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水禽3种免疫抑制性病毒多重PCR检测方法的建立与应用
1
作者 戴银 杨雪 +10 位作者 童雨芹 吴希 陈瑝儿 仲月怡 胡晓苗 王洁茹 殷冬冬 尹磊 沈学怀 潘孝成 赵瑞宏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期330-336,共7页
禽流感病毒 H9 亚型(AIV-H9)、鹅圆环病毒(GoCV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)是水禽常见病原,常发生混合感染且易导致水禽的免疫抑制性疾病。 本研究针对 AIV-H9、GoCV 和 MDRV 的基因序列,分别设计特异性引物,通过优化多重 PCR 的反应条件,... 禽流感病毒 H9 亚型(AIV-H9)、鹅圆环病毒(GoCV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)是水禽常见病原,常发生混合感染且易导致水禽的免疫抑制性疾病。 本研究针对 AIV-H9、GoCV 和 MDRV 的基因序列,分别设计特异性引物,通过优化多重 PCR 的反应条件,建立了这 3 种病毒的多重 PCR 检测方法,并进行特异性、灵敏度和可重复性验证。 结果显示,建立的三重 PCR 检测方法能特异性扩增 AIV-H9、GoCV 和 MDRV的目的片段,与新型鹅星状病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽腺病毒 4 型无交叉反应;最低检出浓度分别为2.93×10^(4)copies/ μL、2.5×10^(2)copies/ μL、3.0×10^(6)copies/ μL;利用该方法对 30 份临床样品进行检测,MDRV检出率为 6.7%,GoCV 和 AIV-H9 的检出率较高,分别为 36.7%和 26.7%。 三重 PCR 与单重 PCR 的符合率为 100%。 结果表明,该三重 PCR 检测方法特异、灵敏、稳定性好,能够用于这 3 种病毒的流行病学调查和临床检测。 展开更多
关键词 禽流感病毒H9亚型 鹅圆环病毒 番鸭呼肠孤病毒 三重PCR
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PolyI:C刺激猪PK15细胞后病毒感染应答基因未注释转录本鉴定及其特征分析
2
作者 赵为民 王红 +5 位作者 徐盼 陈哲 陶晓莉 李碧侠 付言峰 程金花 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1622-1631,共10页
【目的】鉴定猪PK15细胞在类病毒聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激后病毒感染应答基因的未注释转录本的数量、剪接类型、新蛋白编码与分子结构,为进一步研究这些未注释转录本的功能奠定基础。【方法】将猪PK15细胞分为对照组和试验组,每组3个重... 【目的】鉴定猪PK15细胞在类病毒聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激后病毒感染应答基因的未注释转录本的数量、剪接类型、新蛋白编码与分子结构,为进一步研究这些未注释转录本的功能奠定基础。【方法】将猪PK15细胞分为对照组和试验组,每组3个重复;试验组加入终浓度为20μg/mL的PolyI:C,对照组加入等体积(2μL)的PBS,两组在37℃、5%CO_(2)条件下分别刺激6 h后进行Nanopore测序,鉴定两组的总转录本与差异表达基因。对差异表达基因进行GO功能分析,进一步筛选病毒感染的应答基因。对总转录本与Ensemble注释的转录本序列进行比较,发现未注释转录本。将病毒感染应答基因的未注释转录本与其对应的Ensemble注释转录本序列进行比对,分析未注释转录本的剪接类型和编码蛋白。【结果】PolyI:C刺激后,两组共鉴定蛋白编码的转录本61505个,其中有Ensemble数据库注释的39497个,未注释的转录本22008个,未注释转录本数量占总数的35.78%。同时两组鉴定到71个差异蛋白编码基因,与对照组相比,试验组上调表达基因57个,下调表达基因14个。GO功能富集分析显示,这些差异表达基因富集到20个生物过程,其中前3个生物过程分别是防御病毒反应、Ⅰ型干扰素信号通路和病毒应答,均与病毒感染应答相关。24个病毒感染应答的基因有16个基因存在未注释转录本,其中CCL 5、IFI 6、BST 2和MX 1基因未注释转录本的数量多于其Ensemble注释的总转录本数量,且大部分未注释转录本产生新的蛋白序列。IFIT 3、OAS 2、RSAD 2、CCL 5、IFI 44、CD 40、IFI 6、BST和MX 19个基因的未注释转录本有差异表达。【结论】本研究系统地鉴定了猪PK15细胞受PolyI:C刺激后病毒感染应答基因的未注释转录本的分子特征,筛选的IFIT 3、OAS 2、RSAD 2、CCL 5、IFI 44、CD 40、IFI 6、BST和MX 19个基因的差异表达的未注释转录本可能具有重要生物学作用,为进一步解析宿主基因在抗病毒反应中的复杂转录调控机制提供了依据。 展开更多
