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结核杆菌Hsp65与EGFP融合基因的构建及DC疫苗的制备 被引量：8
1
作者 肖凌 魏雅稚 +1 位作者 夏飞 刘胜武 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期13-16,共4页
目的: 构建结核杆菌H37Rv株Hsp65与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合基因pEGHsp65, 并以其转染小鼠的树突状细胞 (DC), 制备抗结核的DC疫苗。方法: 采用PCR技术, 从培养的结核杆菌H37Rv株中抽提Hsp65基因,克隆到含有EGFP基因的质粒pEGFP... 目的: 构建结核杆菌H37Rv株Hsp65与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合基因pEGHsp65, 并以其转染小鼠的树突状细胞 (DC), 制备抗结核的DC疫苗。方法: 采用PCR技术, 从培养的结核杆菌H37Rv株中抽提Hsp65基因,克隆到含有EGFP基因的质粒pEGFP- C1中, 构建pEGHsp65融合基因。以其转染Hela细胞, 在共聚焦激光扫描荧光显微镜下观测不同时间荧光表达的强弱, 并用RT- PCR检测Hsp65mRNA的表达。以pEGHsp65融合基因转染小鼠骨髓细胞经GM- CSF和IL -4诱导分化的DC, 用MTT比色法检测DC疫苗刺激未致敏脾细胞的增殖。结果: 用EcoRⅠ和BglⅡ双酶切鉴定证实, H37Rv株Hsp65DNA已插入重组表达载体pEG -FP- C1中。将融合基因转染入Hela细胞, 48h转染率最高;用RT- PCR在mRNA水平上可检测到Hsp65mRNA的表达。用MTT比色法检测表明, 融合基因转染的DC能激活并引起未致敏的脾细胞增殖。结论: 成功地构建pEGHsp65融合基因和以其制备的DC疫苗, 为进一步观察其治疗结核病的效应奠定了基础。 展开更多
关键词 结核杆菌 hsp65 增强型绿色荧光蛋白 树突状细胞
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热休克蛋白65及其融合蛋白Hsp65-6×P277的分离纯化和稳定性研究(英文) 被引量：6
2
作者 陈庆梅 吴国君 +3 位作者 吴洁 李泰明 曹荣月 刘景晶 《药物生物技术》 CAS CSCD 2007年第4期249-254,共6页
来源于牛分枝杆菌的热休克蛋白65(Hsp65)在没有佐剂的情况下可作为载体分子将抗原表位递呈给免疫系统。热休克蛋白具有蛋白酶的催化活性,容易发生自溶而降解,这制约了基于Hsp65疫苗的研究。该研究中,建立了纯化Hsp65及其融合蛋白Hsp65-6... 来源于牛分枝杆菌的热休克蛋白65(Hsp65)在没有佐剂的情况下可作为载体分子将抗原表位递呈给免疫系统。热休克蛋白具有蛋白酶的催化活性,容易发生自溶而降解,这制约了基于Hsp65疫苗的研究。该研究中,建立了纯化Hsp65及其融合蛋白Hsp65-6×P277(P277为来源于人热休克蛋白60的肽段,线性重复6次)的方法。Hsp65与Hsp65-6×P277以可溶形式表达于大肠杆菌。在低温及添加EDTA的条件下经细胞裂解、硫酸铵沉淀及阴离子交换树脂等纯化方法,可得到电泳纯的目的蛋白。用纯化的融合蛋白Hsp65-6×P277免疫小鼠,可激发机体产生强烈的免疫应答,该融合蛋白有希望作为免佐剂的糖尿病疫苗加以进一步研究开发。 展开更多
关键词 热休克蛋白65(hsp65) 融合蛋白 纯化 降解 稳定性
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结核杆菌HSP65 DNA疫苗的初步研究 被引量：6
3
作者 居巍 刘君炎 +1 位作者 庄玉辉 叶林柏 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期112-115,共4页
目的构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65 000 u基因为基础的核酸 疫苗。方法采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，经限制性核酸内切酶消化后， 插入真核表达载体pcDNA3.1(-) 的相应酶切位点，并将此重组质粒... 目的构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65 000 u基因为基础的核酸 疫苗。方法采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，经限制性核酸内切酶消化后， 插入真核表达载体pcDNA3.1(-) 的相应酶切位点，并将此重组质粒免疫动物。结果 重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP65。DNA免疫小鼠体内产 生特异性抗体。结论以HSP65编码基因为基础的真核表达载体构建成功,并能引起特异性动物免疫反应，为进一步研究其在结核病防治中的作用 奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 hsp65基因 真核表达载体 DNA疫苗 结核病
