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采用Cre-loxP技术构建肝脏特异性Trappc11基因敲除小鼠模型
1
作者 郑帆帆 李霞 +3 位作者 高枫 李梦瑶 杨彦玲 李优磊 《肝脏》 2024年第9期1137-1140,1153,共5页
目的采用Cre-loxP系统构建肝脏组织特异性Trappc11基因敲除小鼠(Trappc11^(flox/flox)-Alb-Cre^(+/-))模型以探究脂肪肝的发病机制。方法用带有loxP位点的Trappc11纯合子小鼠(Trappc11^(flox/flox))和带有Alb-Cre的转基因小鼠(Alb-Cre^(... 目的采用Cre-loxP系统构建肝脏组织特异性Trappc11基因敲除小鼠(Trappc11^(flox/flox)-Alb-Cre^(+/-))模型以探究脂肪肝的发病机制。方法用带有loxP位点的Trappc11纯合子小鼠(Trappc11^(flox/flox))和带有Alb-Cre的转基因小鼠(Alb-Cre^(+/-))进行杂交,对其子代进行基因型鉴定。筛选出Trappc11^(flox/+)-Alb-Cre^(+/-)小鼠,将其与Trappc11^(flox/flox)小鼠进一步杂交可获得Trappc11肝脏特异性敲除鼠。将3~4周龄的Trappc11^(flox/flox)-Alb-Cre^(+/-)、Trappc11^(flox/+)-Alb-^(Cre+/-)和Trappc11^(flox/flox)-Alb-^(Cre-/-)小鼠各3只,提取各组织脏器中的DNA,检测Trappc11的敲除效率和特异性。然后,在mRNA和蛋白质水平进一步验证。于第4周开始监测摄食量和体重等指标。结果我们成功繁育出肝脏特异性Trappc11基因敲除鼠,敲除心、脾、肺、肾、胰腺、肌肉、脂肪和脑组织中该基因表达未受影响,mRNA水平敲除效率达85%以上且TRAPPC11蛋白水平下降。该敲除鼠目前生长状态良好,饮食饮水正常,可用于后期繁殖与机制研究。结论已经构建成功的Trappc11^(flox/flox)-Alb-Cre^(+/-)鼠将为探索Trappc11在肝脏中的生理病理作用提供在体模型。 展开更多
关键词 转运蛋白颗粒复合物亚基11 cre-loxp重组酶系统 组织特异性敲除
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基于CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法的Ddx3x肝脏条件性敲除小鼠模型的构建与鉴定
2
作者 潘桢桢 徐玲 +5 位作者 张向颖 高耀 田原 范子豪 曹亚玲 任锋 《胃肠病学和肝病学杂志》 CAS 2024年第10期1275-1280,共6页
目的采用CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法构建DEAD-box RNA解旋酶3X连锁(DEAD-box RNA helicase 3X-linked,Ddx3x)肝脏条件性敲除小鼠。方法设计特异的sgRNA序列,在Ddx3x基因外显子4~10两端插入LoxP序列,构建Ddx3x-flox小鼠。采用PCR方法... 目的采用CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法构建DEAD-box RNA解旋酶3X连锁(DEAD-box RNA helicase 3X-linked,Ddx3x)肝脏条件性敲除小鼠。方法设计特异的sgRNA序列,在Ddx3x基因外显子4~10两端插入LoxP序列,构建Ddx3x-flox小鼠。采用PCR方法对F0代和F1代小鼠进行基因鉴定。将Ddx3x-flox F1代小鼠与特异性表达Alb-Cre的工具鼠交配,获得肝脏条件性敲除Ddx3x基因小鼠(Ddx3x^(Δhep))。采用PCR方法和Western blotting方法分别检测Ddx3x^(Δhep)基因小鼠目的基因与蛋白的表达。选取8周龄雄性野生型C57/6J小鼠、Ddx3x^(Δhep)小鼠、Ddx3x^(fl/fl)小鼠,测定血清ALT、AST水平评价肝脏肝损伤情况。结果对F1代小鼠基因PCR鉴定的结果表明,基因型符合Ddx3x^(fl/fl);F1代小鼠与Alb-Cre小鼠杂交,子代与Ddx3x^(fl/fl)小鼠杂交,即获得Ddx3x^(Δhep)小鼠;PCR与Western blotting结果显示,目的小鼠肝组织中Ddx3x基因和蛋白表达显著降低。此外,Ddx3x^(Δhep)小鼠无胚胎致死现象,出生后生理状况良好。正常饲养条件下,Ddx3x^(Δhep)小鼠与Ddx3x^(fl/fl)小鼠及野生型小鼠相比,血清ALT、AST指标及体质量差异均无统计学意义(P>0.05)。结论基于CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法成功构建了Ddx3x^(Δhep)小鼠动物模型,为后续研究Ddx3x在肝脏中的生物学功能及作用机制奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9技术 cre-loxp系统 Ddx3x 肝脏条件性敲除小鼠
