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靶向HER2的通用型CAR-T细胞来源的细胞外囊泡的制备及功能鉴定
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作者 蒙若彤 王鹏举 +9 位作者 赵晓娟 郑瑞 梁思辛 张依婷 董昊 韩玉洁 杨安钢 白占涛 阎博 路凡 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期121-128,共8页
目的 利用可持续传代的T淋巴细胞系,制备携带靶向人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外囊泡(EV),并检测其对HER2^(+)肿瘤细胞的杀伤能力。方法 采用分子克隆技术构建重组慢病毒质粒。利用成簇的规律间隔的短回文... 目的 利用可持续传代的T淋巴细胞系,制备携带靶向人表皮生长因子受体2(HER2)蛋白的嵌合抗原受体(CAR)的细胞外囊泡(EV),并检测其对HER2^(+)肿瘤细胞的杀伤能力。方法 采用分子克隆技术构建重组慢病毒质粒。利用成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术和慢病毒感染的方法构建底盘Jurkat细胞。流式细胞术检测底盘Jurkat细胞、嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞和CAR-Jurkat细胞的构建。通过聚乙二醇6000(PEG6000)浓缩方法和细胞挤压方法制备EV;微粒子追踪分析(NTA)和Western blot法鉴定EV。萤光素酶报告基因系统检测细胞和EV对肿瘤细胞的杀伤作用。荧光显微镜观察免疫细胞对EV的吞噬作用。结果 酶切鉴定和基因测序结果表明重组质粒构建成功。流式细胞术结果显示底盘Jurkat细胞、 CAR-T细胞和CAR-Jurkat细胞顺利制备。NTA结果显示制备的EV大小正确。萤光素酶报告基因系统证明CAR-T细胞、 CAR-Jurkat细胞、 CAR-T EV和CAR-Jurkat EV对HER2+肿瘤细胞均具有靶向杀伤能力。荧光显微镜观察表明,提高CD47分子的表达水平能够减弱免疫细胞对通用型CAR-Jurkat EV的吞噬作用。结论 通用型CAR-T细胞来源EV能够靶向杀伤HER2+肿瘤细胞。 展开更多
关键词 嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞 同种异体 底盘细胞 细胞外囊泡
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应用CRISPR/Cas9技术构建Raji-Luc CD19 KO淋巴瘤细胞系
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作者 刘静静 刘秀盈 +3 位作者 冯娅茹 冯义超 于梦圆 王建勋 《现代检验医学杂志》 CAS 2024年第1期10-15,99,共7页
目的应用CRISPR/cas9技术构建敲除CD19的Raji-Luc淋巴瘤细胞,并对其免疫逃逸能力进行初步验证。方法构建PB-CRISPR-CD19小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)质粒,筛选最优的sgRNA序列,用pCAG-PBase转座酶、PB-CD19 sgRNA及PB-CRISPR-Cas9... 目的应用CRISPR/cas9技术构建敲除CD19的Raji-Luc淋巴瘤细胞,并对其免疫逃逸能力进行初步验证。方法构建PB-CRISPR-CD19小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)质粒,筛选最优的sgRNA序列,用pCAG-PBase转座酶、PB-CD19 sgRNA及PB-CRISPR-Cas9共同电转染Raji-Luc细胞,采用流式分选和极限稀释法筛选得到稳定敲除的单克隆细胞株。经过基因序列检测对敲除效果进行验证;酶标仪检测细胞系表面荧光素酶的表达情况;以实验室前期构建的CD19 CAR-T和CD38 CAR-T作为效应细胞,用荧光素酶化学发光法验证Raji-Luc CD19 KO细胞株的免疫逃逸能力。结果电转染制备的Raji-Luc CD19 KO细胞转染效率较高,筛选所得两组单克隆细胞敲除效率均达到99%以上,与原始Raji-Luc细胞的荧光素酶表达无显著差异,且不能激活CD19 CAR-T细胞对其进行杀伤。结论成功构建了Raji-Luc CD19 KO淋巴瘤细胞系。 展开更多
关键词 嵌合抗原受体-T细胞 白细胞分化抗原19 KO 电转染 淋巴瘤 Raji-Luc细胞
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HMGN1激活TLR4/MyD88/NF-κB p65/IKK-β信号通路诱导小鼠BV2小胶质细胞活化上调其促炎介质表达
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作者 毛燕 俞佳丽 +3 位作者 袁静 达静静 余福勋 查艳 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期135-141,共7页
目的 探究高迁移率族核小体结合蛋白1(HMGN1)对小鼠BV2细胞炎症反应的影响并探究其可能的机制。方法使用(0、 100、 200、 500、 1000、 2000)ng/mL的重组HMGN1孵育BV2细胞6 h。用显微镜观察细胞形态变化,实时定量PCR检测细胞中肿瘤坏... 目的 探究高迁移率族核小体结合蛋白1(HMGN1)对小鼠BV2细胞炎症反应的影响并探究其可能的机制。方法使用(0、 100、 200、 500、 1000、 2000)ng/mL的重组HMGN1孵育BV2细胞6 h。用显微镜观察细胞形态变化,实时定量PCR检测细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、 IL-1β、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1) mRNA水平。随后把小胶质细胞随机分成对照组、模型组、抑制剂组和拮抗剂组。模型组用500 ng/mL的HMGN1处理BV2细胞,拮抗剂组在模型组的基础上加入瑞沙托维(resatorvid)/TAK-242进行干预,使用实时定量PCR和免疫荧光细胞化学染色检测细胞中的M1/M2型标志物的表达情况,Western blot法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、 Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核因子κB p65(NF-κB p65)和NF-κB抑制物激酶β(IKK-β)的蛋白表达。结果 HMGN1处理后,BV2细胞形态发生明显变化,呈阿米巴样;与0 ng/mL HMGN1组相比,TNF-α、 IL-6、 IL-1β、 MCP-1的mRNA水平随HMGN1剂量的增加而升高;M1型标志物iNOS的mRNA水平随HMGN1剂量的增加而升高,M2型标志物CD206的水平随HMGN1剂量的升高而降低。与模型组相比,拮抗剂组M1型标志物iNOS的mRNA水平显著降低,M2型标志物CD206的水平显著升高。免疫荧光细胞化学染色结果也显示MI型标志物iNOS在拮抗剂组中的表达降低。Western blot的结果提示,拮抗剂组iNOS、 TLR4、 MyD88、 NF-κB p65和IKK-β的蛋白表达显著降低。结论 HMGN1可能通过激活TLR4/MyD88/NF-κB p65/IKK-β信号通路诱导BV2小胶质细胞活化来上调其促炎介质的水平。 展开更多