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结核分支杆菌HSP65蛋白在真核细胞中的瞬时表达 被引量：5
4
作者 居巍 刘君炎 +1 位作者 佘应龙 曹飞 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期216-217,共2页
关键词 抗结核病 hsp65 结核分支杆菌 真核细胞 瞬时表达 蛋白 HIV 多重耐药菌株 疫苗 防治工作
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结核分枝杆菌亚单位疫苗Ag85b-ESAT-6+Hsp65-IL-2的安全性评价研究 被引量：3
5
作者 路延之 王丽梅 +5 位作者 康健 杨锐 张鑫 姚庆港 柏银兰 徐志凯 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期945-951,共7页
目的评价结核分枝杆菌亚单位疫苗Ag85b-ESAT-6+Hsp65-IL-2在小鼠和豚鼠体内的安全性。方法小鼠慢性毒性实验:C57BL/6J小鼠间隔2周、皮下3次注射100μg亚单位疫苗(Ag85b-ESAT-6和Hsp65-IL-2各50μg),观察临床症状表现和器官病理学改变。... 目的评价结核分枝杆菌亚单位疫苗Ag85b-ESAT-6+Hsp65-IL-2在小鼠和豚鼠体内的安全性。方法小鼠慢性毒性实验:C57BL/6J小鼠间隔2周、皮下3次注射100μg亚单位疫苗(Ag85b-ESAT-6和Hsp65-IL-2各50μg),观察临床症状表现和器官病理学改变。小鼠急性毒性实验:C57BL/6J小鼠皮下注射100μg亚单位疫苗(Ag85b-ESAT-6和Hsp65-IL-2各50μg),观察小鼠临床症状、体重、摄食摄水量、器官的脏器系数和病理学表现。豚鼠全身过敏实验:Hartley豚鼠间隔2d、皮下3次注射1 000μg、100μg、10μg亚单位疫苗(Ag85b-ESAT-6和Hsp65-IL-2均按质量1∶1混合),16d后用二倍剂量足背静脉注射激发,观察体重变化和全身过敏症状。结果小鼠慢性毒性实验表明,亚单位疫苗多次注射后不引起临床症状和病理损伤;小鼠急性毒性实验表明,亚单位疫苗对小鼠不产生临床症状,对小鼠体重、摄食摄水量、脏器系数、器官病理学改变影响无统计学意义;豚鼠全身过敏实验表明,疫苗短期多次致敏对豚鼠的体重无明显影响,低剂量疫苗不引起豚鼠产生全身过敏反应。结论亚单位疫苗Ag85b-ESAT-6+Hsp65-IL-2在小鼠和豚鼠体内均表现出良好的安全性,可用于进一步TB预防和治疗性疫苗的研制。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 亚单位疫苗 安全性评价 Ag856-ESAT-6+hsp65-IL-2
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结核杆菌pcHSP65真核表达载体的构建及其DNA免疫实验 被引量：6
6
作者 居巍 刘君炎 +1 位作者 庄玉辉 叶林柏 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期12-15,20,共5页
目的 :构建以结核分枝杆菌热休克蛋白 65kD基因为基础的核酸疫苗。方法 :采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中 ,扩增出HSP65的编码基因 ,经限制性核酸内切酶消化后 ,插入真核表达载体pcDNA3 .1 (- )的相应酶切位点 ,并将此重组质... 目的 :构建以结核分枝杆菌热休克蛋白 65kD基因为基础的核酸疫苗。方法 :采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中 ,扩增出HSP65的编码基因 ,经限制性核酸内切酶消化后 ,插入真核表达载体pcDNA3 .1 (- )的相应酶切位点 ,并将此重组质粒免疫动物。结果 :重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP65。DNA免疫小鼠体内产生特异性抗体 ,能抵抗结核杆菌的感染。结论 :以HSP65编码基因为基础的真核表达载体构建成功 ,并能引起特异性动物免疫反应 。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 hsp65 真核表达载体