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基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠
3
作者 杨坤 章容 +4 位作者 吴越 雷小平 谌云川 康兰 董文斌 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2025年第14期2943-2950,共8页
背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP... 背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/-)小鼠;将Sftpc-Cre^(+/+)小鼠与野生型小鼠交配获得更多的Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。将Sftpc-Cre^(+/+)或子代Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/-)或子代SENP1^(flox/flox)小鼠进行杂交,获得SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)双杂合小鼠。将SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/flox)小鼠杂交,获得SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。剪鼠尾提取基因组DNA,行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定小鼠基因型。取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织行免疫荧光双标实验及Western blot以验证SENP1敲除效果;取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠心、肝、肺、肾组织行苏木精-伊红染色以观察两组小鼠各脏器的组织形态。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳正确筛选出SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。免疫荧光双标实验显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度降低(P<0.01),且SENP1和Sftpc未见明显共定位(P<0.01)。Western blot结果显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P<0.001)。苏木精-伊红染色结果显示SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠的心、肝、肺和肾脏组织形态无明显改变。该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠,为后续研究SENP1基因在以肺泡Ⅱ型上皮细胞为主要损伤细胞的肺疾病如支气管肺发育不良、特发性肺纤维化中的作用提供了良好的工具。 展开更多
关键词 SENP1 cre-loxp重组酶系统 肺泡Ⅱ型上皮细胞 条件性基因敲除 小鼠
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应用Cre-LoxP系统构建牛结节性皮肤病病毒缺失TK基因毒株
4
作者 张玉哲 任善会 +10 位作者 姚威 龚真莉 张红强 柳民意 尤婷 王相伟 李积雲 殷相平 孙跃峰 陈豪泰 万学瑞 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4517-4529,共13页
利用同源重组技术及Cre-LoxP系统平台,构建牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)缺失TK基因毒株,为研制出安全、高效的LSDV基因工程疫苗提供备选毒株。以TK基因为靶基因,利用Cre-LoxP系统平台,红色荧光蛋白(RFP)为筛选标... 利用同源重组技术及Cre-LoxP系统平台,构建牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)缺失TK基因毒株,为研制出安全、高效的LSDV基因工程疫苗提供备选毒株。以TK基因为靶基因,利用Cre-LoxP系统平台,红色荧光蛋白(RFP)为筛选标记,采用重叠PCR方法扩增左、右同源臂以及RFP基因表达框并进行融合,将其克隆至pUC19T载体,构建基因缺失转移载体pUC19T-LSDV-ΔTK-RFP。