关键词 高迁移率族核小体结合蛋白1(HMGN1) BV2小胶质细胞 下丘脑 炎症 Toll样受体4(TLR4)
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过表达miR-134b抑制CD133^+ U87胶质瘤干细胞增殖及侵袭 被引量:3
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作者 刘义锋 张保朝 +6 位作者 温昌明 闻公灵 周国平 张敬伟 贺海发 汪宁 李巍 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期637-642,共6页
目的探讨微小RNA-134b(miR-134b)在胶质瘤干细胞(GSC)中的作用及相关机制。方法实时定量PCR检测U87胶质瘤细胞系分离出的CD133^+ GSC和CD133^- GSC中miR-134b的表达量;包装慢病毒,构建过表达miR-134b的GSC,实时定量PCR检测其miR-134b、C... 目的探讨微小RNA-134b(miR-134b)在胶质瘤干细胞(GSC)中的作用及相关机制。方法实时定量PCR检测U87胶质瘤细胞系分离出的CD133^+ GSC和CD133^- GSC中miR-134b的表达量;包装慢病毒,构建过表达miR-134b的GSC,实时定量PCR检测其miR-134b、CD133、神经干细胞蛋白(nestin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9和MMP-12 mRNA表达水平;Western blot法检测过表达miR-134b的GSC中Notch2、MMP-2、MMP-9和MMP-12蛋白表达;Transwell^(TM)侵袭实验检测过表达miR-134b对GSC侵袭能力的影响;建立U87细胞裸鼠成瘤模型,皮下注射过表达miR-134b(实验组)及空载体(对照组)的CD133^+ GSC,定期测量肿瘤大小,70 d后处死裸鼠,测定肿瘤质量,以探讨过表达miR-134b对在体肿瘤生长的影响。结果实时定量PCR检测结果表明,与CD133^- GSC相比,CD133^+ GSC中miR-134b表达显著下调;通过慢病毒包装的方法成功构建过表达miR-134b的GSC,其miR-134b的表达显著高于空载体对照细胞,而MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表达无显著变化,而MMP-12的mRNA及蛋白表达均显著下降;Transwell^(TM)侵袭实验结果表明,与对照组相比,过表达miR-134b抑制CD133^+ GSC的侵袭能力;实验组裸鼠体内肿瘤体积显著低于对照组,与对照组相比,过表达miR-134b的实验组肿瘤质量也降低了42%。结论过表达miR-134b抑制CD133^+ GSC的生长和侵袭。 展开更多
关键词 微小RNA-134b(miR-134b) 基质金属蛋白酶(MMP) U87胶质瘤
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基于衍生化3-氨基-2-恶唑烷酮的夹心酶联免疫分析
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作者 张世伟 吴会玲 +6 位作者 周迎春 王炳志 杨星星 杜业刚 汤璐 冯荣虎 郭继平 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第6期271-276,共6页
建立一种3-氨基-2-恶唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone,AOZ)夹心免疫检测方法。通过1,6-己二醇连接2-硝基-4-羧基苯甲醛和生物素合成针对AOZ的新型衍生试剂。在样品前处理时加入衍生试剂可对AOZ进行衍生,衍生产率为89%。在酶标板上包被抗... 建立一种3-氨基-2-恶唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone,AOZ)夹心免疫检测方法。通过1,6-己二醇连接2-硝基-4-羧基苯甲醛和生物素合成针对AOZ的新型衍生试剂。在样品前处理时加入衍生试剂可对AOZ进行衍生,衍生产率为89%。在酶标板上包被抗AOZ单克隆抗体并以辣根过氧化物酶标记的亲和素或抗生物素抗体作为第二结合物可实现AOZ的夹心酶联免疫吸附检测(enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)。从实际应用的角度,得到双抗夹心和抗体-亲和素夹心模式下两个表位的极限距离,分别为12Å和13Å,理想距离分别为16Å和17Å。在双抗夹心和抗体-亲和素夹心模式下的检出限分别达到1.8 pg/mL和0.8 pg/mL(以AOZ质量浓度计),相对于竞争ELISA,其灵敏度最高提高了25倍。平均回收率为73%~85%,平均相对标准偏差为9.0%。 展开更多
关键词 3-氨基-2-恶唑烷酮 夹心酶联免疫分析 表位间隔距离 辣根过氧化物酶标记亲和素
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miR-141-3p通过促进波形蛋白表达增强CNE-2人鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移 被引量:1
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作者 孙哲 周兰柱 +1 位作者 吴俊 王文忠 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期63-69,共7页