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大肠杆菌-分枝杆菌分泌型穿梭表达质粒pBCG-SP-HSP65的构建及人结核杆菌HSP65的表达 被引量：2
7
作者 戴五星 陈智浩 +4 位作者 高红 黄海浪 梁靓 程继忠 皇甫永穆 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期170-174,共5页
用PCR技术从BacillusCalmette gu啨ｒｉｎ(BCG)基因组中扩增出抗原 85B(Ag85B)的信号肽 (SP)DNA序列 ,从pCMVMTHSP65质粒中扩增出人结核杆菌HSP65全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下... 用PCR技术从BacillusCalmette gu啨ｒｉｎ(BCG)基因组中扩增出抗原 85B(Ag85B)的信号肽 (SP)DNA序列 ,从pCMVMTHSP65质粒中扩增出人结核杆菌HSP65全长基因。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pBCG 2 10 0的人结核杆菌HSP70启动子下游 ,构建成分泌型原核穿梭表达质粒 (pBCG SP HSP65)。酶切鉴定、PCR和测序分析结果均表明分泌型原核穿梭表达质粒pBCG SP HSP65构建成功。利用电穿孔将该质粒转入耻垢分枝杆菌(Mycobacterialsmegmatis,MS)中 ,用卡那霉素筛选出阳性重组子。经热诱导后用SDS PAGE观察到在耻垢分枝杆菌中 65kD蛋白占总蛋白的 2 0 % ,而在重组耻垢分枝杆菌表达的 65kD蛋白占菌体总蛋白的 3 4 46% ,占裂解物上清总蛋白的 68 56% ,表明重组的HSP65基因能在耻垢分枝杆菌中高效表达 ,表达的蛋白大部分以可溶状态存在。通过Western blot证实分泌的该蛋白能与结核杆菌HSP65的抗体特异性结合 ,说明该重组蛋白具有HSP65的生物学活性。 展开更多
关键词 大肠杆菌 分枝杆菌 分泌型穿梭表达质粒 信号肽 结核轩菌hsp65 人
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副结核分枝杆菌hsp65基因的克隆及序列分析 被引量：2
8
作者 徐凤宇 胡玉庆 +2 位作者 曾范利 姜秀云 何昭阳 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期204-207,共4页
以副结核分枝杆菌C-2株基因组DNA为模板,以hsp65基因特异性引物进行PCR扩增,获得了1 626 bp的DNA片段。通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体。经鉴定,成功地构建出了重组质粒pGEM-T-hsp65。序列分析结果表明:该序列与GenBank中... 以副结核分枝杆菌C-2株基因组DNA为模板,以hsp65基因特异性引物进行PCR扩增,获得了1 626 bp的DNA片段。通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体。经鉴定,成功地构建出了重组质粒pGEM-T-hsp65。序列分析结果表明:该序列与GenBank中副结核分枝杆菌K-10株的同源性为99.2%。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 hsp65基因 克隆 序列分析
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结核分枝杆菌pcHSP65真核表达载体的构建及序列测定 被引量：5
9
作者 居巍 刘君炎 叶林柏 《武汉大学学报（医学版）》 CAS 2002年第1期5-8,共4页
目的 :构建以结核分枝杆菌热休克蛋白 6 5kU基因为基础的核酸疫苗。方法 :采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中 ,扩增出HSP6 5的编码基因 ,经限制性核酸内切酶消化后 ,插入真核表达载体pcDNA3.1( )的相应酶切位点 ,并将此重组质粒... 目的 :构建以结核分枝杆菌热休克蛋白 6 5kU基因为基础的核酸疫苗。方法 :采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中 ,扩增出HSP6 5的编码基因 ,经限制性核酸内切酶消化后 ,插入真核表达载体pcDNA3.1( )的相应酶切位点 ,并将此重组质粒进行序列测定。结果 :重组质粒的插入基因经序列测定证实为结核分枝杆菌HSP6 5。结论 :以HSP6 5编码基因为基础的真核表达载体构建成功 。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 热休克蛋白65 真核表达载体 pchsp65 构建 序列分析