将转移载体重组质粒转染至Vero细胞,并感染LSDV/CHA/FJ/2021毒株,构建LSDV-ΔTK-RFP重组病毒。采取蚀斑法、有限稀释法纯化LSDV-ΔTK-RFP。然后,利用Cre-LoxP系统,在MDBK-Cre细胞中从病毒基因组中切除RFP标签,采取蚀斑法和有限稀释法筛选并纯化LSDV-ΔTK毒株。利用PCR及测序方法对重组毒株进行鉴定,并测定其一步生长曲线。结果表明成功构建缺失TK基因的重组毒株(LSDV-ΔTK),重组毒株复制力略低于野生毒株。应用Cre-LoxP系统构建的缺失TK基因LSDV毒株,具有良好的遗传稳定性和复制生长特性,为后续LSDV基因工程疫苗的研制提供了候选毒株,同时拓展了Cre-LoxP系统的应用范围。 展开更多
关键词 牛结节性皮肤病病毒 TK基因 CRE/LOXP系统 重组毒株
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利用Cre-Loxp技术构建标记肝星状细胞的小鼠模型 被引量：1
5
作者 黄紫薇 赵殿元 +1 位作者 徐龙 唐丽 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2023年第7期1065-1070,共6页
目的通过Cre-Loxp技术构建转基因小鼠,应用Lrat^(Cre)工具鼠示踪肝星状细胞分布。方法将Lrat^(Cre)小鼠与H11^(LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato)报告基因小鼠交配,通过PCR鉴定得Lrat^(Cre)H11^(LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato)报告... 目的通过Cre-Loxp技术构建转基因小鼠,应用Lrat^(Cre)工具鼠示踪肝星状细胞分布。方法将Lrat^(Cre)小鼠与H11^(LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato)报告基因小鼠交配,通过PCR鉴定得Lrat^(Cre)H11^(LoxP-ZsGreen-Stop-LoxP-tdTomato)报告基因小鼠。固定小鼠肝脏切片,借助免疫荧光标记肝脏非实质细胞抗体,通过Imaris 3D还原分析肝星状细胞和其他肝脏非实质细胞间的表达与分布,以及进行肝星状细胞的自定位检验。结果Lrat^(Cre)介导的红色荧光蛋白tdTomato的表达可以特异性标记肝星状细胞,并通过肝星状细胞与肝脏巨噬细胞、肝窦内皮细胞的免疫荧光定位为细胞间相互作用分析提供了途径。结论Lrat^(Cre)可以介导tdTomato对肝星状细胞进行示踪,同时可用做肝星状细胞特异性的报告基因工具鼠。 展开更多
关键词 肝星状细胞 肝脏巨噬细胞 肝窦内皮细胞 报告基因小鼠 cre-loxp
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基于Cre-LoxP系统构建一种新的时间特异性突变NLRP3转基因小鼠模型
6
作者 杨熙玥 周永婷 +1 位作者 叶菜英 朱蕾 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期594-598,共5页
目的应用Cre-LoxP系统构建一种新的时间特异性NLRP3点突变转基因小鼠模型并对其进行鉴定。方法利用Cre-LoxP技术,构建NLRP3基因T346M点突变的flox杂合子(NLRP3^(flox)/+)小鼠。将该小鼠与广谱表达Cre重组酶工具鼠(CAG-Cre/ERT2,CreT)杂... 目的应用Cre-LoxP系统构建一种新的时间特异性NLRP3点突变转基因小鼠模型并对其进行鉴定。方法利用Cre-LoxP技术,构建NLRP3基因T346M点突变的flox杂合子(NLRP3^(flox)/+)小鼠。将该小鼠与广谱表达Cre重组酶工具鼠(CAG-Cre/ERT2,CreT)杂交繁育,获得基因型NLRP3^(flox)/+CreT^(+/-)小鼠,后者与NLRP3 T346M的flox纯合子(NLRP3^(flox)/flox)小鼠进一步交配获得NLRP3^(flox)/flox CreT^(+/-)(KI/KI)和NLRP3^(flox)/+CreT^(+/-)(KI/WT)小鼠,于6~8周时经他莫昔芬的诱导实现NLRP3 T346M突变基因的时间特异性敲入。小鼠繁育和鉴定过程中,用PCR方法检测鼠尾基因组DNA。采用Western blot法检测小鼠肝脏和心脏中NLRP3、pro-Caspase-1和Caspase-1的蛋白质表达水平。结果小鼠给予他莫昔芬后,NLRP3 T346M突变基因被诱导敲入。Western blot结果显示,KI/KI小鼠肝脏和心脏组织以及KI/WT小鼠心脏中NLRP3炎性小体效应蛋白Caspase-1的表达水平较同窝野生型小鼠显著上调。结论本研究基于Cre-LoxP技术成功构建了NLRP3 T346M突变转基因小鼠模型,该模型小鼠在他莫昔芬诱导后可出现自发性的NLRP3炎症小体活化,这为探究NLRP3炎症小体活化机制以及筛选和评价NLRP3炎症小体抑制剂提供了新的时间特异性的实验动物模型。 展开更多