关键词 Nanopore测序 PolyI:C 病毒感染 转录本 选择性剪接
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鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究
3
作者 赵雪丽 闫若潜 +8 位作者 王华俊 王淑娟 马震原 谢彩华 柴茂 杨海波 王翠 刘影 王东方 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期165-173,共9页
建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性... 建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示:该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用于临床PCV2/PCV3感染的快速鉴别检测。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 rep基因 猪圆环病毒3型 cap基因 双重TaqMan MGB FQ-PCR
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稳转hTERT绵羊睾丸细胞系的建立
4
作者 杨雪 任善会 +5 位作者 王相伟 龚真莉 殷相平 孙跃峰 陈豪泰 万学瑞 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期43-48,共6页
羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞... 羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞永生化的方法。本试验中,通过RT-PCR获得hTERT。利用同源重组的技术,成功的构建了hTERT的真核表达质粒和慢病毒质粒。利用慢病毒表达系统,建立了稳转hTERT绵羊的睾丸细胞系。间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验研究结果均显示,hTERT基因已成功整合进入绵羊睾丸基因组中并稳定表达。第30代次的羊睾丸细胞生长较快,性状较稳定,表明已成功构建了具有永生化特性的绵羊睾丸细胞系,为草食动物病毒的相关研究提供重要的细胞模型。 展开更多
关键词 绵羊 睾丸原代细胞 人端粒酶逆转录酶基因 HTERT 永生化细胞系
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两株马立克病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析
5
作者 闫彩虹 金文杰 +4 位作者 刘文博 羊扬 钱琨 王志强 彭大新 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期65-72,共8页
为了解国内鸡群马立克病毒(MDV)流行毒株的分子特征,采用细胞培养法对马立克病疑似病鸡抗凝血进行MDV分离,间接荧光法鉴定MDV血清型,PCR扩增分离病毒的meq和pp38两个主要致病基因,所得序列与MDV参考毒株的序列进行比对分析。结果显示,... 为了解国内鸡群马立克病毒(MDV)流行毒株的分子特征,采用细胞培养法对马立克病疑似病鸡抗凝血进行MDV分离,间接荧光法鉴定MDV血清型,PCR扩增分离病毒的meq和pp38两个主要致病基因,所得序列与MDV参考毒株的序列进行比对分析。结果显示,共分离鉴定出2株MDV I型毒株,分别命名为JS0316和JS0424。meq基因编码的氨基酸序列结果显示,2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征(A71S、P194-),具有MDV强毒分离株的分子特征(D80Y、V115A、T139A、P176R和P217A)。同时,JS0316 Meq蛋白出现Q93R和V123A突变,pp38蛋白出现L98I和F240S突变,而JS0424 Meq蛋白出现P217T突变,pp38蛋白出现W67G和V210A突变。因此,2株MDV均具有国内流行强毒株的分子特征,同时存在新的基因突变。 展开更多
关键词 马立克病毒 分离鉴定 MEQ pp38 序列分析
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猪细小病毒病研究进展
6
作者 刘运超 陈玉梅 +3 位作者 杨苏珍 魏蔷 郝慧芳 柴书军 《动物医学进展》 北大核心 2024年第3期107-110,共4页
猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是一种无囊膜DNA病毒,主要引起母猪繁殖障碍。该病毒在全世界广泛流行,我国猪场PPV感染率高达90%以上,给养猪业带来巨大经济损失。PPV经口、鼻传播,主要侵染猪的生殖器官,引起母猪的死胎、木乃伊胎... 猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是一种无囊膜DNA病毒,主要引起母猪繁殖障碍。该病毒在全世界广泛流行,我国猪场PPV感染率高达90%以上,给养猪业带来巨大经济损失。PPV经口、鼻传播,主要侵染猪的生殖器官,引起母猪的死胎、木乃伊胎和公猪的精液质量下降。临床采用接种疫苗的方式进行防控,起到了一定的效果。论文对病毒的基因组和蛋白特征、流行病学和疫苗研究进行综述,以期为PPV的基础研究和疫苗开发提供参考。 展开更多
