【目的】利用P2C可以定向进入卵巢以及Gal4蛋白可与UAS序列稳定结合的特点,在中华按蚊Anopheles sinensis中建立高效的非胚胎期外源DNA投递技术系统。【方法】注射P2C-Gal4-DsRed重组蛋白至吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,通过冰冻...【目的】利用P2C可以定向进入卵巢以及Gal4蛋白可与UAS序列稳定结合的特点,在中华按蚊Anopheles sinensis中建立高效的非胚胎期外源DNA投递技术系统。【方法】注射P2C-Gal4-DsRed重组蛋白至吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,通过冰冻切片荧光观察和Western blot检测分析重组蛋白P2C-Gal4-DsRed在卵巢中的投递效率;制备P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白,构建包含12×UAS重复基序的转基因质粒和辅助质粒,通过电泳迁移实验分析重组蛋白P2C-Gal4 DNA BINDING和12×UAS重复基序间的体外结合;分别将体外孵育的P2C-Gal4 DNA BINDING+辅助质粒ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+转基因质粒ITF2-12×UAS afm复合物注射入吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,于血餐后40 h时提取其卵巢组织DNA,并通过特异性引物PCR扩增和测序分析外源DNA在活体中的投递情况。【结果】100%注射P2C-Gal4-DsRed的中华按蚊雌成蚊卵巢在绿色滤光片下呈现明显的红色荧光,表明P2C-Gal4-DsRed重组蛋白能够被高效地导入雌成蚊卵巢中;P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白能够与12×UAS重复基序以及含有该重复基序片段的质粒稳定结合;分别有91%和93%的注射了P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF2-12×UAS afm的雌成蚊卵巢组织中能够检测到外源DNA片段。【结论】在中华按蚊中成功建立了基于P2C卵巢导向肽和Gal4-12×UAS重复基序结合特性的外源DNA投递技术体系;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现质粒等DNA分子在中华按蚊卵巢中的投递,这为进一步简化转基因、过表达及基因敲入等遗传操作奠定了基础。展开更多
昆虫性别决定机制复杂多样,研究昆虫性别决定机制既能加强对物种进化关系的理解,也能为通过遗传调控控制害虫种群提供新方向。鳞翅目昆虫多为雌雄二型,繁殖方式以两性生殖为主,性染色体系统大多为ZW/ZZ系统,雌性为ZW型,雄性为ZZ型。昆...昆虫性别决定机制复杂多样,研究昆虫性别决定机制既能加强对物种进化关系的理解,也能为通过遗传调控控制害虫种群提供新方向。鳞翅目昆虫多为雌雄二型,繁殖方式以两性生殖为主,性染色体系统大多为ZW/ZZ系统,雌性为ZW型,雄性为ZZ型。昆虫性别决定是通过级联反应调控的,在鳞翅目昆虫ZW/ZZ系统中,位于W染色体上的性别决定初始信号沉默雄性化关键基因Masculinizer(Masc),然后Doublesex(dsx)基因被雌性特异性剪接,从而调控雌性偏向基因的表达;而雄虫中Masc正常表达,调控dsx进行雄性特异剪接,实现雄性分化。本文对鳞翅目昆虫性别决定初始信号、Masc和dsx的研究现状,以及基于基因编辑技术和性别决定机制在鳞翅目昆虫遗传调控中的应用进行了综述。相关研究为鳞翅目昆虫的性别筛选、不育昆虫释放技术(sterile insect technique,SIT)和释放携带雌性特异显性致死基因昆虫技术(female specific release of insects carrying dominant lethal,fsRIDL)奠定理论基础。展开更多
