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稳定表达细胞色素P4502B6的Flp-In^(TM)CHO细胞系的建立及鉴定
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作者 李靖 陆定艳 +4 位作者 陈帅帅 孙佳 郑林 李勇军 刘亭 《贵州医科大学学报》 CAS 2024年第10期1435-1439,1446,共6页
目的构建稳定表达细胞色素P4502B6(CYP2B6)的Flp-In^(TM)CHO细胞系。方法将Flp-In^(TM)CHO细胞分为Flp-In^(TM)CHO组、Flp-In^(TM)CHO空载体组及Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组,通过Lipofectamine2000转染试剂,分别将pcDNA5/FRT空质粒和pcDNA5... 目的构建稳定表达细胞色素P4502B6(CYP2B6)的Flp-In^(TM)CHO细胞系。方法将Flp-In^(TM)CHO细胞分为Flp-In^(TM)CHO组、Flp-In^(TM)CHO空载体组及Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组,通过Lipofectamine2000转染试剂,分别将pcDNA5/FRT空质粒和pcDNA5/FRT-CYP2B6重组质粒转染至Flp-In^(TM)CHO空载体组细胞和Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组细胞中,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)及荧光素酶实验检测转染细胞中CYP2B6 mRNA水平、蛋白表达水平及活性,用四氮唑盐(MTS)测定转染CYP2B6的Flp-In^(TM)CHO细胞对环磷酰胺的毒性敏感性。结果与Flp-In^(TM)CHO组和Flp-In^(TM)CHO空载体组相比,Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组细胞中CYP2B6的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)、酶活性显著增加(P<0.001),对环磷酰胺的毒性敏感度显著增加(P<0.001)。结论成功构建稳定表达CYP2B6的Flp-In^(TM)CHO细胞系,为研究药物代谢和筛选毒性药物提供工具。 展开更多
关键词 细胞色素P4502B6 稳定表达 酶活性 环磷酰胺 Flp-In^(TM)cho细胞系
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恒稳磁场辅助CHO细胞培养和表达特性研究
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作者 李晓红 李红文 +3 位作者 高丽 张雪艳 杨哪 李荣明 《工业微生物》 CAS 2024年第5期39-43,共5页
以中国仓鼠卵巢细胞为宿主细胞构建重组表达细胞用以表达单克隆抗体,已经被广泛应用于生物制药领域。物理调控是影响细胞增殖和表达的重要方式,但针对恒稳磁场暴露下的CHO细胞培养及其抗体表达还鲜有报道。基于此,文章利用3.0 mT恒稳磁... 以中国仓鼠卵巢细胞为宿主细胞构建重组表达细胞用以表达单克隆抗体,已经被广泛应用于生物制药领域。物理调控是影响细胞增殖和表达的重要方式,但针对恒稳磁场暴露下的CHO细胞培养及其抗体表达还鲜有报道。基于此,文章利用3.0 mT恒稳磁场,在37℃、8%CO_(2)环境下对CHO细胞进行克隆培养,通过克隆扩增筛选、蛋白表达及分析、拷贝数监测等手段来评估其对抗体表达的影响。结果表明,与对照组相比,在3.0 mT磁场环境下,单克隆形成数量增加了13.24%,细胞数量显著增多,单克隆抗体表达水平提升53.2%,克隆筛选周期缩短4~5 d。此外,在亚克隆筛选中,亚克隆的细胞数量和抗体表达在磁场暴露下略有增加,而抗体表达、蛋白质量和基因拷贝数在传代后均无显著变化,表明磁场暴露环境中培养的重组CHO细胞具有稳定的性质。该研究结果有望为未来CHO细胞的大规模培养以及磁场暴露下的高效生产抗体研究提供参考。 展开更多
关键词 cho细胞 恒稳磁场 克隆表达 抗体表达 蛋白质特性
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市政污泥及其热处理渣对CHO-K1细胞的毒性研究
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作者 顾迪 张晨 +3 位作者 顾卫华 赵静 白建峰 张承龙 《有色金属(冶炼部分)》 CAS 北大核心 2024年第8期166-174,共9页