关键词 猪细小病毒 VLP组装 病毒抗原表位 VP2蛋白
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基于双特异纳米抗体FMDV血凝检测方法的建立
7
作者 杨利 张浩明 +3 位作者 乔绪稳 陈瑾 郑其升 程海卫 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第3期514-521,共8页
本研究利用基因工程方法将抗口蹄疫病毒(FMDV)纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞(cRBC)纳米抗体NbRBC48的基因片段连接,构建双特异纳米抗体Nb205-48,其相对分子质量为3.5×10^(4),能同时与FMDV和cRBC反应。利用Nb205-48成功建立了可用... 本研究利用基因工程方法将抗口蹄疫病毒(FMDV)纳米抗体Nb205和抗鸡醛化红细胞(cRBC)纳米抗体NbRBC48的基因片段连接,构建双特异纳米抗体Nb205-48,其相对分子质量为3.5×10^(4),能同时与FMDV和cRBC反应。利用Nb205-48成功建立了可用于FMDV抗原检测的血凝方法,该方法检测灵敏度为1μg/ml,与其他病毒无交叉反应,且批内和批间重复性好。分别采用血凝法和夹心ELISA方法对3批次FMDV抗原进行了检测,二者检测结果基本吻合。本研究建立了基于双特异纳米抗体Nb205-48的血凝检测方法,该方法具有较好的灵敏度、特异性和重复性,且简便、快捷、成本低,其检测结果与传统的FMDV定量检测方法的检测结果相关性好,为检测口蹄疫疫苗生产过程中FMDV抗原的含量提供了新方法。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 双特异性纳米抗体 血凝检测法
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越南非洲猪瘟疫苗AVAC ASF LIVE(ASFV-G-ΔMGF)研究工作分析与思考
8
作者 戈胜强 沙洲 +5 位作者 左媛媛 初薛霏 徐天刚 张永强 李金明 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 2024年第2期36-41,共6页
非洲猪瘟(Afcrian swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的烈性传染病。近日,越南正式将经临床试验验证的非洲猪瘟弱毒疫苗AVAC ASF LIVE(ASFV-G-ΔMGF)在其全国推广使用。本文对越南非洲猪瘟弱... 非洲猪瘟(Afcrian swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的烈性传染病。近日,越南正式将经临床试验验证的非洲猪瘟弱毒疫苗AVAC ASF LIVE(ASFV-G-ΔMGF)在其全国推广使用。本文对越南非洲猪瘟弱毒疫苗ASFV-G-ΔMGF相关研究数据进行了总结分析,分别从ASFVG-ΔMGF株攻毒保护能力评价、传代细胞培养株临床动物实验、野猪口服接种试验、毒力返强验证等方面,结合国内相关ASFV基因缺失株试验数据进行了分析。总结分析发现:越南上市的ASFV-G-ΔMGF疫苗株,二次免疫接种后攻毒保护效果更好,但在对野猪的口服接种评价中,其口鼻接种效果存在不确定性;随着疫苗株在动物体内的不断传代,其存在毒力返强和毒株变异风险,导致接种猪只临床症状明显;ASFV-G-ΔMGF株虽然有较好的攻毒保护能力和可靠的生产优势,但仍缺乏相关研究数据,特别是在垂直传播、交叉保护、基因突变等方面。后续仍需对ASFV-G-ΔMGF株的临床应用效果进一步评价。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 减毒活疫苗 越南 ASFV-G-ΔMGF疫苗株
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猪只健康与非洲猪瘟病毒感染的关系
9
作者 戈胜强 崔进 +5 位作者 张慧 徐天刚 尼博 沙洲 魏荣 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 2024年第1期46-51,共6页