【目的】探讨东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis Wnt基因家族中WntA编码蛋白序列特征及其在胚胎发育阶段的时空表达谱,为进一步开展LmmWntA的功能研究及挖掘东亚飞蝗其他Wnt基因家族成员奠定基础。【方法】PCR克隆并利用邻接法(nei...【目的】探讨东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis Wnt基因家族中WntA编码蛋白序列特征及其在胚胎发育阶段的时空表达谱,为进一步开展LmmWntA的功能研究及挖掘东亚飞蝗其他Wnt基因家族成员奠定基础。【方法】PCR克隆并利用邻接法(neighbor-joining,NJ)鉴定东亚飞蝗Wnt基因家族基因LmmWntA;通过同源序列多重比对分析LmmWntA氨基酸序列特征;利用整胚原位杂交技术对LmmWntA在东亚飞蝗产卵后(after egg laying,AEL)发育至12,24,35,46,56和65 h以及3,3.5,4,4.5,5,5.5,6.5,8,8.5,9.5和11 d共17个连续胚胎发育阶段进行转录信号筛查。【结果】克隆获得东亚飞蝗LmmWntA(GenBank登录号:MW052768),CDS全长1101 bp,编码336个氨基酸;LmmWtnA与头索动物、昆虫、有爪动物及环节动物WntA蛋白共同聚为WntA亚家族单系群;LmmWntA中段和C端与比对物种WntA蛋白序列保持了较高同源性,仅在N端信号肽区域出现差异,LmmWntA与膜翅目(Hymenoptera)西方蜜蜂Apis mellifera AmWntA蛋白聚为姊妹群,氨基酸序列一致性为59.05%。LmmWntA最先表达在东亚飞蝗35 h AEL胚胎期末端生长区并在该区域持续表达至4 d AEL胚胎期,同时在新生体节每节腹部形成条纹状表达;在46 h AEL胚胎期视叶后半区持续表达至8.5 d AEL胚胎期,该区域未来发育成复眼;在56 h AEL胚胎期脑持续表达至5.5 d AEL胚胎期;在65 h AEL胚胎期每节腹部的条纹状表达信号逐渐转移至腹中线两侧,在触角基部有明显的表达信号;在5.5 d AEL胚胎期表达信号进一步转移至腹神经;从3 d AEL胚胎期开始在腹侧体节远轴端表达,后期转移至上颚、足关节及末端;伴随4.5 d AEL胚胎末端开始内陷形成肛道,LmmWntA在内陷肛道的腹面及前端表达,最多内陷至腹部第7体节;至9.5 d AEL胚胎期时LmmWntA在翅芽盘处表达。【结论】LmmWntA在东亚飞蝗胚胎发育阶段动态表达,推测LmmWntA参与东亚飞蝗胚胎后端体节生长、神经系统(脑和腹神经)、复眼、触角、消化系统后端(肛道)、颚、胸部附肢(足和翅)等重要组织和器官的发生和形成。本研究结果为进一步开展LmmWntA功能缺失研究奠定发育生物学基础。展开更多
文摘【目的】利用P2C可以定向进入卵巢以及Gal4蛋白可与UAS序列稳定结合的特点,在中华按蚊Anopheles sinensis中建立高效的非胚胎期外源DNA投递技术系统。【方法】注射P2C-Gal4-DsRed重组蛋白至吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,通过冰冻切片荧光观察和Western blot检测分析重组蛋白P2C-Gal4-DsRed在卵巢中的投递效率;制备P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白,构建包含12×UAS重复基序的转基因质粒和辅助质粒,通过电泳迁移实验分析重组蛋白P2C-Gal4 DNA BINDING和12×UAS重复基序间的体外结合;分别将体外孵育的P2C-Gal4 DNA BINDING+辅助质粒ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+转基因质粒ITF2-12×UAS afm复合物注射入吸血后20 h时的中华按蚊雌成蚊腹部,于血餐后40 h时提取其卵巢组织DNA,并通过特异性引物PCR扩增和测序分析外源DNA在活体中的投递情况。【结果】100%注射P2C-Gal4-DsRed的中华按蚊雌成蚊卵巢在绿色滤光片下呈现明显的红色荧光,表明P2C-Gal4-DsRed重组蛋白能够被高效地导入雌成蚊卵巢中;P2C-Gal4 DNA BINDING重组蛋白能够与12×UAS重复基序以及含有该重复基序片段的质粒稳定结合;分别有91%和93%的注射了P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF36-12×UAS和P2C-Gal4 DNA BINDING+ITF2-12×UAS afm的雌成蚊卵巢组织中能够检测到外源DNA片段。