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结核杆菌抗原HSP65基因在大肠杆菌中的表达及纯化 被引量：1
10
作者 王庆敏 胡振林 +2 位作者 肖存杰 章建程 孙树汉 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 2004年第4期74-76,共3页
目的 :为研制预防结核病疫苗 ,选取结核杆菌HSP65蛋白为免疫抗原 ,将结核分枝杆菌HSP65抗原基因在大肠杆菌中表达、纯化。方法 :将HSP65的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX5T中 ,构建成pGEX5T HSP65重组质粒。将质粒转化到E .coli.K80 2... 目的 :为研制预防结核病疫苗 ,选取结核杆菌HSP65蛋白为免疫抗原 ,将结核分枝杆菌HSP65抗原基因在大肠杆菌中表达、纯化。方法 :将HSP65的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX5T中 ,构建成pGEX5T HSP65重组质粒。将质粒转化到E .coli.K80 2细菌 ,用IPTG诱导HSP65表达 ,然后用亲和层析的方法进行纯化 ,最后用Western blot方法确认表达蛋白的特异性。结果 :获得了pGEX5T HSP65重组子 ,HSP65蛋白在k80 2菌中获得了表达 ,表达的蛋白条带大小约 86kDa ,与预期的结果相符。表达产物经亲和层析后获得了较单一的蛋白条带 ;表达及纯化的蛋白在纯化前后均可被结核病患者血清特异地识别。为进一步研究其在结核病诊断和防治中的应用打下了基础。 展开更多
关键词 结核分支杆菌 抗原 hsp65 基因 大肠杆菌 表达 纯化 免疫
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HSP65在结核病血清学诊断中的应用前景初探 被引量：3
11
作者 赖允鑫 杨江龙 +7 位作者 沙巍 肖洋炯 曾维宏 叶薇怡 季萍 肖和平 王颖 沈浩 《中国实验诊断学》 2013年第3期465-471,共7页
及时准确的诊断对结核病的防控至关重要。虽然简易快速的血清学检测技术在病毒等感染性疾病的诊断中得到广泛应用,但目前临床上结核病的血清学诊断技术尚不理想。我们通过间接ELISA方法比较筛查多个结核分枝杆菌抗原在正常人和活动期结... 及时准确的诊断对结核病的防控至关重要。虽然简易快速的血清学检测技术在病毒等感染性疾病的诊断中得到广泛应用,但目前临床上结核病的血清学诊断技术尚不理想。我们通过间接ELISA方法比较筛查多个结核分枝杆菌抗原在正常人和活动期结核病患者中的血清学应答水平,发现结核分枝杆菌抗原HSP65(Rv0440)的特异性IgG水平在活动期结核病患者外周血浆中明显高于健康对照组(P<0.0001),其检测的灵敏度达90%,特异性达90%,ROC曲线的AUC值达0.978,上述指标均与目前临床上使用的抗38kD(Rv0934)蛋白的IgG水平相当;同时结合结核病患者临床资料分析结果显示抗HSP65的IgG在空洞病变结核病患者中的平均水平显著高于无空洞患者;部分抗38kD IgG抗体阴性的结核病患者中抗HSP65IgG抗体水平呈现阳性,提示抗HSP65IgG可以成为目前商业化抗38kD IgG检测的补充,从而进一步提高结核病诊断的灵敏度。上述研究结果表明抗HSP65IgG抗体有望成为诊断活动期结核病的候选补充血清标志物。 展开更多
关键词 活动期结核病 血清学标志物 hsp65 IGG
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副结核分枝杆菌hsp65基因在大肠杆菌中的表达 被引量：1
12
作者 徐凤宇 姜秀云 +2 位作者 曾范利 胡玉庆 何昭阳 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期263-266,共4页
本研究以EcoR Ⅴ和EcoR Ⅰ双酶切pGEM-T-hsp65和pET-32a(+),并将纯化的hsp65基因亚克隆至pET-32a(+)中,构建出原核表达载体pET-hsp65。将pET-hsp65转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见一条约76ku的外源蛋白带... 本研究以EcoR Ⅴ和EcoR Ⅰ双酶切pGEM-T-hsp65和pET-32a(+),并将纯化的hsp65基因亚克隆至pET-32a(+)中,构建出原核表达载体pET-hsp65。将pET-hsp65转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见一条约76ku的外源蛋白带。Western blot分析表明,该蛋白具有与副结核分枝杆菌多克隆抗体发生反应的特性,为进一步研究有关hsp65的新型疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 副结核分枝杆菌 hsp65基因 原核表达