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起,2018年传入我国。ASFV流行毒株不断变异,加之缺少有效疫苗,给我国ASF防控带来极大挑战。免疫接种动物的基础健康程度或免疫力水平可显著影... 非洲猪瘟(African swine fever,ASF)由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起,2018年传入我国。ASFV流行毒株不断变异,加之缺少有效疫苗,给我国ASF防控带来极大挑战。免疫接种动物的基础健康程度或免疫力水平可显著影响疫苗的使用效果,基础健康程度或免疫力水平较差的猪只感染ASFV后,其感染进程更加剧烈,预后更差。而使用营养干预如饲喂喷雾干燥猪血浆,或增强免疫力措施如移植疣猪粪便微生物群,可在一定程度上提高猪群的ASFV抵抗水平,两者紧密联系。提升猪只健康水平,将是有效防控ASF的根本。本文针对猪只健康状况或免疫力水平影响ASF疫苗免疫和病毒感染的相关研究数据进行综述,以期为我国ASF疫苗研究及防控政策制定提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 疫苗 健康水平 免疫状况
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猪感染尼帕病毒的流行特点及防控
10
作者 张慧 戈胜强 +3 位作者 徐蛟 张永强 王志亮 魏荣 《中国动物检疫》 CAS 2024年第2期9-14,共6页
尼帕病毒病是一种新发人兽共患传染病,1998年在马来西亚首次出现。引起该病的病原为尼帕病毒(Nipah virus,NiV),其在猪群中具有高度传染性,人感染后死亡率达40%~75%。NiV主要通过猪只间的直接接触传播,也可通过设备、车辆、衣服、靴子... 尼帕病毒病是一种新发人兽共患传染病,1998年在马来西亚首次出现。引起该病的病原为尼帕病毒(Nipah virus,NiV),其在猪群中具有高度传染性,人感染后死亡率达40%~75%。NiV主要通过猪只间的直接接触传播,也可通过设备、车辆、衣服、靴子以及犬、猫等机械携带传播;猪是NiV传播的放大器,主要通过呼吸道飞沫或被感染组织将病毒传播给人。果蝠是NiV的天然宿主,因此养猪场选址要远离果树种植区。目前还没有批准的人用或兽用尼帕病毒病疫苗或药物,但多种疫苗候选株在动物模型中显示出良好的保护效果,包括病毒活载体疫苗株、病毒糖蛋白亚单位疫苗株、颗粒样病毒疫苗株等;成功防控NiV感染的关键是做到早发现,在NiV传入高风险地区,对猪群持续进行血清学监测,并对猪场进行严格生物安全管理。本文结合已暴发的猪群尼帕病毒病疫情及人间疫情,探讨猪感染NiV的流行特点,并通过分析暴发原因提出防控措施,以期为猪群中防止该病发生及突发疫情时的应急处置提供参考。 展开更多
关键词 尼帕病毒 猪 流行特点 防控
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滑液囊支原体与鸡传染性支气管炎病毒共感染对SPF鸡的致病性研究
11
作者 王晨燕 邵国青 侯博 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期113-120,共8页
为比较滑液囊支原体(MS)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)共感染对SPF鸡的致病性,本研究将144只28日龄SPF鸡随机均分为阴性对照组、MS感染组、IBV-M41感染组、IBV-M41+MS共感染组、IBV-QX感染组、IBV-QX+MS共感染组共6组,采用50μL/只剂量... 为比较滑液囊支原体(MS)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)共感染对SPF鸡的致病性,本研究将144只28日龄SPF鸡随机均分为阴性对照组、MS感染组、IBV-M41感染组、IBV-M41+MS共感染组、IBV-QX感染组、IBV-QX+MS共感染组共6组,采用50μL/只剂量按相应分组点眼感染MS (106CCU50)、IBV(105EID50),阴性对照组以50μL/只点眼KM2培养基(左眼)和PBS (右眼)。感染后每天观察临床症状,在感染后7 d、14 d、21 d和28 d每组随机剖检6只鸡,观察气囊炎和气囊损伤评分,并采集气管进行病原再分离,其中MS经支原体液体培养基培养后进行PCR鉴定,IBV接种SPF鸡胚后进行RT-PCR鉴定。此外,各组鸡气管均经10%甲醛固定后进行粘膜厚度检测以及病理损伤评分。结果显示:除阴性对照组和MS感染组,其他组鸡在感染后4 d均出现一过性呼吸道症状。剖检结果显示MS感染组鸡在感染后21 d出现气囊炎,28 d仍可见气囊炎;而IBV-M41感染组和IBV-QX感染组鸡在感染后7 d或14 d出现气囊炎,且气囊炎的发生率均未超过50%。感染后14 d IBV-QX+MS共感染组鸡气囊炎发生率达100%(6/6),直至21 d并且大部分鸡气囊炎可持续至感染后28 d (5/6),而IBV-M41+MS共感染组鸡气囊炎仅可持续至感染后21 d,且气囊炎的发生率最高在感染后14 d (5/6)。IBV-QX+MS共感染组鸡平均气囊损伤评分在感染后14 d、21d和28 d均极显著高于单一感染组(P<0.001),而IBV-M41+MS共感染组鸡仅在感染后14 d极显著高于单一感染组(P<0.001)。病原再分离结果显示,各感染组鸡均在气管中再分离到MS(感染后28 d内)或IBV(感染后7 d内)。病理损伤检测结果显示,共感染组鸡较各单一感染组鸡气管粘膜增厚持续时间更长以及病理损伤更为严重。IBV-M41+MS共感染组鸡在感染后14 d平均气管粘膜厚度显著低于IBV-QX+MS共感染组(P<0.05),而在感染后21 d极显著低于IBV-QX+MS共感染组(P<0.001),其余各组鸡在感染后14 d和21 d均极显著低于IBV-QX+MS共感染组鸡(P<0.001)。IBV M41+MS共感染组鸡最早14 d出现气管病变,而IBV QX+MS共感染组鸡在共感染后7 d就可见气管病理损伤,且共感染组鸡的平均气管损伤评分均极显著高于单一MS或IBV感染组(P<0.01或P<0.001)。上述结果证实MS和IBV共感染较单一感染对28日龄SPF鸡的致病性更强,IBV M41或QX株与MS共感染对SPF鸡的致病性存在差异,本研究为临床IB和MS的防控提供科学参考依据。 展开更多