关键词 NLRP3突变 cre-loxp系统 转基因小鼠 时间特异性 基因型鉴定 表型鉴定
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基于Cre-LoxP系统的B细胞特异性荧光报告基因小鼠模型的构建及鉴定 被引量：2
7
作者 吴孟瑶 张雪婷 +1 位作者 程倩倩 张纪岩 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2023年第5期361-367,共7页
目的应用Cre^(-)LoxP重组酶系统构建B细胞特异性表达tdTomato蛋白的荧光报告基因小鼠。方法在Gt(ROSA)26Sor(Rosa26)位点插入1个由CAG启动子驱动的报告基团,其LoxP侧翼设计有STOP盒,可阻止tdTomato荧光蛋白表达,经与CD19-Cre工具小鼠交... 目的应用Cre^(-)LoxP重组酶系统构建B细胞特异性表达tdTomato蛋白的荧光报告基因小鼠。方法在Gt(ROSA)26Sor(Rosa26)位点插入1个由CAG启动子驱动的报告基团,其LoxP侧翼设计有STOP盒,可阻止tdTomato荧光蛋白表达,经与CD19-Cre工具小鼠交配繁殖获得tdTomato^(CD19-Cre)小鼠,Cre重组酶特异性识别LoxP序列,删除STOP盒,从而使B细胞特异性表达tdTomato荧光蛋白。利用PCR进行基因型鉴定。通过流式细胞术和脑膜免疫荧光分别检测野生型对照组小鼠和tdTomato^(CD19-Cre)荧光报告基因小鼠脾和脑膜B细胞中tdTomato红色荧光蛋白表达。结果基因型为tdTomato^(F/-)CD19-Cre^(+)或tdTomatoF/FCD19-Cre^(+)的小鼠为B细胞特异性表达tdTomato天然红色荧光蛋白的荧光报告基因小鼠。而对照组小鼠基因型为tdTomato^(F/-)CD19-Cre^(-)或tdTomatoF/FCD19-Cre^(-)。流式细胞术测定结果表明,与野生型对照组小鼠相比,tdTomato^(CD19-Cre)荧光报告基因小鼠脾中表达tdTomato荧光蛋白的B细胞百分比均显著增加(P<0.01);在非B细胞群中仅检测到少量的tdTomato+细胞。且在滤泡型B细胞、边缘区B细胞、T1 B细胞、T2 B细胞和成熟B细胞等B细胞亚群细胞表面tdTomato荧光蛋白均能稳定表达(P<0.01),百分比分别为(88±8)%,(80±9)%,(86±9)%,(92±6)%和(89±7)%。通过与CD45共定位,在tdTomato^(CD19-Cre)荧光报告基因小鼠脑膜中也检测到tdTomato红色荧光蛋白表达。结论成功构建B细胞特异性表达tdTomato荧光蛋白的荧光报告基因小鼠模型,且tdTomato荧光蛋白可在外周免疫器官和中枢神经系统稳定表达。 展开更多
关键词 cre-loxp系统 tdTomato荧光蛋白 B细胞
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CRISPR/Cas9联合Cre-Loxp系统建立VASN条件敲除的小鼠肝细胞系
8
作者 甘暨 杨丽超 +3 位作者 张起 孙俊铭 张俊 何敏 《广西医科大学学报》 CAS 2023年第2期173-181,共9页
目的:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统的条件性敲除策略构建VASN基因敲除的AML12小鼠肝细胞株。方法:在VASN基因第二外显子上下游设计靶点并合成gRNA序列,构建2个CRISPR/Cas9重组载体;设计构建VASN上下游分别带有Loxp序列和旁侧同... 目的:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统的条件性敲除策略构建VASN基因敲除的AML12小鼠肝细胞株。方法:在VASN基因第二外显子上下游设计靶点并合成gRNA序列,构建2个CRISPR/Cas9重组载体;设计构建VASN上下游分别带有Loxp序列和旁侧同源序列的供体载体donor DNA质粒;将3个质粒共转染至小鼠肝细胞AML12中,分离单克隆,提取基因组DNA,经PCR及测序鉴定获得稳定敲入Loxp序列的单克隆细胞株AML12-Loxp;将pALB-Cre质粒转染至AML12-Loxp,筛选建立敲除VASN基因的细胞系。结果:成功构建2个靶向敲除VASN基因的pX459-gRNA-VASN-1和pX459-gRNAVASN-2重组载体及一个供体载体;转染药筛后获得12个单细胞克隆,经测序,5个单克隆细胞实现VASN基因上下游精确敲入Loxp序列;同源重组敲入效率为41.6%;pALB-Cre质粒转染后获得20个单细胞克隆,经PCR和测序获得12个VASN基因敲除的单克隆细胞,敲除效率为60%。结论:利用CRISPR/Cas9技术联合Cre-Loxp系统成功构建了VASN基因敲除的AML12细胞,为后续体外研究VASN在肝细胞中的功能及在动物体内实现VASN的条件性敲除奠定了分子基础。 展开更多
