥发性物质的关系,文章构建了模式植物番茄PuFAD8基因的过表达载体,通过农杆菌介导遗传转化、植物组织培养技术获得番茄PuFAD8基因过表达植株。结果表明,番茄PuFAD8基因过表达载体构建成功,并获得番茄过表达植株,以便进一步研究该基因的分子功能,为明确其在番茄果实成熟过程中挥发性物质的调控机制奠定了基础。 展开更多
关键词 番茄 PuFAD8基因 过表达 载体构建 香气
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东亚飞蝗DSCAM2多克隆抗体制备
12
作者 邱佳 余瑛 《重庆理工大学学报（自然科学）》 CAS 北大核心 2023年第2期350-356,共7页
制备唐氏综合征细胞粘附分子2(DSCAM2)多克隆抗体,拟为DSCAM2功能探索提供免疫学工具。采用生物信息学方法对DSCAM2抗原结构进行分析;利用DNA重组技术构建DSCAM2828-957重组表达菌株;采用Ni亲和层析技术纯化重组DSCAM2828-957蛋白,免疫... 制备唐氏综合征细胞粘附分子2(DSCAM2)多克隆抗体,拟为DSCAM2功能探索提供免疫学工具。采用生物信息学方法对DSCAM2抗原结构进行分析;利用DNA重组技术构建DSCAM2828-957重组表达菌株;采用Ni亲和层析技术纯化重组DSCAM2828-957蛋白,免疫小鼠制备Anti-DSCAM2多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体效价、Western Blot法检测抗体特异性、瑞氏-吉姆萨染色和免疫荧光检测DSCAM2在东亚飞蝗血淋巴细胞定位;采用siRNA敲低DSCAM2,进行血淋巴细胞计数。结果表明,所构建的pET30a(+)-DSCAM2828-957/BL21(DE3)原核菌株成功表达重组DSCAM2828-957蛋白;用Ni螯合亲和层析分离获得的DSCAM2828-957重组抗原免疫小鼠,获得了效价高且特异性好的DSCAM2多克隆抗体;细胞定位分析显示DSCAM2在东亚飞蝗嗜碱性粒细胞高表达;敲低DSCAM2表达水平,引起东亚飞蝗总血淋巴细胞数量增多。 展开更多
关键词 东亚飞蝗 唐氏综合征细胞粘附分子2 结构域 DNA重组 蛋白质纯化 抗体制备
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mCherry标签融合SATB1真核表达质粒的构建
13
作者 齐文靖 杨壮 韩国军 《长春师范大学学报》 2023年第4期111-114,共4页
核基质结合蛋白SATB1调控染色质的空间结构,参与真核生物基因表达。本论文通过PCR获得SATB1目的基因,然后与载体mCherry-C1同时用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后,用T4连接酶进行连接。连接质粒转入感受态宿主细胞并在Kana抗性的LB培养基中培养... 核基质结合蛋白SATB1调控染色质的空间结构,参与真核生物基因表达。本论文通过PCR获得SATB1目的基因,然后与载体mCherry-C1同时用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切后,用T4连接酶进行连接。连接质粒转入感受态宿主细胞并在Kana抗性的LB培养基中培养。分离获得Kana抗性单克隆菌株并进行扩大培养后提取重组质粒。对重组质粒进行双酶切验证和DNA测序检测。本论文成功构建mCherry-SATB1真核表达质粒,为后续研究SATB1的功能机制奠定基础。 展开更多
关键词 SATB1 质粒构建 DNA测序
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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析 被引量：390
14
作者 童光志 周艳君 +4 位作者 郝晓芳 田志军 仇华吉 彭金美 安同庆 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期323-327,共5页
为了弄清2006年在我国南方一些猪场暴发的一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染病的病因,我们从12个省市48个发病猪场采集临床样品进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的... 为了弄清2006年在我国南方一些猪场暴发的一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染病的病因,我们从12个省市48个发病猪场采集临床样品进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的分离鉴定和分子流行病学分析。结果显示从48个猪场样品中均检测出了PRRSV,通过完整的ORF5和部分Nsp2基因序列比较分析发现来自12个省市不同猪场的PRRSV高度同源,而且在Nsp2基因上都有两个相同位点的缺失;从分离的15株PRRSV中选择湖南分离株HuN4人工感染5头60日龄的健康猪,结果5头猪分别在7 d～21 d内全部死亡,感染猪的临床症状和现地所见十分相似。本次试验结果表明新出现的以Nsp2基因部分缺失为特征的PRRSV对猪是高致病性的,可能是2006年大部分猪场暴发"高热综合症"的主要病因。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 高热综合症 分子流行病学