关键词 滑液囊支原体 鸡传染性支气管炎病毒 共感染 致病性
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非洲猪瘟基因Ⅰ型/Ⅱ型重组病毒研究现状及思考
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作者 戈胜强 沙洲 +7 位作者 郑辉 刘春菊 左媛媛 胡永新 王晓华 刘爽 魏荣 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 2024年第3期68-72,共5页
基因重组在非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组间广泛存在,它是造成ASFV遗传多样性的原因之一。ASFV基因Ⅱ型毒株2018年传入我国,2021年国内又报道发现基因Ⅰ型毒株和基因Ⅰ型/Ⅱ型重组病毒。我国分离的ASFV基因Ⅰ型/Ⅱ型重组毒嵌合了两个基因型... 基因重组在非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组间广泛存在,它是造成ASFV遗传多样性的原因之一。ASFV基因Ⅱ型毒株2018年传入我国,2021年国内又报道发现基因Ⅰ型毒株和基因Ⅰ型/Ⅱ型重组病毒。我国分离的ASFV基因Ⅰ型/Ⅱ型重组毒嵌合了两个基因型序列并部分整合了二者的生物学特性,毒力与基因Ⅱ型强毒株相当,某些致病指标甚至更高;基因Ⅱ型减毒活疫苗株不能对该重组毒株产生有效保护。该重组毒株在国内的流行演变可能会显著影响ASFV的进化方向,并对ASFV疫苗研究带来新的挑战。本文通过对国内ASFV基因Ⅰ型/Ⅱ型重组病毒进行综述,就相关研究进展进行总结归纳,以期为我国ASF防控提供参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 重组病毒 疫苗研发
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猪圆环病毒2型疫苗及其效力评价方法比较研究
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作者 徐嫄 彭国瑞 +8 位作者 徐小艾 吴睿智 赵启祖 朱元源 李翠 王团结 邹兴启 李琰 刘业兵 《中国兽药杂志》 2024年第1期87-94,共8页
为探索对不同猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)疫苗产品进行统一质量评价的可行性,对国内该类疫苗产品及其现有效力评价方法进行了归纳和比较研究。结果发现,目前猪圆环病毒2型疫苗类产品种类有25个,且疫苗毒株数量多达10... 为探索对不同猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)疫苗产品进行统一质量评价的可行性,对国内该类疫苗产品及其现有效力评价方法进行了归纳和比较研究。结果发现,目前猪圆环病毒2型疫苗类产品种类有25个,且疫苗毒株数量多达10余个,效力检验方法包括传统的免疫攻毒法、血清学方法和多种不同的替代方法,但尚没有统一的效力评价体系。本研究可为进一步完善PCV2疫苗效力评价方法、统一评价疫苗效力、提高产品质量提供参考。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 疫苗 效力评价方法
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鸡源SAMHD1蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
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作者 王一新 张真研 +5 位作者 曹凤阳 李阳 徐瑞雪 谢之景 崔言顺 李建亮 《山东畜牧兽医》 2024年第1期30-34,共5页