关键词 VASN CRISPR/Cas9 cre-loxp系统 条件性敲除 AML12细胞
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Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除 被引量：4
9
作者 王艳春 姜娜 +6 位作者 展德文 邱炎 袁盛凌 陶好霞 王令春 张兆山 刘纯杰 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2009年第7期934-940,共7页
将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B.anthracisAP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记... 将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B.anthracisAP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌.然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行了系统的鉴定.最终建立了Cre-LoxP系统在B.anthracis中的应用方法,并成功敲除eag基因. 展开更多
关键词 炭疽芽胞杆菌 cre-loxp系统 eag基因 同源重组 基因敲除
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基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因小鼠的建立 被引量：4
10
作者 刘甦苏 吴曦 +4 位作者 周舒雅 王辰飞 左琴 李保文 范昌发 《实验动物科学》 2018年第4期21-28,共8页
目的构建基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因(c-Ha-ras)的小鼠,以获得hRas基因在特定组织器官条件性表达的小鼠模型,用于药物的临床前致癌性安全评价及相关机制研究。方法首先构建hRas打靶载体,电击法转染入小鼠胚胎干细胞(E... 目的构建基于Cre-LoxP系统的条件性定点敲入人源hRas基因(c-Ha-ras)的小鼠,以获得hRas基因在特定组织器官条件性表达的小鼠模型,用于药物的临床前致癌性安全评价及相关机制研究。方法首先构建hRas打靶载体,电击法转染入小鼠胚胎干细胞(ES细胞),用正负法筛选阳性ES细胞,通过PCR、Southern鉴定后,将正确重组hRas基因的ES细胞导入C57BL/6 J小鼠囊胚,移入同步发育的受体鼠子宫,妊娠足月出生的嵌合体小鼠与C57BL/6 J小鼠交配获得杂合子hRasfl/+小鼠。再将杂合子hRasfl/+小鼠间交配获得纯合子小鼠hRasfl/fi,然后与全身组织细胞表达Cre重组酶的Tg(EIIa-cre)小鼠进行交配,获得全身细胞表达hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,并通过荧光定量PCR方法检测不同日龄胚胎期仔鼠的hRas基因表达水平。结果成功构建了基于Cre-LoxP系统的人源hRas基因条件性定点敲入小鼠模型的载体,筛选得到的一个正确克隆,电转ES细胞后进行Southern blot鉴定,经过初筛和复筛,共获得12个阳性克隆,挑选A11号克隆ES细胞进行囊胚注射,移植了48枚胚胎,出生9只小鼠,其中6只为嵌合鼠,将嵌合率>50%的雄鼠与野生型C57BL/6 J雌鼠进行交配,出生21只后代,其中鉴定有4只hRasfl/+小鼠;hRasfl/+小鼠间交配出生29只小鼠,其中有14只纯合子hRasfl/fi小鼠;hRasfl/fl小鼠与Tg(EIIa-cre)工具鼠交配6次,未有仔鼠出生;跟踪不同发育时期胚胎中hRas基因的表达发现,E10.5~15.5 d胚胎中检测到hRas基因表达。结论成功建立运用Cre-LoxP系统建立了带有hRas基因敲入的纯合子小鼠hRasfl/fl,未能得到全身细胞高效表达人源hRas基因的hRas-EIIa-cre小鼠,但为进一步利用hRasfl/fl小鼠模型建立其他组织特异性的条件性基因敲入小鼠模型做好技术储备。 展开更多
关键词 条件性基因敲入 hRas基因 cre-loxp系统 癌症
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利用可视化标记建立Cre-loxP介导的抗生素删除载体系统并应用于玉米转基因研究 被引量：1
11
作者 薛静 杨凤萍 +2 位作者 陈绪清 宫硖 张晓东 《分子植物育种》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期404-410,共7页