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结核分枝杆菌Hsp65的表达、纯化与鉴定 被引量：1
13
作者 席丽 师长宏 +3 位作者 靳亚平 张廷芬 赵勇 岳晨莉 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期535-538,共4页
目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌热休克蛋白65(Heat Shock Protein 65),为研究结核病诊断技术提供基础。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中分两段扩增出hsp65基因,将上下游基因片段分别连接进入pMD18-T载体中,序列测定正确后... 目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌热休克蛋白65(Heat Shock Protein 65),为研究结核病诊断技术提供基础。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中分两段扩增出hsp65基因,将上下游基因片段分别连接进入pMD18-T载体中,序列测定正确后,通过基因内部的单一酶切位点进行连接。将完整的hsp65基因克隆到pProEX HTa载体并在大肠杆菌DH5α中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。获得的纯化蛋白与10例临床可疑结核病人血清进行Western-blot分析。结果获得的结核分枝杆菌Hsp65基因序列与GenBank公布的一致;表达蛋白相对分子质量为65 kDa,与文献报道相同;Western-blot结果显示,在相对分子量约65 kDa处与鼠抗MTB Hsp65 mAb特异性结合带;纯化的目的蛋白与8例病人血清有特异性结合条带,2例为阴性,该结果与临床诊断一致。结论成功表达、纯化和鉴定了Hsp65蛋白,为其在结核病诊断研究中的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 hsp65 表达纯化
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HSP65基因PCR-限制性片断长度多态性分析毛细管电泳技术鉴定分枝杆菌的初步研究 被引量：1
14
作者 王国庆 张朝武 +1 位作者 黎源倩 周颖 《卫生研究》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期297-299,共3页
目的　建立HSP6 5PCR RFLP毛细管电泳快速鉴定分枝杆菌的方法。方法　采用PCR扩增分枝杆菌 6 5 kDa热休克蛋白 (HSP6 5 )基因的一个约 4 4 0bp片段 ,扩增产物分别经限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ酶切后 ,用毛细管电泳 激光诱导荧光检测酶... 目的　建立HSP6 5PCR RFLP毛细管电泳快速鉴定分枝杆菌的方法。方法　采用PCR扩增分枝杆菌 6 5 kDa热休克蛋白 (HSP6 5 )基因的一个约 4 4 0bp片段 ,扩增产物分别经限制性内切酶BstEⅡ和HaeⅢ酶切后 ,用毛细管电泳 激光诱导荧光检测酶切片段。结果　试验的全部 7种分枝杆菌都有各自独特的酶切图谱模式 ,几乎所有酶切片段都能很好地分离。结论　该方法用于分枝杆菌种水平的鉴定具有准确度、分辨率和灵敏度高的优点。 展开更多
关键词 分枝杆菌 hsp65 毛细管电泳
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HSP65-PSA融合蛋白的体内外抗肿瘤活性研究 被引量：1
15
作者 董博翰 吴秀丽 +5 位作者 尹晓光 王莉 卫红飞 孙陆果 于永利 王丽颖 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期586-589,共4页
目的:研究热休克蛋白65(HSP65)-前列腺特异性抗原融合蛋白在体外对人树突状细胞的活化作用以及在小鼠体内抑制PSA阳性肿瘤细胞生长的作用。方法:利用Westernblot方法对融合蛋白HSP65-PSA的特异性进行鉴定;利用共聚焦显微镜、流式细胞术(... 目的:研究热休克蛋白65(HSP65)-前列腺特异性抗原融合蛋白在体外对人树突状细胞的活化作用以及在小鼠体内抑制PSA阳性肿瘤细胞生长的作用。方法:利用Westernblot方法对融合蛋白HSP65-PSA的特异性进行鉴定;利用共聚焦显微镜、流式细胞术(FCM)检测和斑点杂交的方法对PcDNA3-GFP-PSA稳定转染的B16细胞进行鉴定;用HSP65-PSA融合蛋白刺激来自于人外周血的未成熟树突状细胞,观察融合蛋白对树突状细胞的体外活化作用;用PcDNA3-GFP-PSA稳定转染的B16细胞种植C57BL/6小鼠,继而用HSP65-PSA融合蛋白来免疫小鼠以观察融合蛋白对PSA阳性B16肿瘤细胞生长的体内抑制作用。