为制备鸡源宿主限制因子SAMHD1(chSAMHD1)的多克隆抗体,本试验根据chSAMHD1基因序列设计引物,扩增部分chSAMHD1片段,构建p ET-chSAMHD1原核表达质粒,并将其转化至BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导和镍柱亲和层析纯化获得重组chSAMHD1蛋白... 为制备鸡源宿主限制因子SAMHD1(chSAMHD1)的多克隆抗体,本试验根据chSAMHD1基因序列设计引物,扩增部分chSAMHD1片段,构建p ET-chSAMHD1原核表达质粒,并将其转化至BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导和镍柱亲和层析纯化获得重组chSAMHD1蛋白。将重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗chSAMHD1多克隆抗体,通过Westernblot和IFA测定多克隆抗体的反应性。结果显示,chSAMHD1重组蛋白的相对分子质量约为75.0 k Da,与预期大小一致;重组蛋白以包涵体形式表达;所制备的chSAMHD1多克隆抗体效价达到1:512000;IFA结果证实,本试验所制备多克隆抗体能够特异性识别DF-1细胞中过表达的chSAMHD1蛋白。以上结果表明,该研究成功制备了chSAMHD1蛋白多克隆抗体,从而为鸡源SAMHD1蛋白功能的深入研究奠定了基础。 展开更多
关键词 鸡源SAMHD1 多克隆抗体 制备 鉴定
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A、B、J亚群禽白血病病毒混合感染的鉴定及gp85基因序列分析 被引量：1
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作者 窦俊峰 汪最 +5 位作者 李丽 卢琴 金鑫鑫 凌小淳 罗青平 翟新国 《中国畜牧兽医》 CSCD 北大核心 2024年第1期302-311,共10页
【目的】了解湖北地区禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)亚群之间混合感染及其gp85基因遗传变异情况,为进一步研究ALV混合感染的流行病学提供参考。【方法】对来自湖北宜昌疑似感染ALV的一只病死鸡进行病理剖检,无菌采集病变组... 【目的】了解湖北地区禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)亚群之间混合感染及其gp85基因遗传变异情况,为进一步研究ALV混合感染的流行病学提供参考。【方法】对来自湖北宜昌疑似感染ALV的一只病死鸡进行病理剖检,无菌采集病变组织接种DF-1细胞进行病毒分离,通过PCR、ELISA及间接免疫荧光试验(IFA)等方法进行亚群鉴定,进一步对分离株gp85基因的相似性和变异情况进行分析。【结果】剖检结果可见病死鸡肾脏、脾脏肿大,肺脏出血,表面可见灰白色肿瘤结节;组织匀浆接种DF-1细胞后,ELISA检测发现细胞上清P27抗原呈阳性;IFA检测发现,感染细胞里有特异性绿色荧光;PCR鉴定能同时扩增出A(692 bp)、B(847 bp)和J(545 bp)亚群的特异性条带。鉴定结果表明,从该病死鸡中分离到A、B和J亚群ALV毒株,分别命名为HBYC2022-A、HBYC2022-B和HBYC2022-J。分离株gp85基因核苷酸相似性分析显示,HBYC2022-A与江苏株JS-A1201相似性最高,为99.6%;HBYC2022-B与江苏株JS-B1204相似性最高,为99.7%;而HBYC2022-J与黑龙江株PK19FA01、广西株GX20YL12 J及安徽株AHaq02相似性均为100%。此外,分离株gp85基因高突变区域(hr1、hr2)氨基酸序列并未出现特殊点突变。【结论】鸡群存在A、B和J不同亚群ALV的混合感染情况,提示国内养禽场需提高警惕并加强针对ALV各亚群的流行病学调查。 展开更多
关键词 禽白血病病毒(ALV) 分离鉴定 混合感染 GP85基因 序列分析
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密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析
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作者 于吉锋 谢晶 +8 位作者 黄勇 肖璐 林毅 曹冶 叶勇刚 魏勇 吴学婧 李江凌 康润敏 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期668-677,共10页
[目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据... [目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBacTMDual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。[结果]试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,重组杆状病毒转染Sf9细胞表达出大小约60 ku的RHDV2 VP60蛋白。IFA鉴定结果显示,感染重组杆状病毒的Sf9细胞产生了大量的黄绿色荧光,表明重组杆状病毒在Sf9细胞中大量表达VP60蛋白。透射电镜观察结果显示,VP60蛋白折叠成VLP,大小为40 nm左右,呈现球形结构,表面光滑。优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫原性,最小免疫剂量为0.5 mL/只,免疫持续期可达210 d以上。[结论]试验构建了含有密码子优化的双VP60基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中成功表达RHDV2 VP60蛋白,该蛋白制备的VLP疫苗对家兔具有良好的免疫原性。 展开更多
