DREB转录因子在植物逆境胁迫响应中起非常重要的作用,对植物的生长发育起重要的调控作用。传统的DNA酶I足迹法应用同位素标记DNA,采用序列胶分离DNaseI酶切片段,操作较复杂,分辨率较低,不适用于高通量的样品检测。为阐明植物体内DREB转...DREB转录因子在植物逆境胁迫响应中起非常重要的作用,对植物的生长发育起重要的调控作用。传统的DNA酶I足迹法应用同位素标记DNA,采用序列胶分离DNaseI酶切片段,操作较复杂,分辨率较低,不适用于高通量的样品检测。为阐明植物体内DREB转录因子的调控机制,本研究利用改进的DNA酶I足迹法(DNase I foot-printing)结合凝胶阻滞法(electrophoretic mobility shiftassay,EMSA),选用荧光色素代替同位素标记,毛细管电泳技术代替序列胶检测DNaseI酶切片段,判定GmMYB1蛋白与GmDREB3启动子DNA结合的区域。采用限制性内切酶酶切GmDREB3启动子DNA验证以上结果。同时,在判定的GmMYB1结合区域的基础上,选择可能的DNA结合元件与GmMYB1进行EMSA试验,证明GmMYB1可以与相应元件结合。该方法比传统的DNA酶I足迹法快速、简便、准确并可靠,作为一种高通量的鉴定方法可用于大规模鉴定蛋白质的DNA结合位点。展开更多
文摘凝胶阻滞实验(gel retardation),又称为电泳迁移率变动实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA),是研究蛋白和DNA相互作用的一种技术。传统的32P标记探针的凝胶阻滞实验,具有很高的灵敏度,然而也有接触危险性的放射性同位素且不容易定量分析的缺点。最近利用非放射性标记的凝胶阻滞实验,已有很多成功的报道,该方法快捷,安全,灵活,但非放射性标记探针的凝胶阻滞试剂盒的费用却很高。在论文中,我们提供了一种改造地高辛标记DNA和检测试剂盒用于凝胶阻滞实验的新方法。首先将双链DNA探针末端引入EcoRⅠ粘性末端以便进行3′末端标记,然后利用价格比较便宜的地高辛标记DNA和检测试剂盒(DIG High Prime DNA Labeling andDetection Starter KitⅡ,Rohe)进行探针标记和凝胶阻滞信号检测。经过多次实验参数的摸索,最终得到了成功的结果,为利用地高辛标记DNA和检测试剂盒进行凝胶阻滞实验提供了成功的例子和方法。
文摘DREB转录因子在植物逆境胁迫响应中起非常重要的作用,对植物的生长发育起重要的调控作用。传统的DNA酶I足迹法应用同位素标记DNA,采用序列胶分离DNaseI酶切片段,操作较复杂,分辨率较低,不适用于高通量的样品检测。为阐明植物体内DREB转录因子的调控机制,本研究利用改进的DNA酶I足迹法(DNase I foot-printing)结合凝胶阻滞法(electrophoretic mobility shiftassay,EMSA),选用荧光色素代替同位素标记,毛细管电泳技术代替序列胶检测DNaseI酶切片段,判定GmMYB1蛋白与GmDREB3启动子DNA结合的区域。采用限制性内切酶酶切GmDREB3启动子DNA验证以上结果。同时,在判定的GmMYB1结合区域的基础上,选择可能的DNA结合元件与GmMYB1进行EMSA试验,证明GmMYB1可以与相应元件结合。该方法比传统的DNA酶I足迹法快速、简便、准确并可靠,作为一种高通量的鉴定方法可用于大规模鉴定蛋白质的DNA结合位点。