目的探讨微小RNA 141-3p(miR-141-3p)能否通过调节波形蛋白(vimentin)促进CNE-2人鼻咽癌(NPC)细胞的迁移。方法实时定量PCR检测NPC组织和癌旁组织miR-141-3p表达,免疫组织化学染色法和Western blot法检测vimentin的表达水平。采用实时定... 目的探讨微小RNA 141-3p(miR-141-3p)能否通过调节波形蛋白(vimentin)促进CNE-2人鼻咽癌(NPC)细胞的迁移。方法实时定量PCR检测NPC组织和癌旁组织miR-141-3p表达,免疫组织化学染色法和Western blot法检测vimentin的表达水平。采用实时定量PCR和Western blot法分别筛选5-8F、CNE-2、HNE1人NPC细胞中miR-141-3p相对表达量最高的细胞株,实时定量PCR和Western blot法共同验证miR-141-3p与vimentin表达关系;采用小干涉RNA(si-miR-141-3p)下调CNE-2细胞miR-141-3p、噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率、Transwell^(TM)小室法检测细胞侵袭和迁移、Western blot法检测vimentin表达量。结果与癌旁组织相比,NPC组织中miR-141-3p和vimentin表达量均显著增加,与NP69细胞相比,miR-141-3p和vimentin在CNE-2细胞中表达均显著增加;下调CNE-2细胞中miR-141-3p后,细胞侵袭和迁移能力均下降,细胞增殖能力显著降低,vimentin蛋白表达量显著降低。结论miR-141-3p能够通过促进vimentin表达增强CNE-2细胞的增殖和迁移。 展开更多
关键词 鼻咽癌 miR-141-3p 上皮间质转化(EMT) VIMENTIN 细胞侵袭 细胞迁移
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蒙药珍宝丸通过激活SIRT1/NF-κB通路抑制氧糖剥夺/复氧小鼠海马神经细胞炎症和凋亡
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作者 包春生 乌云苏热古格 高玉峰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期1003-1009,共7页
目的观察蒙药珍宝丸即额尔敦-乌日勒(EU)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)的HT22小鼠海马神经细胞凋亡的影响,并探究其潜在机制。方法采用三气培养箱和无糖无氧培养基构建OGD/R损伤HT22细胞模型;(10、20、40)μg/mL EU处理OGD/R细胞,筛选最适剂... 目的观察蒙药珍宝丸即额尔敦-乌日勒(EU)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)的HT22小鼠海马神经细胞凋亡的影响,并探究其潜在机制。方法采用三气培养箱和无糖无氧培养基构建OGD/R损伤HT22细胞模型;(10、20、40)μg/mL EU处理OGD/R细胞,筛选最适剂量20μg/mL。沉默信号调节因子1(SIRT1)抑制剂尼克酰胺(NAM)联合EU处理OGD/R损伤细胞设为EU联合NAM组,二甲基亚砜(DMSO)联合EU处理的OGD/R损伤细胞设为EU联合DMSO组;CCK-8法检测细胞活性,ELISA检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率;实时荧光定量PCR检测HT22细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、IL-1β的mRNA表达,流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)、SIRT1、核因子κB抑制物α(IκBα)、磷酸化的核因子κB(p-NF-κB)的蛋白表达。结果与对照组相比,OGD/R组HT22细胞活性显著降低,LDH漏出率显著升高,而(20、40)μg/mL EU处理后,细胞活性显著升高,LDH漏出率也明显降低,20μg/mL的EU为最适剂量。OGD/R组细胞TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达及凋亡率均显著高于对照组,SIRT1、IκBα、Bcl2蛋白显著低于对照组,p-NF-κB、BAX蛋白显著高于对照组,EU明显抑制OGD/R引起的HT22细胞TNF-α、IL-6、IL-1β分泌和凋亡。结论EU显著减轻OGD/R小鼠的炎性反应和海马神经细胞凋亡,这与激活SIRT1/NF-κB信号通路有关。 展开更多
关键词 蒙药珍宝丸(额尔敦-乌日勒) 海马神经细胞 沉默信号调节因子1(SIRT1) 核因子κB(NF-κB) 炎症 凋亡
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Ultrasensitive quantification of trace amines based on N-phosphorylation labeling chip 2D LC-QQQ/MS 被引量:1
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作者 Xiqing Bian Yida Zhang +5 位作者 Na Li Menglin Shi Xiaolin Chen Hui-Lu Zhang Jie Liu Jian-Lin Wu 《Journal of Pharmaceutical Analysis》 SCIE CAS CSCD 2023年第3期315-322,共8页
Trace amines(TAs)are metabolically related to catecholamine and associated with cancer and neurological disorders.Comprehensive measurement of TAs is essential for understanding pathological processes and providing pr... Trace amines(TAs)are metabolically related to catecholamine and associated with cancer and neurological disorders.Comprehensive measurement of TAs is essential for understanding pathological processes and providing proper drug intervention.However,the trace amounts and chemical instability of TAs challenge quantification.Here,diisopropyl phosphite coupled with chip two-dimensional(2D)liquid