关键词 兔出血症病毒2型(RHDV2) 病毒样颗粒(VLP) 密码子偏好性 重组杆状病毒 免疫原性
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四株水貂肠炎病毒的分离鉴定及遗传进化分析
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作者 孟祥书 陈汉 +8 位作者 郭杰 姚梦凡 和彦良 陈超阳 孙见 李丽敏 刘聚祥 程悦宁 王建科 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期185-192,共8页
为了调查我国水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV)的流行情况,本研究以山东某水貂养殖场疑似发生水貂病毒性肠炎的病貂为材料,对其进行剖检以及病原检测。将PCR检测为MEV阳性的水貂肠道内容物处理后用F81细胞进行病毒分离培养,通过... 为了调查我国水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV)的流行情况,本研究以山东某水貂养殖场疑似发生水貂病毒性肠炎的病貂为材料,对其进行剖检以及病原检测。将PCR检测为MEV阳性的水貂肠道内容物处理后用F81细胞进行病毒分离培养,通过电镜形态学观察、血清学、分子生物学等方法证实,分离出的4株病毒为MEV毒株,分别将其命名为MEV SD-1、MEV SD-4、MEV SD-5和MEV SD-6。完成了这4株病毒的近全基因组序列测定分析,对分离株之间以及与参考毒株的主要蛋白氨基酸序列进行了同源性比较。结果显示分离株之间VP2和NS1蛋白的氨基酸相似性分别为99.5%~99.7%和99%~99.9%,而分离株与GenBank的32株参考序列之间VP2和NS1蛋白的氨基酸相似性分别为96.5%~99.7%和98.4%~99.6%。本研究结果为进一步开展MEV的流行病学调查、疫苗研制以及诊断方法研究奠定了基础。 展开更多
关键词 水貂肠炎病毒 分离 鉴定 遗传进化分析
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IRES核心区12-bp非连续插入突变对猪塞内卡病毒复制和细胞嗜性的影响
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作者 张晓战 董轩志 +10 位作者 吕楠楠 刘懿雯 马新甜 王林青 夏艳勋 蒋增海 郭运泽 赵攀登 宋予震 杨德成 边传周 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期1407-1416,共10页
【背景】塞内卡病毒(senecavirus A,SVA)是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区(untranslated region,UTR)中的内部核糖体进入位点(IRES)元件在病毒复制过程中发挥重要作用。2017年... 【背景】塞内卡病毒(senecavirus A,SVA)是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区(untranslated region,UTR)中的内部核糖体进入位点(IRES)元件在病毒复制过程中发挥重要作用。2017年我国出现IRES核心区Domain II 12个碱基非连续插入的自然突变SVA毒株,在病毒复制和致病性方面存在明显改变。【目的】探讨IRES Domain II区域发生的突变对SVA的复制及细胞嗜性的影响,为进一步了解SVA致病机制奠定基础。【方法】以实验室前期构建的含HeN-1/2018株全基因组感染性克隆pHeN-1/2018为基础,通过定点突变的方式,逐步将其IRES Domain II核心区域308—317 nt的9个碱基(ACTCAAGCG)替换为GD04/2017株基因组308—328 nt的21个碱基(CACGCCTGCCGATAGACGATT),构建重组载体pHeN-1/2018-i12并进行了病毒拯救。随后,利用病毒基因组克隆测序、间接免疫荧光试验和Western blot试验对所拯救病毒进行鉴定,同时验证了IRES核心区12个碱基插入突变对SVA病毒体外复制能力和细胞嗜性的影响。【结果】将构建完成的重组载体pHeN-1/2018-i12转染细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的IRES突变病毒rHeN-1/2018-i12。病毒连续传代后测序结果表明rHeN-1/2018-i12遗传稳定,P5代病毒基因组序列未发生碱基突变,P10代病毒IRES区域没有出现突变现象。