本研究通过Cre-loxP系统,构建了Kan基因的删除载体系统,利用花青素合成途径中转录因子的表达指示删除的效果。首先,利用两次PCR方法对pGreen载体进行改造,在卡那霉素抗性(Kan)基因的两侧加入两个同向的loxP位点,在多克隆位点前插入5-烯... 本研究通过Cre-loxP系统,构建了Kan基因的删除载体系统,利用花青素合成途径中转录因子的表达指示删除的效果。首先,利用两次PCR方法对pGreen载体进行改造,在卡那霉素抗性(Kan)基因的两侧加入两个同向的loxP位点,在多克隆位点前插入5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶的表达框作为筛选标记基因,命名为pBAC823。在此载体基础上,构建了两个植物表达载体,组成一个抗生素可删除的载体系统。其一是在pBAC823载体Kan基因的一侧加入花青素合成途径中两个转录因子bi基因和cl基因的表达框,命名为pBAC9008。该载体可以作为基础植物表达载体,用于表达目的基因。其二是含Cre酶基因表达框的植物表达载体。将hsp70启动子驱动的cre基因的表达框插入pBAC823载体Kan基因的一侧,并将玉米花青素基因合成途径中转录因子bi和cl的表达框插入多克隆位点,命名为pBAC9009,此载体作为一个删除载体,单独转化植物,之后可以通过杂交方法删除目的基因表达载体中两个loxP位点之间的Kan基因片段。将上述载体转化玉米幼胚,得到T0代转基因玉米的种子,其中部分籽粒为紫色,分子检测结果表明紫色籽粒有花青素基因的插入,验证了花青素合成基因作为可视化标记的可靠性。本研究采用了可视化标记跟踪外源基因的表达和抗生素抗性基因的删除,不仅大大降低了外源基因的检测成本,为转基因食品安全提供技术保证,在转基因研究中具有重要的意义。 展开更多
关键词 可视化标记 cre-loxp系统 抗生素删除 转基因 玉米
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利用Cre-loxP自动敲除H5亚型禽流感病毒血凝素重组鸡痘病毒中的报告基因 被引量：1
12
作者 高月花 王莉莉 +3 位作者 黄兵 宋敏训 崔言顺 李建亮 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期537-539,共3页
研究去除重组鸡痘病毒中的报告基因,构建一株只含目的基因的重组毒。将H5亚型AIV的HA基因作为靶基因,两侧含loxP序列的GFP表达盒插入鸡痘病毒重组臂基因构建了转移质粒载体,将其与脂质体混合转染CEF细胞,获得了表达H5和GFP的鸡痘病毒重... 研究去除重组鸡痘病毒中的报告基因,构建一株只含目的基因的重组毒。将H5亚型AIV的HA基因作为靶基因,两侧含loxP序列的GFP表达盒插入鸡痘病毒重组臂基因构建了转移质粒载体,将其与脂质体混合转染CEF细胞,获得了表达H5和GFP的鸡痘病毒重组体。通过二次转染,利用Cre酶自动敲除重组病毒中的GFP基因,最终获得了只含H5血凝素基因表达盒的重组鸡痘病毒。免疫荧光和病毒滴度测定结果表明,经过连续传代后重组病毒仍然稳定复制并表达H5血凝素。用105PFU和2×105PFU rFPV H5免疫SPF鸡,28d后,免疫组鸡抗体平均滴度(HI)分别达到4log 2和4.5log 2,结果表明,H5HA基因重组病毒能刺激鸡群产生较高特异抗体。 展开更多
关键词 鸡痘病毒 禽流感病毒 H5血凝素 重组 cre-loxp
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用Cre-Loxp系统构建人胶质瘤单链抗体噬菌体抗体库 被引量：1
13
作者 王彦刚 章翔 +5 位作者 费舟 李兵 郭庆东 刘先珍 张永琴 赵爱志 《第四军医大学学报》 北大核心 2001年第23期2153-2157,共5页
目的　构建人源性胶质瘤噬菌体抗体库 .方法　从胶质瘤患者外周血淋巴细胞中提取细胞总 RNA,经逆转录后用套式 PCR分别扩增抗体轻链 Vκ 和重链 VH 基因 .分别构建 Vκ5 .5× 10 6,VH3.5× 10 6基因库 ,连接 Vκ和 VH构建单链抗... 目的　构建人源性胶质瘤噬菌体抗体库 .方法　从胶质瘤患者外周血淋巴细胞中提取细胞总 RNA,经逆转录后用套式 PCR分别扩增抗体轻链 Vκ 和重链 VH 基因 .分别构建 Vκ5 .5× 10 6,VH3.5× 10 6基因库 ,连接 Vκ和 VH构建单链抗体 (Sc Fv)基因库 ,并克隆入表达载体 p DNA5内进行重组 ,得到 Sc Fv噬菌体抗体库 .结果　表明经 Cre- L oxp5 11系统重组后 ,噬菌体抗体库库容量达到 6 .0× 10 8,测序证实抗体基因与人源性抗体基因数据库同源 .结论　利用 Cre- L oxp5 11胞内重组系统成功地构建了较大容量的人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库 ,为进一步筛选特异性人源性胶质瘤 Sc Fv奠定了基础 . 展开更多
关键词 胶质瘤 噬菌体抗体库 单链抗体 cre-loxp系统