chromatography tandem triple-quadrupole mass spectrometry(LC-QQQ/MS)was developed to simultaneously determine TAs and associated metabolites.The results showed that the sensitivities of TAs increased up to 5520 times compared with those using nonderivatized LC-QQQ/MS.This sensitive method was utilized to investigate their alterations in hepatoma cells after treatment with sorafenib.The significantly altered TAs and associated metabolites suggested that phenylalanine and tyrosine metabolic pathways were related to sorafenib treatment in Hep3B cells.This sensitive method has great potential to elucidate the mechanism and diagnose diseases considering that an increasing number of physiological functions of TAs have been discovered in recent decades. 展开更多
关键词 Chip 2D LC-QQQ/MS Trace amines DERIVATIZATION HEPATOMA
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Recent progress in aptamer-based microfluidics for the detection of circulating tumor cells and extracellular vesicles
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作者 Duanping Sun Ying Ma +3 位作者 Maoqiang Wu Zuanguang Chen Luyong Zhang Jing Lu 《Journal of Pharmaceutical Analysis》 SCIE CAS CSCD 2023年第4期340-354,共15页
Liquid biopsy is a technology that exhibits potential to detect cancer early,monitor therapies,and predict cancer prognosis due to its unique characteristics,including noninvasive sampling and real-time analysis.Circu... Liquid biopsy is a technology that exhibits potential to detect cancer early,monitor therapies,and predict cancer prognosis due to its unique characteristics,including noninvasive sampling and real-time analysis.Circulating tumor cells(CTCs)and extracellular vesicles(EVs)are two important components of circulating targets,carrying substantial disease-related molecular information and playing a key role in liquid biopsy.Aptamers are single-stranded oligonucleotides with superior affinity and specificity,and they can bind to targets by folding into unique tertiary structures.Aptamer-based microfluidic platforms offer new ways to enhance the purity and capture efficiency of CTCs and EVs by combining the advantages of microfluidic chips as isolation platforms and aptamers as recognition tools.In this review,we first briefly introduce some new strategies for aptamer discovery based on traditional and aptamer-based microfluidic approaches.Then,we subsequently summarize the progress of aptamer-based microfluidics for CTC and EV detection.Finally,we offer an outlook on the future directional challenges of aptamer-based microfluidics for circulating targets in clinical applications. 展开更多
关键词 APTAMER Microfluidic Circulating tumor cells Extracellular vesicles BIOANALYSIS
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D816V突变型KIT特异性诱导COS-1非洲绿猴肾细胞核不均一核糖核蛋白 L(HNRNPL)和HNRNPK磷酸化
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作者 张良颖 张少婷 +4 位作者 范朝阳 蒋宗英 李淑璟 刘安步 孙建民 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期138-143,共6页