评估市政污泥资源化产物的健康风险对其安全规范利用具有指导意义。分别对某污水处理厂的污泥进行了热解和好氧发酵处理,运用中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)对市政污泥及其热处理渣开展细胞毒性试验和遗传毒性试验,评估其对典型哺乳动物细胞... 评估市政污泥资源化产物的健康风险对其安全规范利用具有指导意义。分别对某污水处理厂的污泥进行了热解和好氧发酵处理,运用中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)对市政污泥及其热处理渣开展细胞毒性试验和遗传毒性试验,评估其对典型哺乳动物细胞的危害和潜在风险。结果显示,与原污泥样品相比,污泥热解渣和好氧发酵渣的细胞毒性和遗传毒性均降低。与原污泥样品相比,RTCA细胞增殖试验结果显示,污泥热解渣和好氧发酵渣对CHO-K1细胞的生长抑制性明显减弱;CCK-8细胞毒性试验结果显示,污泥热解渣和好氧发酵渣的细胞相对存活率分别增加了161%和137%;Caspase 3细胞凋亡蛋白酶活力试验结果显示,暴露于污泥热解渣和好氧发酵渣中的CHO-K1细胞的Caspase 3凋亡蛋白酶的活性分别降低了29.3%和20.1%;彗星试验结果显示,污泥热解渣和好氧发酵渣的尾长分别缩短了64.5%和25.9%,尾矩分别减少了78.4%和28.1%。研究结果表明,热处理技术(热解处理和好氧发酵处理)可减少市政污泥的细胞毒性和遗传毒性,降低市政污泥对生态环境和人体健康的潜在风险。 展开更多
关键词 污泥热处理 cho-K1细胞 细胞毒性 彗星试验 重金属
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锌离子对CHO细胞IgG2抗体表达及二硫键异构体分布的影响
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作者 刘学明 蒋仁材 +4 位作者 韦梦娟 刘唯 胡婷婷 郭兴东 曹春来 《生物化工》 CAS 2024年第3期14-19,34,共7页
目的:研究Zn^(2+)对中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)生长、IgG2表达及其二硫键异构体分布的影响。方法:补料分批培养外分泌IgG2的CHO细胞株中,分别添加不同浓度的葡萄糖酸锌,每天监测细胞密度以及活率;培养14 d后离心除细胞得上清液,通过生... 目的:研究Zn^(2+)对中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)生长、IgG2表达及其二硫键异构体分布的影响。方法:补料分批培养外分泌IgG2的CHO细胞株中,分别添加不同浓度的葡萄糖酸锌,每天监测细胞密度以及活率;培养14 d后离心除细胞得上清液,通过生化分析仪测定上清液中IgG2含量,之后应用蛋白A磁珠亲和得到IgG2纯化样品,非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳(nrCE-SDS)、阳离子交换高效液相色谱(CEX-HPLC)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测IgG2二硫键异构体分布。结果:25~200μmol/L浓度条件下,Zn^(2+)对于CHO细胞生长,活率维持以及IgG2抗体的表达均有一定的负面影响,并与Zn^(2+)浓度具有负相关性;而Zn^(2+)的添加能够显著提高IgG2二硫键异构体中IgG2-B亚型的比例,下调IgG2-A和IgG2-A/B两种亚型比例。其中100μmol/L Zn^(2+)效果最明显,IgG2-B比例提高近10个百分点。结论:Zn^(2+)能够抑制CHO细胞生长以及IgG2表达,同时Zn^(2+)对二硫键异构体的调控至关重要。 展开更多
关键词 cho细胞 免疫球蛋白G2 锌离子 二硫键异构体
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改良Cho缝合术与B-Lynch缝合术治疗剖宫产产后出血患者的效果比较
5
作者 阮舜珊 《中国民康医学》 2024年第12期148-150,共3页
目的:比较改良Cho缝合术与B-Lynch缝合术治疗剖宫产产后出血患者的效果。方法:回顾性分析2020年5月至2023年5月在该院行剖宫产分娩的70例产妇的临床资料,根据子宫缝合方法不同将其分为观察组和对照组各35例。对照组采用B-Lynch缝合术,... 目的:比较改良Cho缝合术与B-Lynch缝合术治疗剖宫产产后出血患者的效果。方法:回顾性分析2020年5月至2023年5月在该院行剖宫产分娩的70例产妇的临床资料,根据子宫缝合方法不同将其分为观察组和对照组各35例。对照组采用B-Lynch缝合术,观察组采用改良Cho缝合术。比较两组止血效果,术中、产后2 h、产后24 h出血量,手术时间,产后恶露持续时间,以及并发症发生率。结果:观察组治疗总有效率为94.74%(36/35),高于对照组的78.12%(25/35),差异有统计学意义(P<0.05);观察组术中及产后2、24 h出血量均少于对照组,手术时间、产后恶露持续时间均短于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);两组并发症发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:改良Cho缝合术治疗剖宫产产后出血可提高止血效果,减少术中及产后出血量,缩短手术时间及产后恶露持续时间,效果优于B-Lynch缝合术治疗。 展开更多