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抗菌肽天蚕素B基因及其串联体在毕赤酵母中的表达 被引量：20
15
作者 王秀青 张素芳 +2 位作者 曹瑞兵 周斌 陈溥言 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期120-123,共4页
通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点。亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用SacⅠ酶切使之线性化,采用电... 通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点。亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用SacⅠ酶切使之线性化,采用电击法转化毕赤酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵。经Tricine-SDS-PAGE检测,在α信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,且具有明显抑菌活性。 展开更多
关键词 天蚕素B 抗菌肽 毕赤酵母 表达 抑菌活性 重叠区扩增基因拼接法(SOE)
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猪II型圆环病毒全基因组序列分析及其ORF1和ORF2基因的克隆与表达 被引量：16
16
作者 韩凌霞 陈艳 +3 位作者 崔尚金 王云峰 仇华吉 童光志 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期10-13,共4页
猪II型圆环病毒(PCV＿2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap。本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中... 猪II型圆环病毒(PCV＿2)的2个主要开放阅读框ORF1和ORF2分别编码病毒的复制酶Rep和结构蛋白Cap。本试验将分离株L株病毒感染PK15细胞系,提取总DNA并以其为模板,通过PCR分别扩增了全病毒基因组、完整的Rep和Cap基因,并克隆到pMD18T载体中,进行了序列测定。将Rep和Cap基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pPROEXTMHT中,以融合蛋白的形式表达了这两种蛋白。根据文献报道,致病性的PCV＿2与无致病性的PCV1的型特异性抗原决定簇主要位于Cap基因的羧基端部分,本实验利用原核表达载体pGEX＿6p＿1融合表达了Cap基因羧基端423bp的片段。通过薄层扫描各重组菌诱导表达产物的SDS＿PAGE结果,重组质粒pPRO＿Cap和pPRO＿Rep以及pGEX＿ΔCap的外源基因表达量分别占总菌体总蛋白的15.1%、30.4%和19.6%。将表达的三种蛋白作为抗原,通过酶联免疫吸附试验分别与PCV＿2阳性猪血清和SPF猪血清进行了反应,pGEX＿ΔCap表达的蛋白(Cap蛋白的羧基端部分)抗原反应性最强,这表明截短的Cap蛋白羧基端部分将是一个良好的诊断PCV＿2感染用候选抗原。 展开更多
关键词 PCV-2 诊断抗原 猪II型圆环病毒 全基因组序列分析 ORFl基因 ORF2基因 基因克隆 基因表达
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MTT法在抗病毒药物筛选中的应用 被引量：58
17
作者 刘钊 杨占秋 +3 位作者 肖红 文莉 李汝霖 姜旋 《武汉大学学报（医学版）》 CAS 2004年第3期332-334,348,共4页
目的 :采用MTT法评价清热消炎复方制剂体外抗柯萨奇病毒 (CVB3 )、呼吸道合胞病毒 (RSV)效果。方法 :待正常细胞长成单层 ,用病毒感染 ,培养一定时间后 ,根据不同病毒感染细胞出现细胞病变 (CPE)时间的不同 ,加入一定量的MTT液 ,然后测... 目的 :采用MTT法评价清热消炎复方制剂体外抗柯萨奇病毒 (CVB3 )、呼吸道合胞病毒 (RSV)效果。方法 :待正常细胞长成单层 ,用病毒感染 ,培养一定时间后 ,根据不同病毒感染细胞出现细胞病变 (CPE)时间的不同 ,加入一定量的MTT液 ,然后测定OD570 值 ,计算病毒抑制率。结果 :MTT法较光镜CPE法更为客观 ,能以OD值变化反映药物对病毒的抑制程度 ,从而获得实验结果 ,且便于统计学处理。结论 展开更多
关键词 MTT法 抗病毒 柯萨奇病毒 呼吸道合胞病毒
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共表达H_9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因和鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力 被引量：25
18
作者 程坚 刘秀梵 +3 位作者 彭大新 刘红旗 吴艳涛 张如宽 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期52-58,共7页