目的探究Ⅲ类酪氨酸激酶受体KIT D816V突变对核不均一核糖核蛋白L(HNRNPL)和HNRNPK的调控作用。方法在COS-1非洲绿猴肾细胞表达野生型KIT或KIT D816V,或与HNRNPL或HNRNPK共表达,用免疫沉淀法和Western blot法检测KIT活化及HNRNPL、HNRNP... 目的探究Ⅲ类酪氨酸激酶受体KIT D816V突变对核不均一核糖核蛋白L(HNRNPL)和HNRNPK的调控作用。方法在COS-1非洲绿猴肾细胞表达野生型KIT或KIT D816V,或与HNRNPL或HNRNPK共表达,用免疫沉淀法和Western blot法检测KIT活化及HNRNPL、HNRNPK的磷酸化,通过激光共聚焦显微镜检测KIT、HNRNPL、HNRNPK在COS-1细胞中的定位。结果野生型KIT需要其配基干细胞因子(SCF)的刺激发生活化,而KIT D816V无需SCF刺激即可发生自活化。此外,KIT D816V可诱导HNRNPL和HNRNPK发生磷酸化,而野生型KIT无此功能。HNRNPL和HNRNPK在细胞核表达,野生型KIT在细胞膜和细胞质表达,而KIT D816V主要表达于细胞质。结论野生型KIT活化需要其配体SCF参与,而KIT D816V无需SCF刺激即可发生自活化,并能特异性诱导HNRNPL和HNRNPK磷酸化。 展开更多
关键词 KIT D816V 核不均一核糖核蛋白L(HNRNPL) 核不均一核糖核蛋白K(HNRNPK)
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2022年《免疫介导肾病患者接种COVID-19疫苗前景:ERA-IWG和EUVAS的共识声明》解读
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作者 唐乐丽 叶桂花 《河北医科大学学报》 CAS 2023年第6期621-628,共8页
免疫介导肾病患者感染新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)的风险增加。大多数免疫介导肾病患者接种COVID-19疫苗后的免疫应答水平较低,这与免疫抑制状态或者基础疾病引起的合并症和并发症有关。在使用利妥昔单抗、吗... 免疫介导肾病患者感染新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)的风险增加。大多数免疫介导肾病患者接种COVID-19疫苗后的免疫应答水平较低,这与免疫抑制状态或者基础疾病引起的合并症和并发症有关。在使用利妥昔单抗、吗替麦考酚酯(mycophenolate mofetil,MMF)、高剂量的糖皮质激素和其他免疫抑制剂(如环磷酰胺)的患者中,疫苗引起的体液免疫反应(通过抗体测量)会减弱或缺失。新的COVID-19变异株的出现和疫苗有效性的减弱凸显了加强剂的价值,以及需要开发针对变异株的疫苗。COVID-19疫苗总体安全性良好,接种后新发或复发性免疫介导肾病的风险非常低。即使发生,包括使用免疫抑制剂的患者,肾病的标准治疗仍然有效。欧洲肾脏协会免疫肾病工作组(Immunonephrology Working Group of the European Renal Association,ERA-IWG)和欧洲血管炎学会(European Vasculitis Society,EUVAS)推荐免疫介导肾病患者应遵循当地疫苗接种指南进行接种,并且可以根据接种后的抗体水平决定是否需要接种额外的加强剂。 展开更多
关键词 IgA肾病 免疫学 免疫抑制剂 利妥昔单抗 血管炎
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miR-18a通过阻断TLR4/NF-κB通路减轻小鼠过敏性鼻炎的炎症和组织损伤 被引量:1
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作者 杨君 李清韵 +1 位作者 王露 谢慧 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期680-685,共6页
目的探究微小RNA-18a(miR-18a)在小鼠过敏性鼻炎发病过程中的作用。方法22只BALB/c小鼠被随机分为空白组、模型组及miR-18a组。模型组和miR-18a组小鼠采用腹腔注射卵清蛋白(OVA)混悬液的方法制备过敏性鼻炎模型,miR-18a组小鼠同时给予... 目的探究微小RNA-18a(miR-18a)在小鼠过敏性鼻炎发病过程中的作用。方法22只BALB/c小鼠被随机分为空白组、模型组及miR-18a组。模型组和miR-18a组小鼠采用腹腔注射卵清蛋白(OVA)混悬液的方法制备过敏性鼻炎模型,miR-18a组小鼠同时给予过表达miR-18a的慢病毒载体质粒。采用行为学评分及HE染色评价各组小鼠过敏症状及形态学变化,ELISA检测血浆白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,免疫荧光组织化学染色检测小鼠鼻黏膜组织CD45^(+)细胞浸润情况,流式细胞术检测鼻腔灌洗液CD45^(+)细胞数量,荧光定量PCR检测鼻黏膜组织IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平,Western blot法检测鼻黏膜组织Toll样受体4(TLR4)、核因子κB p65(NF-κB p65)、NF-κB抑制物α(IκBα)、磷酸化的IκBα(p-IκBα)的蛋白表达。结果与空白组相比,模型组小鼠血浆IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著增高,鼻黏膜组织及鼻腔灌洗液CD45^(+)细胞数量增多,鼻黏膜组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平及TLR4、NF-κB p65、p-IκBα表达水平升高;与模型组相比,miR-18a组小鼠血浆中IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低,鼻黏膜组织及鼻腔灌洗液CD45^(+)细胞数量减少,鼻黏膜组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平及TLR4、NF-κB p65、p-IκBα表达水平降低。结论miR-18a能够通过阻断TLR4/NF-κB通路抑制小鼠过敏性鼻炎的发生和发展。 展开更多
关键词 miR-18a 过敏性鼻炎 炎症因子 Toll样受体4(TLR4) 核因子κB抑制物α(IκBα)
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病毒性心肌炎血清外泌体来源的miR-320通过靶向Pik3r1抑制AKT/mTOR通路促进小鼠心肌细胞凋亡
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作者 张欣 李雪琴 +3 位作者 朱良宇 殷国泉 张苑 吕坤 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期516-525,共10页