关键词 改良cho缝合术 B-LYNCH缝合术 子宫压迫缝合术 剖宫产 产后出血
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重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白在CHO-S细胞中的表达纯化及功能活性分析 被引量:1
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作者 千爱君 萧耿苗 +4 位作者 李壮 梁志成 穆云萍 赵子建 李芳红 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期390-396,共7页
目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,... 目的在悬浮中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-S)中分泌表达、纯化重组hCGH-CTP融合蛋白,验证其对3T3-L1成熟脂肪细胞脂质积累的影响。方法构建CTP连接肽融合人糖蛋白激素β5/α2重组蛋白表达载体pcDNA3.1-rhCGH-CTP,将其瞬时转染CHO-S悬浮细胞中,大量表达纯化并验证rhCGH-CTP蛋白生物学活性;通过干预3T3-L1成熟脂肪细胞24 h,观察细胞内甘油三酯(TG)水平的变化。结果Western blot结果显示,rhCGH-CTP蛋白在CHO-S细胞中成功表达,表达量可达715.4 mg·L^(-1);用AKTA pure蛋白纯化系统纯化蛋白,SDS-PAGE方法鉴定纯化出的蛋白纯度较高可达90%。此外,在高表达TSHR基因的成熟脂肪细胞3T3-L1中,利用ELISA试剂盒测定不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预后胞内cAMP含量明显升高,说明rhCGH-CTP蛋白具有生物活性;油红O染色结果发现,与对照组相比,不同浓度rhCGH-CTP蛋白干预组的成熟脂肪细胞中TG含量明显降低(P<0.05)。结论成功表达并纯化了rhCGH-CTP融合蛋白,其具有良好的生物学活性并能有效降低TG,该研究为后续深入揭示CGH蛋白的生理作用及在临床实践中的潜在应用提供了重要基础。 展开更多
关键词 重组人糖蛋白激素β5/α2融合蛋白 真核表达 悬浮cho-S细胞 cAMP活性 基因工程 脂代谢
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基于位点特异性整合评价CHO细胞表达系统启动子活性的研究
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作者 鲁晨 王子玉 +4 位作者 蔡燕飞 邓勇强 金坚 丁学峰 陈蕴 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1400-1408,共9页
工业生产上中国仓鼠卵巢细胞(CHO)药物蛋白质的表达水平受多种因素影响:调控元件对转录翻译的影响、基因组整合位点的影响以及表达系统的影响等。转录作为基因表达第一步,较大程度影响蛋白质的表达,其中启动子在转录起始发挥至关重要的... 工业生产上中国仓鼠卵巢细胞(CHO)药物蛋白质的表达水平受多种因素影响:调控元件对转录翻译的影响、基因组整合位点的影响以及表达系统的影响等。转录作为基因表达第一步,较大程度影响蛋白质的表达,其中启动子在转录起始发挥至关重要的作用。启动子筛选大部分通过瞬时转染或随机整合,但存在拷贝数不明确或整合位点随机等而无法准确评价启动子活性。位点特异性整合在一定程度上降低位置效应对外源基因造成的影响,并有可能提高外源基因的表达水平。本课题组前期在CHO细胞基因组中发现并验证了多个可稳定表达外源蛋白质的位点,本研究选择其中1个位点(2c6)用于启动子活性的评价。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别将猿猴病毒早期启动子(SV40)、小鼠延伸因子-1α(mEF-1α)、鸡β-肌动蛋白(cACTB)启动子和人磷酸甘油酸激酶启动子(hPGK)调控的报告基因(EGFP)表达盒定点整合至2c6位点上。通过流式分选仪分析细胞平均荧光强度,qPCR检测EGFP的mRNA水平,综合评价启动子的活性。结果表明,mEF-1α和cACTB启动子的活性优于SV40和hPGK。2次流式分选结果表明,位点特异性整合可以更为精确评价CHO细胞表达系统启动子活性。 展开更多
关键词 启动子评价 定点整合 中国仓鼠卵巢细胞 CRISPR/Cas9
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接种重组带状疱疹疫苗(CHO细胞)偶合带状疱疹性神经痛1例
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作者 吴燕飞 周翠萍 +1 位作者 邓鹏飞 杨来宝 《现代医药卫生》 2024年第17期3049-3052,共4页