【结论】在中华按蚊中成功建立了基于P2C卵巢导向肽和Gal4-12×UAS重复基序结合特性的外源DNA投递技术体系;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现质粒等DNA分子在中华按蚊卵巢中的投递,这为进一步简化转基因、过表达及基因敲入等遗传操作奠定了基础。
文摘昆虫性别决定机制复杂多样,研究昆虫性别决定机制既能加强对物种进化关系的理解,也能为通过遗传调控控制害虫种群提供新方向。鳞翅目昆虫多为雌雄二型,繁殖方式以两性生殖为主,性染色体系统大多为ZW/ZZ系统,雌性为ZW型,雄性为ZZ型。昆虫性别决定是通过级联反应调控的,在鳞翅目昆虫ZW/ZZ系统中,位于W染色体上的性别决定初始信号沉默雄性化关键基因Masculinizer(Masc),然后Doublesex(dsx)基因被雌性特异性剪接,从而调控雌性偏向基因的表达;而雄虫中Masc正常表达,调控dsx进行雄性特异剪接,实现雄性分化。本文对鳞翅目昆虫性别决定初始信号、Masc和dsx的研究现状,以及基于基因编辑技术和性别决定机制在鳞翅目昆虫遗传调控中的应用进行了综述。相关研究为鳞翅目昆虫的性别筛选、不育昆虫释放技术(sterile insect technique,SIT)和释放携带雌性特异显性致死基因昆虫技术(female specific release of insects carrying dominant lethal,fsRIDL)奠定理论基础。
文摘【目的】探讨东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis Wnt基因家族中WntA编码蛋白序列特征及其在胚胎发育阶段的时空表达谱,为进一步开展LmmWntA的功能研究及挖掘东亚飞蝗其他Wnt基因家族成员奠定基础。【方法】PCR克隆并利用邻接法(neighbor-joining,NJ)鉴定东亚飞蝗Wnt基因家族基因LmmWntA;通过同源序列多重比对分析LmmWntA氨基酸序列特征;利用整胚原位杂交技术对LmmWntA在东亚飞蝗产卵后(after egg laying,AEL)发育至12,24,35,46,56和65 h以及3,3.5,4,4.5,5,5.5,6.5,8,8.5,9.5和11 d共17个连续胚胎发育阶段进行转录信号筛查。【结果】克隆获得东亚飞蝗LmmWntA(GenBank登录号:MW052768),CDS全长1101 bp,编码336个氨基酸;LmmWtnA与头索动物、昆虫、有爪动物及环节动物WntA蛋白共同聚为WntA亚家族单系群;LmmWntA中段和C端与比对物种WntA蛋白序列保持了较高同源性,仅在N端信号肽区域出现差异,LmmWntA与膜翅目(Hymenoptera)西方蜜蜂Apis mellifera AmWntA蛋白聚为姊妹群,氨基酸序列一致性为59.05%。LmmWntA最先表达在东亚飞蝗35 h AEL胚胎期末端生长区并在该区域持续表达至4 d AEL胚胎期,同时在新生体节每节腹部形成条纹状表达;在46 h AEL胚胎期视叶后半区持续表达至8.5 d AEL胚胎期,该区域未来发育成复眼;在56 h AEL胚胎期脑持续表达至5.5 d AEL胚胎期;在65 h AEL胚胎期每节腹部的条纹状表达信号逐渐转移至腹中线两侧,在触角基部有明显的表达信号;在5.5 d AEL胚胎期表达信号进一步转移至腹神经;从3 d AEL胚胎期开始在腹侧体节远轴端表达,后期转移至上颚、足关节及末端;伴随4.5 d AEL胚胎末端开始内陷形成肛道,LmmWntA在内陷肛道的腹面及前端表达,最多内陷至腹部第7体节;至9.5 d AEL胚胎期时LmmWntA在翅芽盘处表达。【结论】LmmWntA在东亚飞蝗胚胎发育阶段动态表达,推测LmmWntA参与东亚飞蝗胚胎后端体节生长、神经系统(脑和腹神经)、复眼、触角、消化系统后端(肛道)、颚、胸部附肢(足和翅)等重要组织和器官的发生和形成。本研究结果为进一步开展LmmWntA功能缺失研究奠定发育生物学基础。