目的探讨病毒性心肌炎血清外泌体miR-320对心肌细胞凋亡的影响及机制。方法使用柯萨奇病毒B3(CVB3)腹腔注射,建立病毒性心肌炎小鼠模型;采用血清外泌体抽提试剂盒提取血清外泌体,与心肌细胞共培养,激光共聚焦显微镜观察心肌细胞摄取外... 目的探讨病毒性心肌炎血清外泌体miR-320对心肌细胞凋亡的影响及机制。方法使用柯萨奇病毒B3(CVB3)腹腔注射,建立病毒性心肌炎小鼠模型;采用血清外泌体抽提试剂盒提取血清外泌体,与心肌细胞共培养,激光共聚焦显微镜观察心肌细胞摄取外泌体情况;使用miR-320抑制剂或模拟物转染心肌细胞,实时荧光定量PCR检测miR-320表达水平;采用流式细胞术检测心肌细胞凋亡率,Western blot法检测B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)和Bcl2相关X蛋白(BAX)表达水平;生物信息学预测miR-320靶基因并进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析;荧光素酶报告基因检测miR-320与其靶基因磷脂酰肌醇3激酶调节亚基1(Pik3r1)的作用关系;Western blot法检测miR-320对蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AKT/mTOR)通路蛋白的影响。结果病毒性心肌炎血清外泌体促进心肌细胞凋亡并上调BAX水平,同时降低Bcl2水平;病毒性心肌炎小鼠心肌组织中miR-320显著上调,且miR-320成熟体和miR-320前体pri-miR-320表达在心肌细胞均明显上调;病毒性心肌炎血清外泌体处理的心肌细胞中miR-320水平显著上调,而转染miR-320抑制剂逆转了外泌体引起的miR-320上调及凋亡率升高;Pik3r1是miR-320的靶基因,其过表达逆转miR-320上调导致的心肌细胞凋亡;miR-320过表达抑制AKT/mTOR通路激活。结论病毒性心肌炎血清外泌体miR-320通过靶向Pik3r1抑制AKT/mTOR通路促进小鼠心肌细胞凋亡。 展开更多
关键词 病毒性心肌炎 外泌体 磷脂酰肌醇3激酶调节亚基1(Pik3r1) miR-320 心肌细胞 凋亡
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稳定表达人细胞色素P450氧化还原酶(POR)的Flp-In^(TM) CHO细胞系的建立
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作者 刘欢 刘亭 +6 位作者 陆定艳 孙莉 何俊奇 李勇军 王永林 孙佳 席晓岚 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期103-108,共6页
目的建立稳定表达人细胞色素P450氧化还原酶(POR)的Flp-In^(TM) CHO细胞系,为进一步建立稳定双表达人POR与人细胞色素P450(CYP)的细胞系奠定基础。方法构建POR重组慢病毒并感染Flp-In^(TM) CHO细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,挑... 目的建立稳定表达人细胞色素P450氧化还原酶(POR)的Flp-In^(TM) CHO细胞系,为进一步建立稳定双表达人POR与人细胞色素P450(CYP)的细胞系奠定基础。方法构建POR重组慢病毒并感染Flp-In^(TM) CHO细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,挑选转染细胞进行嘌呤霉素筛选和单克隆培养,以获得稳定转染细胞株。利用丝裂霉素C(MMC)细胞毒实验、实时荧光定量PCR和Western blot法检测细胞POR的表达,获得稳定表达POR的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞株。构建稳定双表达POR和CYP2C19的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞(Flp-In^(TM) CHO-POR-2C19)和单表达CYP2C19的Flp-In^(TM) CHO细胞(Flp-In^(TM) CHO-2C19),并用环磷酰胺(CPA)测定CYP2C19酶活性。结果与感染阴性对照病毒的Flp-In^(TM) CHO细胞相比,感染POR重组慢病毒的Flp-In^(TM) CHO细胞MMC代谢活性升高,POR mRNA和蛋白的表达水平增加,说明获得了可稳定表达POR的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞。与Flp-In^(TM) CHO细胞相比,Flp-In^(TM) CHO-2C19的CPA代谢活性无显著差异,而Flp-In^(TM) CHO-POR-2C19的CPA代谢活性增加且明显高于Flp-In^(TM) CHO-2C19细胞。结论成功建立了稳定表达POR且可进一步用于CYP转基因细胞构建的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞系。 展开更多
关键词 人细胞色素P450氧化还原酶(POR) 慢病毒 Flp-In^(TM)CHO-POR细胞系
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过表达microRNA-7通过下调CGG结合蛋白1的表达抑制人肺癌细胞生长 被引量:16
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作者 胡燕 廖珍媛 +7 位作者 陈超 秦娜琳 郑静 田丹 李永菊 朱顺飞 罗军敏 徐林 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期125-130,共6页
目的探讨过表达microRNA-7(miR-7)对人肺癌细胞体内外生长的作用和可能机制。方法利用真核表达载体pcDNA3.1(-)-pri-miR-7(p-miR-7),体外瞬时转染95D人肺癌细胞,MTT法和克隆形成实验检测95D细胞的增殖变化;免疫荧光技术检测95D细胞Ki-67... 目的探讨过表达microRNA-7(miR-7)对人肺癌细胞体内外生长的作用和可能机制。方法利用真核表达载体pcDNA3.1(-)-pri-miR-7(p-miR-7),体外瞬时转染95D人肺癌细胞,MTT法和克隆形成实验检测95D细胞的增殖变化;免疫荧光技术检测95D细胞Ki-67和CGG结合蛋白(CGGBP1)的表达;建立人肺癌裸鼠肿瘤模型,肿瘤局部注射p-miR-7真核表达载体,测量肿瘤大小并观察小鼠生存时间;实时PCR检测肿瘤组织中miR-7表达水平;免疫组织化学技术检测组织中Ki-67和CGGBP1蛋白的表达。结果过表达miR-7可明显抑制肺癌细胞的体外增殖(P<0.05),Ki-67和CGGBP1的表达显著减少(P<0.05);体内实验结果显示,局部注射p-miR-7组中miR-7表达水平明显增加,同时荷瘤裸鼠的肿瘤生长缓慢,生存时间明显延长(P<0.05)。肿瘤组织中Ki-67和CGGBP1蛋白的表达量均显著减少(P<0.05)。结论过表达miR-7可显著抑制人肺癌细胞的体内外生长,可能与其下调肿瘤生长相关蛋白CGGBP1的表达有关。 展开更多