采用流行病学方法提取受种者、疫苗生产企业和接种方相关资料,对接种重组带状疱疹(HZ)疫苗(CHO细胞)后出现的1例HZ性神经痛(PHN)病例开展调查,评估PHN与疫苗接种的因果关系,并为防止类似事件提供科学依据。根据疫苗接种与临床表现的时... 采用流行病学方法提取受种者、疫苗生产企业和接种方相关资料,对接种重组带状疱疹(HZ)疫苗(CHO细胞)后出现的1例HZ性神经痛(PHN)病例开展调查,评估PHN与疫苗接种的因果关系,并为防止类似事件提供科学依据。根据疫苗接种与临床表现的时间和因果关联等确定所患PHN与疫苗无因果关系,不属于预防接种异常反应,属偶合症。重组HZ疫苗是目前预防HZ安全、有效的手段。 展开更多
关键词 重组带状疱疹疫苗 cho细胞 带状疱疹性神经痛 偶合症 病例报告
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基于TMT蛋白组学的硝酸铀酰诱导CHO-K1细胞损伤研究 被引量:1
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作者 尹晶晶 刘欢 +4 位作者 高洁 王志鹏 袁慧 李建华 李建国 《陕西科技大学学报》 北大核心 2023年第1期66-71,87,共7页
应用蛋白组学技术筛选硝酸铀酰暴露诱导CHO-K1细胞损伤的差异表达蛋白,为铀毒性机制研究提供数据.CHO-K1细胞经500μmol/L硝酸铀酰染毒24 h,以差异倍数大于1.5倍,差异显著性小于0.05为标准,采用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)标记... 应用蛋白组学技术筛选硝酸铀酰暴露诱导CHO-K1细胞损伤的差异表达蛋白,为铀毒性机制研究提供数据.CHO-K1细胞经500μmol/L硝酸铀酰染毒24 h,以差异倍数大于1.5倍,差异显著性小于0.05为标准,采用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)标记蛋白组学技术筛选差异表达蛋白,应用生物信息学技术对差异表达蛋白进行聚类分析、基因本体(Gene Ontology,GO)分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析及蛋白相互作用分析.共鉴定出蛋白4772个,硝酸铀酰染毒组筛选出差异表达1.5倍以上的蛋白309个,其中164个表达上调,145个表达下调.GO分析结果显示差异表达的蛋白主要参与1086种生物过程、282种细胞成分以及377类分子功能.KEGG分析结果显示差异表达蛋白主要富集于40条信号转导通路,参与核糖体生物合成、RNA运输、辅因子代谢、Notch信号通路、吞噬体、染色体及相关蛋白、蛋白质外排、生理节律、IL-17信号通路、类脂物代谢等信号通路.差异蛋白相互作用网络分析结果显示蛋白RPS3A和RPS17的关联度最高.研究结果表明,CHO-K1细胞经500μmol/L硝酸铀酰染毒24 h后,蛋白发生差异表达,核糖体生物合成、RNA运输等多条信号通路发生改变,蛋白RPS3A和RPS17可能是硝酸铀酰暴露致CHO-K1细胞损伤的关键蛋白. 展开更多
关键词 硝酸铀酰 cho-K1细胞 蛋白质组学 生物信息学 差异蛋白
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稳定表达人细胞色素P450氧化还原酶(POR)的Flp-In^(TM) CHO细胞系的建立 被引量:1
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作者 刘欢 刘亭 +6 位作者 陆定艳 孙莉 何俊奇 李勇军 王永林 孙佳 席晓岚 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期103-108,共6页
目的建立稳定表达人细胞色素P450氧化还原酶(POR)的Flp-In^(TM) CHO细胞系,为进一步建立稳定双表达人POR与人细胞色素P450(CYP)的细胞系奠定基础。方法构建POR重组慢病毒并感染Flp-In^(TM) CHO细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,挑... 目的建立稳定表达人细胞色素P450氧化还原酶(POR)的Flp-In^(TM) CHO细胞系,为进一步建立稳定双表达人POR与人细胞色素P450(CYP)的细胞系奠定基础。方法构建POR重组慢病毒并感染Flp-In^(TM) CHO细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,挑选转染细胞进行嘌呤霉素筛选和单克隆培养,以获得稳定转染细胞株。利用丝裂霉素C(MMC)细胞毒实验、实时荧光定量PCR和Western blot法检测细胞POR的表达,获得稳定表达POR的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞株。构建稳定双表达POR和CYP2C19的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞(Flp-In^(TM) CHO-POR-2C19)和单表达CYP2C19的Flp-In^(TM) CHO细胞(Flp-In^(TM) CHO-2C19),并用环磷酰胺(CPA)测定CYP2C19酶活性。