用低代次的突变病毒rHeN-1/2018-i12体外感染本体动物猪源细胞系PK-15和IBRS-2,及仓鼠源细胞系BHK-21,进行细胞感染试验,结果表明rHeN-1/2018-i12与亲本毒株rHeN-1/2018在PK-15、IBRS-2和BHK-21中均能导致明显的细胞病变,表现出相似的生长曲线趋势,表明IRES核心区Domain II 12个碱基突变不能够改变对上述细胞的嗜性;但SVA突变病毒和亲本株在不同细胞中的病变时间及病毒滴度上存在较大的差异,rHeN-1/2018-i12株在细胞中生长能力较其亲本株rHeN-1/2018差,诱使细胞病变的时间较晚,在感染24 hpi,两者病毒滴度相差可达10倍。【结论】本研究基于SVA反向遗传操作系统构建并拯救SVA IRES突变毒株,确定了IRES突变对SVA生物学特性的影响,有助于我们更好地了解SVA致病机制,拓宽我们对病毒IV型IRES功能的认识。 展开更多
关键词 塞内卡病毒 内部核糖体进入位点 反向遗传操作系统 病毒复制 细胞嗜性
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牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
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作者 刘丹 黄小洁 +5 位作者 吴华伟 孙淼 陈延飞 秦义娴 侯力丹 薛麒 《动物医学进展》 北大核心 2024年第4期51-56,共6页
为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重... 为建立检测牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体的间接ELISA方法,利用昆虫细胞真核表达系统成功表达E2蛋白,将纯化后的E2蛋白作为包被抗原,用方阵滴定方法对影响ELISA的各个因素进行优化,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,在昆虫细胞中表达了BVDV E2蛋白,Western blot证实目的蛋白可与BVDV阳性血清发生特异性反应。ELISA优化结果显示,E2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL,最佳封闭液为1%明胶,最佳血清稀释度为1∶400,最佳血清作用方式为37℃作用30 min,酶标抗体的最佳作用方式为1∶2000稀释、37℃作用30 min,最佳底物作用时间为室温20 min,阳性临界值为OD 450≥0.423。与血清中和试验法进行比较,总符合率为97.8%,板内和板间重复性试验的变异系数均小于10%。该方法与牛常见病毒阳性血清均无交叉反应。说明建立的间接ELISA抗体检测方法特异性、敏感性和重复性良好,可用于大批量样本的临床检测和流行病学研究。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 E2蛋白 间接ELISA 抗体检测
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鸡产蛋下降综合征病毒间接免疫荧光检测方法的建立及应用
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作者 孔冬妮 王嘉 +9 位作者 邓永 翟天舒 刘丹 黄小洁 薛琪 候力丹 吴华伟 薛青红 李俊平 毛娅卿 《动物医学进展》 北大核心 2024年第1期44-51,共8页
为建立检测鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)的间接免疫荧光方法,并对该检测方法的各个步骤进行优化,以鸡产蛋下降综合征病毒多抗血清和FITC标记的兔抗鸡IgG为组合,对一抗和二抗的最适工作浓度和孵育时间进行了优化,对IFA方法进行了敏感性、... 为建立检测鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)的间接免疫荧光方法,并对该检测方法的各个步骤进行优化,以鸡产蛋下降综合征病毒多抗血清和FITC标记的兔抗鸡IgG为组合,对一抗和二抗的最适工作浓度和孵育时间进行了优化,对IFA方法进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果表明,检测接种EDSV的96孔细胞培养板时,多抗血清的最适工作浓度为1∶320,孵育时间为45 min;FITC标记的兔抗鸡IgG的最适工作浓度为1∶200,孵育时间为30 min;病毒敏感性试验表明,该方法可以检测到10-2 TCID 50/mL的病毒;多抗血清敏感度试验表明,当多抗血清稀释到1∶1280时仍可见较明显的特异性荧光;特异性试验表明,该方法只针对EDSV,而不与禽副流感病毒4型、鸡新城疫病毒等其他病原反应;批内重复性试验和批间重复性试验结果表明,该方法具有较好的重复性和可靠性。结果表明,建立的间接免疫荧光方法具有较高的灵敏度和较好的稳定性,可为我国禽源性生物材料EDSV的检测提供技术支持,有巨大的市场需求。 展开更多
关键词 鸡产蛋下降综合征病毒 多抗血清 间接免疫荧光 优化
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