关键词 肺癌 miR-7 人肺癌95D细胞 细胞生长 CGG结合蛋白1
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miR-204通过下调Bcl-2和Sirt1表达抑制肝癌细胞生长 被引量:16
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作者 李扩 许秋然 +2 位作者 刘欣 刘青光 王茂德 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期168-172,共5页
目的探讨微小RNA 204(miR-204)在肝细胞癌中的表达、临床意义及可能分子机制。方法收集手术切除的60例肝细胞癌及对应癌旁肝组织,实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-204在肝癌及癌旁组织中的表达,免疫组织化学染色检测miR-204下游潜在靶点Bc... 目的探讨微小RNA 204(miR-204)在肝细胞癌中的表达、临床意义及可能分子机制。方法收集手术切除的60例肝细胞癌及对应癌旁肝组织,实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-204在肝癌及癌旁组织中的表达,免疫组织化学染色检测miR-204下游潜在靶点Bcl-2与组蛋白脱乙酰酶1(Sirt1)的表达;用人工合成的miR-204模拟物转染人SMMC-7721肝癌细胞,MTT法及流式细胞术检测SMMC-7721细胞的增殖、凋亡的情况,qRT-PCR、Western blot法分别检测Bcl-2与Sirt1的mRNA和蛋白表达。结果 miR-204在肝癌组织中表达水平显著低于对应癌旁组织;肝癌组织中miR-204低表达与肿瘤大小、肿瘤个数、肿瘤TNM分期显著相关;miR-204低表达组Bcl-2与Sirt1蛋白表达显著高于miR-204高表达组,相关性分析结果显示肝癌组织中miR-204与Bcl-2、Sirt1蛋白表达呈显著负相关;miR-204可显著抑制SMMC-7721细胞的增殖并促进其凋亡,并下调Bcl-2与Sirt1的mRNA与蛋白表达水平。结论 miR-204在肝癌组织中表达下调并与肝癌恶性临床病理特征有关,miR-204抑制肝癌细胞增殖、促进其凋亡的作用可能与下调Bcl-2和Sirt1表达有关。 展开更多
关键词 miR-204 肝细胞癌 凋亡增殖 BCL-2 SIRT1
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miR-101通过抑制DNA甲基转移酶3a抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移 被引量:13
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作者 刘健 庞亚梅 +5 位作者 王黄震 李艳波 孙欣 徐菲 任宏 刘大鹏 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期299-303,共5页
目的研究miR-101对乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响,并分析miR-101影响乳腺癌细胞生物学行为的可能机制。方法采用实时荧光定量PCR检测miR-101和DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)在乳腺癌组织和相对应的正常乳腺组织,正常乳腺细胞以及多种乳腺... 目的研究miR-101对乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响,并分析miR-101影响乳腺癌细胞生物学行为的可能机制。方法采用实时荧光定量PCR检测miR-101和DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)在乳腺癌组织和相对应的正常乳腺组织,正常乳腺细胞以及多种乳腺癌细胞系中的表达水平,应用慢病毒介导感染的方法分别将miR-101序列及shRNA-DNMT3a转至MDAMB-231人乳腺癌细胞,通过Western blot法检测DNMT3a以及上皮钙黏素(E-cadherin)的表达,分析miR-101影响乳腺癌细胞生物学行为的可能机制。通过MTT法检测乳腺癌细胞的增殖能力,划痕实验检测乳腺癌细胞的迁移能力。结果miR-101在MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-361、HCC70乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中表达低于正常乳腺组织及MCF-10A乳腺细胞系,而DNMT3a表达则升高。Western blot实验结果显示过表达miR-101的MDA-MB-231细胞中,DNMT3a的表达明显下降,而E-cadherin的表达升高;应用shRNA-DNMT3a抑制DNMT3a表达后,E-cadherin的表达也明显升高,证实miR-101可能通过抑制DNMT3a而发挥作用。体外实验显示过表达miR-101可明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖和迁移能力。结论miR-101抑制乳腺癌细胞增殖和迁移能力可能是通过抑制DNMT3a进而恢复E-cadherin表达来实现。 展开更多
关键词 乳腺癌 miR-101 DNMT3a 上皮钙黏素 增殖 迁移
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非小细胞肺癌原发灶与转移淋巴结中MDR-1、RRM-1、EGFR、ERCC-1的表达差异 被引量:11
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作者 郭楠楠 李珊珊 +4 位作者 张文 于长海 王宏伟 张宜明 俞建琦 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期870-873,共4页