结果与感染阴性对照病毒的Flp-In^(TM) CHO细胞相比,感染POR重组慢病毒的Flp-In^(TM) CHO细胞MMC代谢活性升高,POR mRNA和蛋白的表达水平增加,说明获得了可稳定表达POR的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞。与Flp-In^(TM) CHO细胞相比,Flp-In^(TM) CHO-2C19的CPA代谢活性无显著差异,而Flp-In^(TM) CHO-POR-2C19的CPA代谢活性增加且明显高于Flp-In^(TM) CHO-2C19细胞。结论成功建立了稳定表达POR且可进一步用于CYP转基因细胞构建的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞系。 展开更多
关键词 人细胞色素P450氧化还原酶(POR) 慢病毒 Flp-In^(TM)cho-POR细胞系
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稳定表达3种猪腹泻病毒嵌合抗原的CHO细胞系构建与鉴定 被引量:3
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作者 宋旭 赵永祥 +4 位作者 范宝超 郭容利 李基棕 刘静 李彬 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第3期104-109,共6页
为构建稳定表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪胃肠炎病毒(TGEV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)主要抗原的CHO细胞系,为猪病毒性腹泻三联疫苗的研发提供基础材料,本研究将PEDV的S基因的COE区域、TGEV和PDCoV的S基因的受体结合区域(RBD),通过同... 为构建稳定表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪胃肠炎病毒(TGEV)和猪Delta冠状病毒(PDCoV)主要抗原的CHO细胞系,为猪病毒性腹泻三联疫苗的研发提供基础材料,本研究将PEDV的S基因的COE区域、TGEV和PDCoV的S基因的受体结合区域(RBD),通过同源重组的方式进行融合,克隆到慢病毒表达质粒pLV-EF1a-IRES-Puro中,包装得到重组慢病毒。使用重组慢病毒感染CHO细胞,经过嘌呤霉素和单克隆细胞筛选,基因水平和蛋白水平表达验证,成功构建了稳定表达3种猪腹泻病毒抗原融合蛋白的CHO细胞系,为进一步研制PEDV-TGEV-PDCoV的亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 cho细胞系 稳定表达 仔猪腹泻病毒 慢病毒
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稳定表达猪δ冠状病毒S1蛋白CHO细胞系的构建与鉴定 被引量:1
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作者 孙雪珂 丁培阳 +6 位作者 王思桥 刘思源 李明慧 常泽杰 陈艺兰 李瑞琪 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2023年第6期131-138,共8页
为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S1蛋白的CHO细胞系,利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S1转染至CHO细胞,通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化,采用间接EL... 为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S1蛋白的CHO细胞系,利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S1转染至CHO细胞,通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化,采用间接ELISA方法检测重组S1蛋白活性。将纯化的重组S1蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)及病毒中和试验对重组S1蛋白免疫原性进行检测。结果显示,稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系成功建立,并获得了纯度高于90%、产量为28.5 mg/L的重组S1蛋白;且重组S1蛋白与PDCoV阳性血清反应性良好,具有良好的免疫原性,中和效价为1∶128。综上,成功建立了稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系,且纯化获得的重组S1蛋白具有良好的生物学活性。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 S1蛋白 cho细胞 稳定表达 蛋白质纯化