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基于Cre-LoxP系统的新型慢病毒表达载体pLOX-CMV-E/P的构建与鉴定
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作者 高文勇 夏景波 +4 位作者 陈卓莹 吴彩红 王健欢 龙颖妍 齐绪峰 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期160-167,共8页
目的:基于Cre-Lox P系统构建携带EGFP及Puromycin抗性基因,并带有巨细胞病毒(CMV)及翻译延伸因子1α(EF1α)双启动子的新型慢病毒表达载体,为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒载体系统.方法:以已经插入Lox P序列的p LOX-TERT-ire... 目的:基于Cre-Lox P系统构建携带EGFP及Puromycin抗性基因,并带有巨细胞病毒(CMV)及翻译延伸因子1α(EF1α)双启动子的新型慢病毒表达载体,为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒载体系统.方法:以已经插入Lox P序列的p LOX-TERT-ires TK慢病毒载体为模板,用Spe I与Kpn I进行双酶切,去除TERT-ires TK片段,然后与人工设计合成的多克隆位点片段连接,构建p LOX-MCS表达载体.同时,以p B513载体为模板扩增EF1α-EGFP-Puro表达框(带有Bam HI及Kpn I酶切位点),然后与经过Bam HI及Kpn I双酶切的p LOX-MCS载体连接,进而构建p LOX-CMV-EF1α-EGFP-Puro(简称p LOX-CMV-E/P)载体.将p LOX-CMV-E/P载体与慢病毒包装载体p CMVR8.74及p MD2.G共转染293T细胞,包装病毒进行报告基因的功能分析.结果:菌落聚合酶链式反应(PCR)、酶切鉴定及测序结果均与预期结果一致,绿色荧光蛋白及抗药性基因均有较好的活性与功能.结论:成功构建了p LOX-MCS及p LOX-CMV-E/P慢病毒表达载体,为基因治疗及基因功能研究提供有效的慢病毒表达系统. 展开更多
关键词 慢病毒表达载体 cre-loxp 系统 绿色荧光蛋白基因 嘌呤霉素抗性基因
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Cre-loxp系统在构建大库容噬菌体抗体库中的应用
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作者 刘昌来 史建荣 +1 位作者 祭芳 徐剑宏 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2009年第3期695-702,共8页
以杂交瘤细胞技术为基础的单克隆抗体技术已经得到了广泛的应用,但此技术所得抗体要经过动物免疫、细胞融合以及克隆,选择周期长、过程复杂。近年来,噬菌体抗体(Phage antibody libraries)技术发展迅速,用该技术可以不经免疫即可得到大... 以杂交瘤细胞技术为基础的单克隆抗体技术已经得到了广泛的应用,但此技术所得抗体要经过动物免疫、细胞融合以及克隆,选择周期长、过程复杂。近年来,噬菌体抗体(Phage antibody libraries)技术发展迅速,用该技术可以不经免疫即可得到大量的抗体,实现抗体的快速、大量制备。一个有效的抗体库至少要达到109的库容量,抗体库的库容量越高,抗体的亲和性越高。Cre-loxp体内重组系统可以有效增大抗体库的库容性,保证库多样性,因此为高容量抗体库的发展提供了有利的工具。本文介绍了抗体库、Cre-loxp系统以及其在构建大容量抗体库中的应用。 展开更多
关键词 免疫 噬菌体抗体库 cre-loxp系统
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Cre-LoxP重组系统的特点及其在抗体研究中的应用 被引量：2
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作者 李大旭 马静云 曹永长 《生物技术通报》 CAS CSCD 2008年第1期56-60,共5页
Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除,这种定位重组系统在大容量噬菌体抗体库,抗体重... Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除,这种定位重组系统在大容量噬菌体抗体库,抗体重排,抗体的类型转换和抗体修饰等研究领域发挥了重要的作用。 展开更多
关键词 cre-loxp 重组系统 抗体重排 类型转换
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基于Cre-loxP系统条件性基因敲除小鼠的构建及其应用进展 被引量：13
