2010年4月至11月,江苏等地鸭、鹅发生了一种以产蛋率、采食量显著下降,出现脑炎样神经症状为特征的传染病。对发病鹅进行剖检观察,鸭胚尿囊腔途径接种发病鹅病料分离病原,电镜观察病毒粒子。对健康鹅接种分离病毒进行动物回归试验。在...2010年4月至11月,江苏等地鸭、鹅发生了一种以产蛋率、采食量显著下降,出现脑炎样神经症状为特征的传染病。对发病鹅进行剖检观察,鸭胚尿囊腔途径接种发病鹅病料分离病原,电镜观察病毒粒子。对健康鹅接种分离病毒进行动物回归试验。在病毒核酸背景未知的情况下,应用非序列依赖性单引物扩增法结合DNA酶处理（DNase-sequence independent single primer amplification,DNase-SISPA）对病原基因进行扩增,并在此基础上设计了1对特异性引物对病毒基因进行PCR扩增。剖检结果发现病鹅的脑膜、肺脏、肝脏、心脏、卵巢等多器官出血,脾脏肿大坏死。含毒鸭胚尿囊膜超薄切片电镜观察显示：病毒粒子直径为50~60 nm。动物回归试验成功复制出该病并分离到病毒。应用DNase-SISPA方法发现了3个病毒相关基因片段,经序列比对分析,与黄病毒属（Flavi-virus）坦布苏病毒（Tembusu virus）基因序列有很高的同源性,分别为96%、88%、93%。据此设计特异性引物扩增出一段985 bp基因片段,该片段与黄病毒属坦布苏病毒E基因的核苷酸同源性为91%,氨基酸同源性为97%。将分离的鹅黄病毒毒株命名为Goose/Jiangsu/804/2010（简称JS804）。研究结果表明：此次鸭、鹅新发疫病的病原为一种新的黄病毒。展开更多
为探究鸭疫里默氏杆菌(RA)IX型分泌系统(T9SS)分泌的假定蛋白AS87_05150的功能,本研究采用自杀质粒同源重组的方法构建RA Yb2株AS87_05150基因缺失株Yb2Δ5150及其回补株cYb2Δ5150,经PCR及测序鉴定,结果显示AS87_05150基因缺失株Yb2Δ5...为探究鸭疫里默氏杆菌(RA)IX型分泌系统(T9SS)分泌的假定蛋白AS87_05150的功能,本研究采用自杀质粒同源重组的方法构建RA Yb2株AS87_05150基因缺失株Yb2Δ5150及其回补株cYb2Δ5150,经PCR及测序鉴定,结果显示AS87_05150基因缺失株Yb2Δ5150和回补株cYb2Δ5150均正确构建,缺失株的表型为16S r RNA^(+)AS87_05150 ORF^(-),回补株的表型为16S r RNA^(+)AS87_05150 ORF^(+)。采用荧光定量PCR(qPCR)检测Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株AS87_05150基因的转录水平;根据上述3株菌不同时间的OD_(600nm)值绘制各菌株的生长曲线;采用微量结晶紫法检测各菌株生物被膜(BF)的形成能力;将10^(7)cfu/孔的Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株分别感染Vero细胞,检测各菌株对Vero细胞的黏附和侵袭力。q PCR检测结果显示,cYb2Δ5150株中AS87_05150 m RNA相对转录水平比Yb2株高约19倍(P<0.0001),Yb2Δ5150株未扩增到AS87_05150基因;生长曲线结果显示,Yb2Δ5150与Yb2株的生长曲线基本一致,但cYb2Δ5150生长速度与Yb2Δ5150株相比极显著下降(P<0.01);BF测定结果显示,Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株BF的形成能力与Yb2株相比均极显著降低(P<0.0001);黏附和侵袭力结果显示,这3株菌对Vero细胞的黏附和侵袭力均无显著差异。将3株菌分别以10^(8)cfu/只~10^(4)cfu/只、10^(10)cfu/只~10^(6)cfu/只和10^(9)cfu/只~10^(5)cfu/只的剂量经肌肉注射接种雏鸭,感染后观察雏鸭的发病情况,并采用Reed-Muench法计算3株菌对雏鸭的半数致死量(LD_(50));将3株菌均以10^(7)cfu/只经肌肉注射感染雏鸭,24 h后剖杀,无菌采集各组鸭血液、肝脏和脑组织,作相应处理后涂板采用平板计数法测定载菌量。根据各组鸭的死亡情况,计算Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株的LD_(50)分别为6.85×10^(5)cfu、8.75×10^(7)cfu和4.681×10^(8)cfu,即缺失株LD_(50)比野生株高约127倍,但回补株的LD_(50)比缺失株高约5倍。载菌量测定结果显示,Yb2Δ5150株和cYb2Δ5150株感染鸭血液、肝脏、脑组织中的细菌载量比Yb2株感染鸭的载菌量均极显著降低(P<0.001),但前两者之间上述指标均无显著差异。本实验结果表明AS87_05150与RA Yb2株的BF形成和致病性相关,但回补株对雏鸭的毒力和致病性均未回复到野生株的水平。本研究为进一步解析RA AS87_05150的功能及分子致病机制等奠定了基础。展开更多