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不同亚型CHO宿主细胞对抗体表达的影响
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作者 曹辉 董静 +1 位作者 贾宇 江一帆 《生物技术进展》 2023年第5期698-703,共6页
CHO细胞作为宿主细胞广泛应用于生物药工业化生产中。其中,CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S是最常见的3种亚型。虽然这些亚型是从共同的原始CHO细胞分离出来的,但在不同的实验室或生物医药公司、研究人员、培养基或培养方式下连续传代、驯化和... CHO细胞作为宿主细胞广泛应用于生物药工业化生产中。其中,CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S是最常见的3种亚型。虽然这些亚型是从共同的原始CHO细胞分离出来的,但在不同的实验室或生物医药公司、研究人员、培养基或培养方式下连续传代、驯化和保存,使得CHO细胞积累了大量变异,导致宿主细胞应用于抗体药生产时会在细胞生长状态、抗体表达量及以糖型为代表的质量属性方面表现出较大差异。综述了CHO细胞不同亚型的染色体差异、生长状态、表达差异以及糖型差异,以期为抗体药物研发中宿主细胞的选择提供参考。 展开更多
关键词 cho细胞 抗体 表达量 糖型
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细胞色素P450 3A4基因C239S突变体稳定表达Flp-In^(TM)CHO细胞系的建立
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作者 何俊奇 陆定艳 +4 位作者 陈帅帅 李勇军 王永林 郑江 刘亭 《贵州医科大学学报》 CAS 2023年第12期1454-1458,共5页
目的构建稳定表达细胞色素P450家族3亚家族A成员4(CYP3A4)的C239S突变体(CYP3A4-C239S)的Flp-In^(TM)CHO细胞系。方法使用Lipofectamine2000转染试剂将pcDNA5/FRT-CYP3A4-C239S突变型重组质粒和pcDNA5/FRT-空质粒转染至Flp-In TM CHO细... 目的构建稳定表达细胞色素P450家族3亚家族A成员4(CYP3A4)的C239S突变体(CYP3A4-C239S)的Flp-In^(TM)CHO细胞系。方法使用Lipofectamine2000转染试剂将pcDNA5/FRT-CYP3A4-C239S突变型重组质粒和pcDNA5/FRT-空质粒转染至Flp-In TM CHO细胞,潮霉素B(500 g/L)进行稳定筛选,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞中CYP3A4-C239S的mRNA和蛋白表达,采用黄曲霉素B1(AFB1)细胞毒性实验检测细胞活性。结果与Flp-In^(TM)CHO-空质粒组相比,Flp-In^(TM)CHO-3A4-C239S组的CYP3A4-C239S mRNA和蛋白表达水平均显著增加(P<0.001),AFB1细胞毒性实验显示,CYP3A4-C239S细胞组对AFB1的毒性敏感度显著增加(P<0.001)。结论成功构建了稳定表达CYP3A4-C239S的Flp-In^(TM)CHO细胞系,且为后续研究CYP3A4突变对药物代谢的影响支撑基础。 展开更多
关键词 细胞色素P4503A4 黄曲霉毒素B1 突变体 稳定表达 Flp-In^(TM)cho细胞
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过量表达CHO细胞内源性糖基化酶对抗体五聚甘露糖修饰的影响
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作者 徐静 余垚 Tan Kee Wee 《中国医药生物技术》 2023年第4期319-327,共9页
目的研究CHO K1细胞内源性糖基化酶对细胞的生长代谢以及抗体中五聚甘露糖(Man5)水平的影响。方法构建含有抗体基因、糖基化酶基因共转染的CHO K1稳定细胞株以及空载细胞株,检测细胞群和克隆阶段的抗体滴度、Man5水平,使用RT-qPCR的方... 目的研究CHO K1细胞内源性糖基化酶对细胞的生长代谢以及抗体中五聚甘露糖(Man5)水平的影响。方法构建含有抗体基因、糖基化酶基因共转染的CHO K1稳定细胞株以及空载细胞株,检测细胞群和克隆阶段的抗体滴度、Man5水平,使用RT-qPCR的方法检测过表达基因的转录水平,并分析单克隆细胞基因转录水平与Man5含量的相关性。结果研究显示,过表达糖基化酶基因后对细胞生长代谢的影响相对较小,糖基化酶基因单独过表达对降低蛋白中的Man5含量没有效果。将基因Man2a2和Mgat2组合过表达之后,可以将Man5的水平降低70%~80%,两个基因的转录水平都较高的情况下对降低Man5含量可以起到更加显著的作用。结论糖基化酶基因Man2a2和Mgat2组合过表达可以显著降低抗体蛋白中的Man5水平。 展开更多