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作者 孔维健 常宇鑫 +2 位作者 昝春芳 郑爽 杨小玉 《中国实验诊断学》 2017年第12期2208-2211,共4页
随着科研技术水平的不断提高,转基因技术在基础实验研究中得到了广泛的应用,基因敲除技术是转基因技术中不可替代的组成部分,而条件性基因敲除技术作为新一代基因敲除技术,与第一代基因敲除技术相比显然有着明显的优势和更为广泛的应用... 随着科研技术水平的不断提高,转基因技术在基础实验研究中得到了广泛的应用,基因敲除技术是转基因技术中不可替代的组成部分,而条件性基因敲除技术作为新一代基因敲除技术,与第一代基因敲除技术相比显然有着明显的优势和更为广泛的应用前景。 展开更多
关键词 基因敲除小鼠 cre-loxp 基因敲除技术 条件性 转基因小鼠模型 重组酶 同源重组 突变基因 目的基因 疾病模型
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Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能评价 被引量：10
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作者 王志蕊 刘西梅 +4 位作者 周荆荣 郑新民 魏庆信 董发明 毕延震 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期194-201,共8页
选择标记的使用和残留可引起消费者对转基因生物环境安全和产品安全的担忧,建立消除选择标记的有效对策甚为必要.本研究的目标是评价Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能,为猪安全转基因研究提供实验依据和技术支撑.本文所用... 选择标记的使用和残留可引起消费者对转基因生物环境安全和产品安全的担忧,建立消除选择标记的有效对策甚为必要.本研究的目标是评价Cre-LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能,为猪安全转基因研究提供实验依据和技术支撑.本文所用的打靶载体ΔMSTN含有LoxP位点锚定的选择标记表达框(LoxP-CMV-NeoR-IRES-EGFP-LoxP).经电穿孔将该打靶载体导入猪肾PK15细胞,经G418筛选,获得稳定整合该载体、EGFP表达均一的单克隆细胞系.将Cre重组酶表达载体pTurbo-Cre导入该细胞系,借助流式分选(FACS)、终点PCR、荧光定量PCR、TA克隆与测序等手段,证明Cre-LoxP重组系统可在猪细胞内高效介导内源性选择标记基因的删除反应,EGFP水平的删除效率达到46.1%,DNA水平的删除效率则达到97%.本文的研究结果为消除选择标记的安全隐患提供了可靠的解决方案,为建立猪安全转基因技术提供了重要的科学依据. 展开更多
关键词 CRE LOXP 安全转基因 选择标记 绿色荧光蛋白 删除
原文传递
利用Cre-loxP系统研究细胞间mRNA的传递 被引量：1
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作者 王梦雪 韩小松 +1 位作者 倪超 王小宁 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期769-775,共7页
目的利用Cre-loxP重组酶系统研究mRNA在细胞间传递过程及意义。方法构建和筛选稳定表达Cre重组酶的供体细胞及稳定表达loxP-DsRed-loxP-eGFP的受体细胞。将供、受体细胞共培养或在Transwell^TM中共培养,设置单独受体细胞组为对照,72 h... 目的利用Cre-loxP重组酶系统研究mRNA在细胞间传递过程及意义。方法构建和筛选稳定表达Cre重组酶的供体细胞及稳定表达loxP-DsRed-loxP-eGFP的受体细胞。将供、受体细胞共培养或在Transwell^TM中共培养,设置单独受体细胞组为对照,72 h后观察统计各组受体细胞eGFP阳性率,利用细胞免疫荧光细胞染色检测eGFP阳性细胞中Cre表达情况,并探讨供体细胞死亡、细胞膜纳米管、Rho相关激酶(ROCK)信号通路对Cre mRNA传递的影响。结果将供、受体细胞共培养72 h后发现,共培养组eGFP为阳性,单独受体细胞组、Transwell^TM共培养组eGFP均为阴性,表明细胞接触可以介导Cre mRNA传递,免疫荧光染色结果显示Cre蛋白可在受体细胞中翻译和入核。此外,Cre mRNA的传递主要通过活细胞,而膜纳米管及ROCK信号通路抑制剂可部分阻滞该过程。结论mRNA可以通过细胞间接触在活细胞中传递,进入受体细胞后还可翻译成蛋白质发挥生物学功能。 展开更多
关键词 细胞接触 mRNA传递 cre-loxp重组酶系统 膜纳米管
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