文摘2010年4月至11月,江苏等地鸭、鹅发生了一种以产蛋率、采食量显著下降,出现脑炎样神经症状为特征的传染病。对发病鹅进行剖检观察,鸭胚尿囊腔途径接种发病鹅病料分离病原,电镜观察病毒粒子。对健康鹅接种分离病毒进行动物回归试验。在病毒核酸背景未知的情况下,应用非序列依赖性单引物扩增法结合DNA酶处理（DNase-sequence independent single primer amplification,DNase-SISPA）对病原基因进行扩增,并在此基础上设计了1对特异性引物对病毒基因进行PCR扩增。剖检结果发现病鹅的脑膜、肺脏、肝脏、心脏、卵巢等多器官出血,脾脏肿大坏死。含毒鸭胚尿囊膜超薄切片电镜观察显示：病毒粒子直径为50~60 nm。动物回归试验成功复制出该病并分离到病毒。应用DNase-SISPA方法发现了3个病毒相关基因片段,经序列比对分析,与黄病毒属（Flavi-virus）坦布苏病毒（Tembusu virus）基因序列有很高的同源性,分别为96%、88%、93%。据此设计特异性引物扩增出一段985 bp基因片段,该片段与黄病毒属坦布苏病毒E基因的核苷酸同源性为91%,氨基酸同源性为97%。将分离的鹅黄病毒毒株命名为Goose/Jiangsu/804/2010（简称JS804）。研究结果表明：此次鸭、鹅新发疫病的病原为一种新的黄病毒。
文摘为探究鸭疫里默氏杆菌(RA)IX型分泌系统(T9SS)分泌的假定蛋白AS87_05150的功能,本研究采用自杀质粒同源重组的方法构建RA Yb2株AS87_05150基因缺失株Yb2Δ5150及其回补株cYb2Δ5150,经PCR及测序鉴定,结果显示AS87_05150基因缺失株Yb2Δ5150和回补株cYb2Δ5150均正确构建,缺失株的表型为16S r RNA^(+)AS87_05150 ORF^(-),回补株的表型为16S r RNA^(+)AS87_05150 ORF^(+)。采用荧光定量PCR(qPCR)检测Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株AS87_05150基因的转录水平;根据上述3株菌不同时间的OD_(600nm)值绘制各菌株的生长曲线;采用微量结晶紫法检测各菌株生物被膜(BF)的形成能力;将10^(7)cfu/孔的Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株分别感染Vero细胞,检测各菌株对Vero细胞的黏附和侵袭力。q PCR检测结果显示,cYb2Δ5150株中AS87_05150 m RNA相对转录水平比Yb2株高约19倍(P<0.0001),Yb2Δ5150株未扩增到AS87_05150基因;生长曲线结果显示,Yb2Δ5150与Yb2株的生长曲线基本一致,但cYb2Δ5150生长速度与Yb2Δ5150株相比极显著下降(P<0.01);BF测定结果显示,Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株BF的形成能力与Yb2株相比均极显著降低(P<0.0001);黏附和侵袭力结果显示,这3株菌对Vero细胞的黏附和侵袭力均无显著差异。将3株菌分别以10^(8)cfu/只~10^(4)cfu/只、10^(10)cfu/只~10^(6)cfu/只和10^(9)cfu/只~10^(5)cfu/只的剂量经肌肉注射接种雏鸭,感染后观察雏鸭的发病情况,并采用Reed-Muench法计算3株菌对雏鸭的半数致死量(LD_(50));将3株菌均以10^(7)cfu/只经肌肉注射感染雏鸭,24 h后剖杀,无菌采集各组鸭血液、肝脏和脑组织,作相应处理后涂板采用平板计数法测定载菌量。根据各组鸭的死亡情况,计算Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株的LD_(50)分别为6.85×10^(5)cfu、8.75×10^(7)cfu和4.681×10^(8)cfu,即缺失株LD_(50)比野生株高约127倍,但回补株的LD_(50)比缺失株高约5倍。载菌量测定结果显示,Yb2Δ5150株和cYb2Δ5150株感染鸭血液、肝脏、脑组织中的细菌载量比Yb2株感染鸭的载菌量均极显著降低(P<0.001),但前两者之间上述指标均无显著差异。本实验结果表明AS87_05150与RA Yb2株的BF形成和致病性相关,但回补株对雏鸭的毒力和致病性均未回复到野生株的水平。本研究为进一步解析RA AS87_05150的功能及分子致病机制等奠定了基础。
基金This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （30872201）, Beijing Municipal project for Developing Advanced Human Resources for Education （BAHED）, the Ph. D. Programs Foundation of Ministry of Education of China （20060025003）, the Research ＆ Development Fund of the Municipal Education Commission of Beijing （KZ200810025009）, and the Project of Beijing Municipal Science ＆ Technology Commission （Z080502036708012）.
Acknowledgement Thank Doctor YANG Ya-Ping for assistance on this work. Doctor YANG Jing and their expert technical