目的研究非小细胞肺癌(NSCLC)原发灶和转移淋巴结中多药耐药蛋白(MDR-1)、核糖核苷酸还原酶M1(RRM-1)、表皮生长因子受体(EGFR)、错配切除修复蛋白1(ERCC-1)表达的差异,并分析这些表达差异性与临床病理类型的关系。方法采用免疫组织化... 目的研究非小细胞肺癌(NSCLC)原发灶和转移淋巴结中多药耐药蛋白(MDR-1)、核糖核苷酸还原酶M1(RRM-1)、表皮生长因子受体(EGFR)、错配切除修复蛋白1(ERCC-1)表达的差异,并分析这些表达差异性与临床病理类型的关系。方法采用免疫组织化学染色观察46例NSCLC原发灶及转移淋巴结中MDR-1、RRM-1、EGFR、ERCC-1蛋白的表达情况,用Wilcoxon秩和检验来比较原发灶和淋巴结转移灶表达是否存在差异,用Fisher检验分析差异性是否与病理类型相关。结果 46例各种病理类型的NSCLC,原发病灶与转移淋巴结均存在MDR-1、RRM-1、EGFR、ERCC-1表达,其中ECRR-1的表达差异在腺癌中具有统计学意义(P=0.026),而MDR-1,RRM-1,EGFR的差异性在各病理类型无统计学意义(P>0.05)。结论 MDR-1、RRM-1、EGFR、ERCC-1在NSCLC的原发病灶和转移淋巴结中均表达,但只有ERCC-1在肺腺癌原发灶与转移淋巴结的表达具有明显差异。 展开更多
关键词 非小细胞肺癌 原发肿瘤 转移淋巴结 多药耐药蛋白 核糖核苷酸还原酶M1 表皮生长因子受体 剪切修复交叉互补基因1
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急性胰腺炎患者循环miR-29a水平升高且与疾病严重程度及预后差正相关 被引量:10
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作者 高明 卞尔保 +4 位作者 李贺 葛魏巍 尹纯林 汪海平 孙远松 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期931-936,共6页
目的明确循环miR-29a在急性胰腺炎(AP)的诊断与监控预后中的应用价值。方法募集轻度急性胰腺炎(MAP30例、中度重症胰腺炎与重度急性胰腺炎(M-SAP)共30例,30例健康成人为对照组。比较一般临床指标,采用实时定量PCR检测外周血miR-29a水平... 目的明确循环miR-29a在急性胰腺炎(AP)的诊断与监控预后中的应用价值。方法募集轻度急性胰腺炎(MAP30例、中度重症胰腺炎与重度急性胰腺炎(M-SAP)共30例,30例健康成人为对照组。比较一般临床指标,采用实时定量PCR检测外周血miR-29a水平并分析与临床评分的相关性。受试者工作特征(ROC)曲线评估miR-29a对AP的诊断价值。以脱氧胆酸(DCA)处理AR42J细胞建立AP细胞模型,Western blot法检测miR-29a及胱天蛋白酶3(caspase-3)表达量,采用慢病毒载体转入miR-29a模拟物或抑制物,Western blot法检测miR-29a及DCA处理后caspase-3的蛋白水平。结果 MAP组与M-SAP组急性期循环miR-29a相对表达量显著升高且M-SAP组高于MAP组,同组内恢复期miR-29a表达量低于急性期,且miR-29a表达量与Ranson评分及APACHEⅡ评分呈正相关。miR-29a用以诊断MAP的受试者工作特征曲线下面积(AUC)为0. 961 (95%CI:0. 921~1. 002),截断点(cut-off)值为1. 460;用以诊断M-SAP的AUC为0. 972 (95%CI:0. 939~1. 004),cut-off值为1. 340。AP细胞模型中,miR-29a与caspase-3水平升高;与空载体对照组相比,过表达miR-29a后caspase-3表达量升高,抑制miR-29a后则caspase-3水平降低。结论 MAP与M-SAP患者循环miR-29a水平明显升高,miR-29a高表达可能与胰腺腺泡细胞凋亡有关,该指标对于AP的诊断与预后监测具有较高的应用价值。 展开更多
关键词 急性胰腺炎 miR-29a 生物学标志物 细胞凋亡
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miR-144通过靶向Atg4a调控卡介苗和雷帕霉素诱导的RAW264.7细胞自噬 被引量:9
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作者 周林林 郭乐 +3 位作者 汤建中 张爱君 刘学英 徐广贤 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期163-167,共5页
目的研究卡介苗(BCG)对RAW264.7细胞中与细胞自噬相关的miRNA(miR-21、miR-181a、miR-155和miR-144)表达的影响,并以miR-144为研究对象,验证miR-144对自噬相关基因Atg4a的靶向调控关系,探究其在结核分枝杆菌感染宿主细胞过程中调控细胞... 目的研究卡介苗(BCG)对RAW264.7细胞中与细胞自噬相关的miRNA(miR-21、miR-181a、miR-155和miR-144)表达的影响,并以miR-144为研究对象,验证miR-144对自噬相关基因Atg4a的靶向调控关系,探究其在结核分枝杆菌感染宿主细胞过程中调控细胞自噬途径的作用机制。方法分别对RAW264.7巨噬细胞进行饥饿处理12 h、50 ng/m L雷帕霉素作用2 h、10 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用12 h;BCG刺激RAW264.7巨噬细胞12 h、24 h、48 h后,收集细胞,提取总RNA;利用实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-21、miR-181a、miR-155及miR-144的表达水平;构建p MIR-Report-Atg4a及p MIR-ReportAtg4a mut重组质粒,利用双萤光素酶报告系统、qRT-PCR及Western blot法验证miR-144与Atg4a的靶向作用关系。结果 BCG刺激RAW264.7巨噬细胞后,可使miR-21、miR-155及miR-144表达上调,miR-181a表达下调;经雷帕霉素诱导的细胞自噬,4种miRNA表达量与正常组相比分别上调约64倍、52倍、14倍、1倍;与正常组相比,3-MA处理细胞组,miR-21、miR-144、miR-155、miR-181a的表达量分别下调1.22倍、1.05倍、1.54倍及12.5倍;双萤光素酶报告系统及Western blot法证实,miR-144可靶向作用于Atg4a-3'UTR并抑制其表达。结论 miR-144可靶向抑制自噬相关基因Atg4a的表达,参与调控RAW264.7巨噬细胞的自噬过程。 展开更多
关键词 miR-144 结核分枝杆菌 细胞自噬 靶向调控
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