结果:Westernblot检测显示融合蛋白HSP65-PSA具有PSA蛋白特异性。共聚焦显微镜、FCM检测和斑点杂交结果均显示PcDNA3-GFP-PSA转染的B16细胞转染情况良好。体外细胞实验显示,将HSP65-PSA融合蛋白作用于人外周血树突状细胞后可以明显促进树突状细胞表面分子CD86的表达,其上调率为52.93%。动物体内实验显示,HSP65-PSA融合蛋白可以明显抑制PSA阳性B16肿瘤细胞在小鼠体内的生长。10μg蛋白免疫组的肿瘤体积(4.91±5.21)与对照组(10.56±6.10)相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HSP65-PSA融合蛋白可以在体外活化树突状细胞,在小鼠体内抑制PSA阳性B16肿瘤细胞的生长。HSP65-PSA融合蛋白可能具有应用于PSA阳性肿瘤的免疫治疗作用。 展开更多
关键词 hsp65-PSA融合蛋白 PSA阳性B16肿瘤细胞 免疫治疗 肿瘤生长抑制
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hsp65基因序列PCR-RFLP法鉴定130株临床分枝杆菌研究 被引量：3
16
作者 刘佳文 吴雪琼 杨京灵 《临床肺科杂志》 2006年第4期453-454,共2页
目的探讨hsp65基因序列PCR-RFLP法用于临床分枝杆菌鉴定的诊断价值。方法用hsp65基因序列PCR-RFLP法鉴定经过传统方法鉴定过的130株临床分枝杆菌。结果130株临床分枝杆菌中,鉴定出结核分枝杆菌105株,戈登分枝杆菌4株、瘰痢分枝杆菌3株... 目的探讨hsp65基因序列PCR-RFLP法用于临床分枝杆菌鉴定的诊断价值。方法用hsp65基因序列PCR-RFLP法鉴定经过传统方法鉴定过的130株临床分枝杆菌。结果130株临床分枝杆菌中,鉴定出结核分枝杆菌105株,戈登分枝杆菌4株、瘰痢分枝杆菌3株、耻垢分枝杆菌1株。用PCR-RFLP法,偶然分枝杆菌复合群和鸟胞分枝杆菌复合群进一步鉴定,偶然分枝杆菌2株、脓肿分枝杆菌2株、龟分枝杆菌4株、鸟分枝杆菌5株、胞分枝杆菌4株。结论hsp65基因序列PCR-RFLP法比传统方法有更高的准确性、敏感性、特异性和重复性,具有很好的临床应用价值。 展开更多
关键词 hsp65基因 PCR-RFLP 分枝杆菌
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热休克蛋白HSP65嵌合表达系统的构建和表达 被引量：2
17
作者 雷清 蒋琳 +1 位作者 马超 刘鹏 《微生物学免疫学进展》 2007年第3期24-26,共3页
设计一条含(GlySer)3连接肽的引物,从BCG经PCR得到HSP65-Linker的基因片段。将该基因定向克隆入原核表达载体pET42b(+),用大肠杆菌BL21(DE3)转化,构建了pET42-LHSP65的嵌合表达载体。DNA测序正确后经IPTG诱导表达,得到可溶性目的蛋白,We... 设计一条含(GlySer)3连接肽的引物,从BCG经PCR得到HSP65-Linker的基因片段。将该基因定向克隆入原核表达载体pET42b(+),用大肠杆菌BL21(DE3)转化,构建了pET42-LHSP65的嵌合表达载体。DNA测序正确后经IPTG诱导表达,得到可溶性目的蛋白,Western-blot也证实了此重组蛋白可与抗HSP65发生特异性免疫反应。此重组体的构建为进一步探索HSP65的免疫佐剂功效奠定了基础。 展开更多
关键词 hsp65 连接肽 基因表达
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结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因疫苗的构建及表达 被引量：1
18
作者 王丽梅 徐志凯 +3 位作者 柏银兰 张海 康健 师长宏 《科学技术与工程》 2008年第18期5161-5163,5169,共4页
构建结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因疫苗,并对其在体外真核细胞中进行表达。用EcoRⅤ和HindⅢ双酶切含HSP65-IL-2融合基因的pPRO-hsp65-IL-2载体,回收目的基因片断HSP65-IL-2,并将其亚克隆入同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(-)中,重... 构建结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因疫苗,并对其在体外真核细胞中进行表达。