关键词 cho K1细胞 基因过表达 五聚甘露糖 转录水平
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CHO细胞多基因工程改造策略的建立及应用
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作者 程静雯 曹磊 +4 位作者 张艳敏 叶倩 陈敏 谭文松 赵亮 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期283-291,共9页
近年来,中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞工程改造主要通过敲入或敲除基因来改变细胞某个单一功能,而敲入和敲除的基因往往无法在单次实验操作中同时发挥相应的功能,限制了多基因同步改造的应用。该研究选取细胞凋亡通路... 近年来,中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞工程改造主要通过敲入或敲除基因来改变细胞某个单一功能,而敲入和敲除的基因往往无法在单次实验操作中同时发挥相应的功能,限制了多基因同步改造的应用。该研究选取细胞凋亡通路中抗凋亡蛋白即B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)基因为敲入基因、蛋白岩藻糖基化通路中岩藻糖合成关键酶即岩藻糖转移酶8(fucosyltransferase 8, FUT8)基因为敲除基因作为模型,利用CRISPR/Cas9技术建立定点同步敲入敲除基因编辑策略。利用该策略获得的单克隆细胞株Bcl-2蛋白过表达且FUT8蛋白酶功能缺失。经传代培养发现,由建立的定点同步敲入敲除基因编辑策略获得的细胞株在60 d内所编辑的基因表达稳定。相较于原野生型细胞,该细胞株表现出对血清剥夺的耐受度更高以及对死亡的抵抗能力更强。由此说明基于定点同步敲入敲除基因编辑策略具备一定可行性,可用于重组蛋白生产的CHO工程细胞株的构建。 展开更多
关键词 中国仓鼠卵巢细胞 CRISPR/Cas9 基因编辑 定点同步 细胞株构建
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山药提取物对CHO细胞生长及抗体表达的影响
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作者 曹丽 罗顺 +5 位作者 邢世海 仇金树 蔺智勇 林军 孟旭 刘峰 《生物技术进展》 2023年第3期449-456,共8页
探究山药提取物(Dioscorea oppsita extract,DOE)对中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)生长及抗体表达的影响。通过添加不同浓度的DOE,采用流加培养的方式,分别测定细胞密度、细胞活力、细胞上清中抗体表达量、单抗体含... 探究山药提取物(Dioscorea oppsita extract,DOE)对中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)生长及抗体表达的影响。通过添加不同浓度的DOE,采用流加培养的方式,分别测定细胞密度、细胞活力、细胞上清中抗体表达量、单抗体含量,检测抗体电荷变体并分析抗体的糖基组成及相对含量和蛋白相对结合活性,以及在细胞生长过程中测定细胞内丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性。结果表明,5 mg·mL^(-1)DOE可以明显地促进CHO细胞的生长,提高活细胞密度、细胞活力和SOD活性并降低MDA含量、提高细胞内抗体和单抗含量。添加DOE在一定程度上能够改变抗体某些糖型含量,且随着DOE浓度的增加,糖型G0F和Man5相对含量呈现先降低后缓慢增加的趋势,G1F糖型含量则逐渐升高,G0则变化较小相对较稳定。添加DOE后,抗体中酸性电荷变体、主峰和碱性电荷变体含量均不存在统计学差异(P>0.05),其抗体相对结合活性均保持在参比品的102%~135%之间,DOE不影响抗体的结合活性。综上所述DOE在细胞培养过程中对细胞的生长、抗体的表达方面发挥着重要作用,添加5 mg·mL^(-1)DOE对细胞生长的促进作用和抗体表达效果最佳,研究结果为中药提取物对CHO细胞的生长及抗体表达方面的研究提供了参考。 展开更多
关键词 山药提取物 cho细胞 细胞生长 抗体 氧化应激
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重组人α-半乳糖苷酶在悬浮CHO-S细胞中的表达、纯化及功能活性鉴定 被引量:1
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作者 邓木兰 周泓宇 +7 位作者 郑可欣 李昭阳 郭婉怡 王艳苹 梁志成 李芳红 穆云萍 赵子建 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期774-781,共8页