为了构建更为安全有效的抗低致病性H9亚型禽流行性感冒 (流感 )的基因工程疫苗 ,将包含有H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素 (HA)基因、鸡Ⅱ型干扰素 (IFN Ⅱ )全长cDNA序列及调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子 (PE/L)的基因片段 ,定向插... 为了构建更为安全有效的抗低致病性H9亚型禽流行性感冒 (流感 )的基因工程疫苗 ,将包含有H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素 (HA)基因、鸡Ⅱ型干扰素 (IFN Ⅱ )全长cDNA序列及调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子 (PE/L)的基因片段 ,定向插入鸡痘病毒转移载体 1175的痘苗病毒启动子P7.5的下游 ,得到HA和IFN Ⅱ基因分别处于P7.5及PE/L转录调控下的重组转移载体 1175HAIFN。以脂质体转染法将 1175HAIFN转染至已感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株 (wt FPV)的鸡胚成纤维细胞 (CEF)中。 1175HAIFN与wt FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV HA IFN Ⅱ。通过在含X gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rF PV HA IFN Ⅱ。以间接免疫荧光法和细胞病变抑制试验证实 ,纯化的rFPV HA IFN Ⅱ感染的CEF能以非融合的方式同时表达HA和具有抗VSV活性的鸡IFN Ⅱ。动物试验表明 ,rFPV HA IFN Ⅱ能显著抑制静脉攻毒后 1日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡从泄殖腔排毒 ,且能减轻单表达HA的重组鸡痘病毒 (rFPV HA)抑制 1日龄SPF雏鸡增重的副作用。 展开更多
关键词 H9亚型禽流行性感冒病毒 重组鸡痘病毒 鸡Ⅱ型干扰素 血凝素
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低温对罗非鱼基因组DNA甲基化的影响 被引量：20
19
作者 朱华平 卢迈新 +5 位作者 黄樟翰 高风英 可小丽 刘志刚 李庆勇 刘玉姣 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期1460-1467,共8页
以经过连续多代抗寒选育获得的尼罗罗非鱼耐寒品系为实验材料,采用DNA甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)分析方法从全基因组水平上探讨了低温适应对罗非鱼DNA序列中CCGG位点的甲基化水平的影响... 以经过连续多代抗寒选育获得的尼罗罗非鱼耐寒品系为实验材料,采用DNA甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)分析方法从全基因组水平上探讨了低温适应对罗非鱼DNA序列中CCGG位点的甲基化水平的影响。结果显示,选用的18对选择性扩增引物共检测到849个位点。耐寒品系检测到的位点数为411个,对照组为438个,其中发生甲基化的位点数分别为72和104个,总甲基化率分别为17.52%和23.74%;全甲基化位点分别为37个和65个,全甲基化率分别为9.00%和14.84%;半甲基化位点分别为35个和39个,半甲基化率分别为8.52%和8.90%。结果分析表明,尼罗罗非鱼耐寒品系的总甲基化水平、全甲基化水平和半甲基化水平较对照组均有一定程度的下降。与对照组相比,尼罗罗非鱼耐寒品系基因组DNA甲基化总体水平下降了6.22%,其中以全甲基化位点变异为主,其下降幅度比例明显,为5.84%。由此可见,经过连续多代的低温胁迫可导致尼罗罗非鱼DNA甲基化水平发生改变,发生了去甲基化反应,表现为基因组甲基化程度降低的特征,说明了DNA甲基化与罗非鱼抗寒性反应密切相关。 展开更多
关键词 尼罗罗非鱼 低温 DNA甲基化 甲基化敏感扩增多态性
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对硝基苯酚降解菌P3的分离、降解特性及基因工程菌的构建 被引量：27
20
作者 崔中利 张瑞福 +1 位作者 何健 李顺鹏 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期19-26,共8页
分离到一株假单胞菌 (Pseudomonassp .)P3 ,该菌能够以对硝基苯酚为唯一碳源和氮源进行生长。在有外加氮源的条件下 ,P3降解对硝基苯酚并在培养液中积累亚硝酸根。P3有比较广泛的底物适应性 ,对多种芳香族化合物都有降解能力。不同金属... 分离到一株假单胞菌 (Pseudomonassp .)P3 ,该菌能够以对硝基苯酚为唯一碳源和氮源进行生长。在有外加氮源的条件下 ,P3降解对硝基苯酚并在培养液中积累亚硝酸根。P3有比较广泛的底物适应性 ,对多种芳香族化合物都有降解能力。不同金属离子对P3降解对硝基苯酚有不同的作用。葡萄糖的存在对P3降解对硝基苯酚无明显促进作用 ,而微量酵母粉可以大大促进P3对硝基苯酚的降解。以P3为受体菌 ,通过接合转移的手段将甲基对硫磷水解酶基因mpd克隆至P3菌中 ,获得了表达甲基对硫磷水解酶活性的基因工程菌PM ,PM能够以甲基对硫磷为唯一碳源进行生长。 展开更多
关键词 对硝基苯酚 生物降解 mpd基因 基因工程菌 分离
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