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牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的克隆及原核表达分析 被引量：3
1
作者 贾立军 张守发 李男礼 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期773-775,共3页
为了解牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的生物学特性,本实验采用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫NcGRA7基因,并连接至pMD-18T载体中,构建重组质粒pMD18-NcGRA7,经PCR、酶切鉴定及测序分析,将NcGRA7基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达... 为了解牛源犬新孢子虫NcGRA7基因的生物学特性,本实验采用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫NcGRA7基因,并连接至pMD-18T载体中,构建重组质粒pMD18-NcGRA7,经PCR、酶切鉴定及测序分析,将NcGRA7基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-NcGRA7,转化大肠杆菌BL21,筛选阳性克隆,将PCR和酶切鉴定正确的重组质粒进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE和western blot分析表达产物。结果表明,扩增的NcGRA7基因片段大小为701 bp,编码233个氨基酸,与GenBank中登录的NcGRA7(AF176649)核苷酸序列同源性为98.7%;western blot分析表达蛋白的分子量为52 ku,具有较好的反应原性。本实验为犬新孢子虫NcGRA7基因疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 牛 犬新孢子虫 ncgra7 原核表达
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新孢子虫NcGRA7基因酵母双杂交诱饵载体的构建与鉴定 被引量：1
2
作者 吴保义 陈正鹏 +3 位作者 李红旺 金春梅 梁晚枫 于龙政 《延边大学农学学报》 2018年第2期49-52,60,共5页
为筛选能与新孢子虫NcGRA7蛋白相互作用的靶蛋白,构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcGRA7。应用PCR技术从新孢子虫基因组DNA中扩增出NcGRA7基因,将其克隆至pMD-19T(simple)中,经过酶切鉴定后再连接至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上。结果表... 为筛选能与新孢子虫NcGRA7蛋白相互作用的靶蛋白,构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcGRA7。应用PCR技术从新孢子虫基因组DNA中扩增出NcGRA7基因,将其克隆至pMD-19T(simple)中,经过酶切鉴定后再连接至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上。结果表明:试验成功获得了NcGRA7基因片段,测序结果中序列无碱基突变,与目标基因序列同源为100%。试验成功构建的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcGRA7,为使用酵母双杂交技术筛选与NcGRA7蛋白相互作用的蛋白奠定基础。 展开更多
关键词 酵母双杂交 新孢子虫 ncgra7基因 诱饵载体
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新孢子虫致密颗粒蛋白截短型NcGRA7t的体外表达及免疫活性检测 被引量：1
3
作者 金春梅 于龙政 张守发 《畜牧与兽医》 北大核心 2012年第12期57-59,共3页
为构建新孢子虫致密颗粒截短型NcGRA7t基因的原核表达质粒,研究其在体外细胞中的表达情况和免疫活性,运用PCR方法和基因克隆技术,构建了pGEX-4T3-NcGRA7t重组质粒,并在大肠杆菌中进行诱导蛋白表达,用SDS-PAGE和Western blot检测重组蛋... 为构建新孢子虫致密颗粒截短型NcGRA7t基因的原核表达质粒,研究其在体外细胞中的表达情况和免疫活性,运用PCR方法和基因克隆技术,构建了pGEX-4T3-NcGRA7t重组质粒,并在大肠杆菌中进行诱导蛋白表达,用SDS-PAGE和Western blot检测重组蛋白在体外的表达情况和免疫活性。结果显示:以新孢子虫的cDNA为模板,从新孢子虫Nc-1株扩增出了NcGRA7t基因,并克隆到了表达载体上。本试验成功构建了重组表达质粒pGEX-4T3-NcGRA7t,表达出的NcGRA7t重组蛋白具有免疫活性,为新孢子虫病的流行病学调查和亚单位疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 新孢子虫 ncgra7t 体外表达 免疫活性
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牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7融合基因的克隆与生物信息学分析
4
作者 贾立军 张守发 谷振甲 《畜牧与兽医》 北大核心 2013年第1期25-28,共4页
为了解牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7融合基因的生物学特性,本试验提取牛源犬新孢子虫基因组DNA,应用PCR技术扩增犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS2和致密颗粒蛋白基因NcGRA7,SOE-PCR技术拼接NcSRS2和NcGRA7基因,构建NcSRS2-NcGRA7融合基因... 为了解牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7融合基因的生物学特性,本试验提取牛源犬新孢子虫基因组DNA,应用PCR技术扩增犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS2和致密颗粒蛋白基因NcGRA7,SOE-PCR技术拼接NcSRS2和NcGRA7基因,构建NcSRS2-NcGRA7融合基因重组克隆质粒,并进行PCR鉴定、双酶切鉴定及生物信息学分析。结果,NcSRS2基因扩增片段大小为1 061 bp,NcGRA7基因扩增片段大小为364 bp,NcSRS2-NcGRA7融合基因扩增片段大小为1 482 bp;获得重组克隆质粒pMD18-NcSRS2-NcGRA7经PCR鉴定、双酶切鉴定正确;测序分析表明,与Gen-Bank中已发表的美国株犬新孢子虫(AF061249、AF176649)核苷酸序列同源性为99%;经DNAman等软件分析,预测NcSRS2-NcGRA7融合蛋白抗原指数较高,融合蛋白二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,三级结构中2种蛋白独立折叠,并借助Linker互相连接,功能互不影响。本试验为牛源犬新孢子虫NcSRS2-NcGRA7融合蛋白的免疫学研究奠定了基础。 展开更多
关键词 牛 犬新孢子虫 NcSRS2-ncgra7 克隆 生物信息学
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新孢子虫致密颗粒7和鼠白介素18融合蛋白的表达及鉴定
5
作者 李利山 王晓岑 +3 位作者 杨升 宫鹏涛 李建华 张西臣 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第2期151-154,160,共5页
目的获取新孢子虫致密颗粒7和鼠白介素18(NcGRA7-MouseIL-18)重组基因,表达NcGRA7-MouseIL-18融合蛋白并进行纯化。方法以新孢子虫的cDNA和鼠巨噬细胞的cDNA为模板,采用PCR技术及无缝克隆技术(In-Fusion Cloning)扩增NcGRA7-MouseIL-18... 目的获取新孢子虫致密颗粒7和鼠白介素18(NcGRA7-MouseIL-18)重组基因,表达NcGRA7-MouseIL-18融合蛋白并进行纯化。方法以新孢子虫的cDNA和鼠巨噬细胞的cDNA为模板,采用PCR技术及无缝克隆技术(In-Fusion Cloning)扩增NcGRA7-MouseIL-18基因片段,构建pET-32a-NcGRA7-MouseIL-18重组表达质粒,转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,诱导表达目的蛋白NcGRA7-MouseIL-18,进行SDS-PAGE和Western blot分析;采用Ni-NTA亲和层析柱纯化NcGRA7-MouseIL-18蛋白,并纯化蛋白进行Western blot鉴定。结果酶切和基因测序鉴定质粒pET-32a-NcGRA7-MouseIL-18构建正确,表达带His标签的相对分子质量约70×10~3的可溶性NcGRA7-MouseIL-18蛋白,与预期值相符;未纯化和纯化的融合蛋白均可被鼠抗His单抗识别。结论成功构建了pET-32a-NcGRA7-MouseIL-18重组质粒,表达的NcGRA7-MouseIL-18融合蛋白具有反应原性。 展开更多
关键词 新孢子虫 ncgra7-MouseIL-18 原核表达 纯化
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