用EcoRⅤ和HindⅢ双酶切含HSP65-IL-2融合基因的pPRO-hsp65-IL-2载体,回收目的基因片断HSP65-IL-2,并将其亚克隆入同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(-)中,重组质粒酶切鉴定正确后以脂质体瞬时转染COS-7细胞,并通过间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达。重组真核表达质粒酶切后可获得约2067 bp的融合基因HSP65-IL-2片段,间接免疫荧光检测重组质粒转染的COS-7细胞,可在细胞胞浆中看到特异性的绿色荧光。成功地构建了结核分枝杆菌HSP65-IL-2融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。 展开更多
关键词 结核分枝杆菌 hsp65 IL-2 基因疫苗
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利用重组蛋白制备和鉴定分枝杆菌HSP65单克隆抗体 被引量：1
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作者 尹晓光 李大鹏 +4 位作者 万敏 张培因 胡晓平 王丽颖 于永利 《中国实验诊断学》 2006年第3期225-227,共3页
目的制备针对牛分枝杆菌热休克蛋白65(HSP65)的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法以CpGODN1826/Alum为佐剂,不同的HSP65融合蛋白为免疫抗原和检测抗窄,用聚乙二醇(PEG)法制备杂交瘤细胞,ELISA检测杂交瘤细胞分泌抗体的效价和类型,Western... 目的制备针对牛分枝杆菌热休克蛋白65(HSP65)的单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法以CpGODN1826/Alum为佐剂,不同的HSP65融合蛋白为免疫抗原和检测抗窄,用聚乙二醇(PEG)法制备杂交瘤细胞,ELISA检测杂交瘤细胞分泌抗体的效价和类型,Western blot分析抗体的特异性。结果获得5株稳定分泌抗HSP65蛋白的McAb,3株细胞分泌的mAb为IgG1亚类,2株为IgG2a。ELISA和Western blot结果显示,mAb能特异性结合HSP65-PSA-tag、HSP65-MUC1-tag和HSP65重组蛋白,但与Chaperon-PSA重组蛋白和宿主菌BL21的菌体裂解蛋白不发生结合。结论纯化的重组蛋白可代替的牛分枝杆菌,用于HSP65 mAb的制备和鉴定。获得的HSP65 mAb为HSP65及其重组蛋白的功能研究奠定基础。 展开更多
关键词 牛分枝杆菌BcG hsp65 重组蛋白 单克隆抗体 CpG/Alum
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PRA法检测hsp65和groES在非结核分枝杆菌肺病诊断中的价值 被引量：1
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作者 章洁 郭秋萍 《国际检验医学杂志》 CAS 2019年第17期2112-2115,2119,共5页
目的 探讨PCR-限制性片段长度多态性分析(PRA)法检测hsp65和groES在非结核分枝杆菌肺病诊断中的价值。方法 选取非结核分枝杆菌肺病患者30例为肺病组,结核病患者30例为结核组,非结核分枝杆菌病感染患者30例为感染组,同时选取体检健康者3... 目的 探讨PCR-限制性片段长度多态性分析(PRA)法检测hsp65和groES在非结核分枝杆菌肺病诊断中的价值。方法 选取非结核分枝杆菌肺病患者30例为肺病组,结核病患者30例为结核组,非结核分枝杆菌病感染患者30例为感染组,同时选取体检健康者30例为健康对照组。使用PRA法检测4组受试者痰液中hsp65和groES的相对分子质量。采用受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积分析hsp65和groES联合检测在非结核分枝杆菌肺病中的诊断意义。结果 肺病组患者痰液中hsp65相对分子质量和groES相对分子质量明显高于结核组、感染组及健康对照组(P<0.05)。肺病组与结核组的hsp65和groES灵敏度分别为93%和77%,特异度分别为80%和90%;肺病组与感染组的hsp65和groES的灵敏度分别为77%和63%,特异度分别为63%和96%;肺病组与健康对照组的hsp65和groES的灵敏度分别为93%和76%,特异度分别为83%和87%。hsp65和groES的临界值分别为2.27和1.96。结论 PRA法检测hsp65和groES在非结核分枝杆菌肺病诊断中具有较好的效果。 展开更多
关键词 PCR-限制性片段长度多态性分析 hsp65 GROES 非结核分枝杆菌病
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