目的 运用无血清可高密度悬浮培养的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO-S)表达体系,分泌表达并纯化重组人α-半乳糖苷酶(recombinant human α-galactosidase A, rhα-Gal A),验证其对法布雷病贮积底物神经酰胺三己糖... 目的 运用无血清可高密度悬浮培养的中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO-S)表达体系,分泌表达并纯化重组人α-半乳糖苷酶(recombinant human α-galactosidase A, rhα-Gal A),验证其对法布雷病贮积底物神经酰胺三己糖苷(globotriaosylceramide, Gb3 or GL3)的清除效果。方法 构建人α-半乳糖苷酶基因gla融合6×His标签的表达载体pcDNA4-GLA,将其转染至悬浮CHO-S细胞中,表达纯化并检测rhα-Gal A糖基化形式、表达量及酶活性;通过与人皮肤成纤维细胞共孵育,观察rhα-Gal A是否能被摄取到胞内并有效清除Gb3。结果 研究结果显示,rhα-Gal A成功在CHO-S细胞中表达,表达量最高可达(100±20.6) mg·L^(-1),且rhα-Gal A被糖基化修饰,酶活与商品酶Fabrazyme酶活相近,为(59±9.1) kU·g^(-1);此外,rhα-Gal A能被有效摄取到人成纤维细胞胞内并靶向溶酶体进而有效清除Gb3。结论 利用瞬时转染技术在悬浮CHO-S细胞中成功表达并纯化出rhα-Gal A,具有良好的生物学活性且可有效清除Gb3,为我国法布雷病的酶替代疗法提供新的选择。 展开更多
关键词 重组人α-半乳糖苷酶 法布雷病 酶替代疗法 悬浮cho-S细胞 溶酶体贮积症 基因工程
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水解物对CHO细胞培养工艺的影响
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作者 胡振湘 黄盼盼 +2 位作者 邓钦培 徐乐意 孙梦梅 《中国医药指南》 2023年第34期69-72,共4页
目的对比3种水解物对CHO悬浮培养细胞生长的影响,以及对细胞分泌表达的抗体质量的影响。方法应用3种不同来源的水解物,采用摇瓶培养CHO细胞,观察培养过程中细胞密度、活性和代谢产物的变化,以及抗体质量的影响。结果水解物对CHO生长无... 目的对比3种水解物对CHO悬浮培养细胞生长的影响,以及对细胞分泌表达的抗体质量的影响。方法应用3种不同来源的水解物,采用摇瓶培养CHO细胞,观察培养过程中细胞密度、活性和代谢产物的变化,以及抗体质量的影响。结果水解物对CHO生长无显著促进作用、但可大幅度提高抗体产量;对抗体糖型无显著影响,可显著影响抗体电荷分布。结论3种水解物中,Preteose peptone和Phytone peptone对CHO有很好的促进作用。但Preteose peptone含有动物然产分,随着各国药监对动物来源成分监管制度的严格,将进一步限制Preteose peptone的应用,因此Phytone peptone具有优势。 展开更多
关键词 cho细胞悬浮培养 水解物 糖型 抗体电荷分布
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猪流行性腹泻病毒单克隆抗体8A3的CHO细胞瞬时表达与稳转细胞池构建
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作者 周丽璇 孙玉洁 +3 位作者 张云静 谭菲菲 黄柏成 田克恭 《动物医学进展》 北大核心 2023年第5期1-6,共6页
为实现猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的体外高效表达,首先利用基因工程技术获得了PEDV鼠源mAb 8A3的轻链和重链序列,然后构建真核表达载体pCHO1.0-8A3-H-L,再利用CHO细胞... 为实现猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的体外高效表达,首先利用基因工程技术获得了PEDV鼠源mAb 8A3的轻链和重链序列,然后构建真核表达载体pCHO1.0-8A3-H-L,再利用CHO细胞对mAb 8A3进行瞬时表达,最后经稳定转染以获得稳定表达8A3的CHO细胞池。结果显示,CHO细胞表达的mAb 8A3在免疫印迹和间接免疫荧光分析中均可特异性识别PEDV,且具有正确的IgG抗体构型;且CHO细胞表达的mAb 8A3可以中和G2a、G2b和G1基因型PEDV。实现了PEDV mAb 8A3的CHO瞬时转染表达,并获得了稳定表达8A3的CHO细胞池,为PEDV mAb稳定表达细胞系的筛选奠定了基础,同时为PEDV的诊断和治疗提供了新型基因工程抗体材料。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 单克隆抗体 中国仓鼠肾细胞 瞬时表达 稳定表达
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