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利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因
被引量：
6
1
作者
王强
郭忠建
+2 位作者
姚勤
王海燕
陈克平
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2007年第5期801-805,共5页
用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPVorf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPVbacmid,将其电转化到含有质粒pKD46(能表达Red重组酶)的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于B...
用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPVorf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPVbacmid,将其电转化到含有质粒pKD46(能表达Red重组酶)的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物(5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列),以pKD3质粒(含cat)为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPVbacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPVorf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。
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关键词
RED重组系统
orf60
基因敲除
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职称材料
杆状病毒Ac60基因的原核表达与亚细胞定位研究
2
作者
李玲玲
李朝飞
+1 位作者
庞义
杨凯
《微生物学杂志》
CAS
CSCD
2009年第4期20-23,共4页
用PCR方法从AcMNPV基因组中扩增到ORF60基因,插入原核表达载体pET-28a(+),构建pET-Ac60质粒,再将该质粒转化大肠埃希菌BL21,在IPTG诱导下表达了分子量约为16 ku的融合蛋白。用纯化的表达产物免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,应用该抗...
用PCR方法从AcMNPV基因组中扩增到ORF60基因,插入原核表达载体pET-28a(+),构建pET-Ac60质粒,再将该质粒转化大肠埃希菌BL21,在IPTG诱导下表达了分子量约为16 ku的融合蛋白。用纯化的表达产物免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,应用该抗体检测了AcMNPV感染的昆虫宿主细胞(Sf9)中ORF60基因的表达,结果显示:在感染后的细胞中有2条分子量分别约为33 ku和17 ku蛋白质带能与所制备的抗体发生特异性反应。间接免疫荧光分析发现:在病毒感染的晚期,Ac60蛋白同时存在于所感染宿主的细胞核和细胞质中。
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关键词
苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒
orf60
原核表达
亚细胞定位
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职称材料
题名
利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因
被引量：
6
1
作者
王强
郭忠建
姚勤
王海燕
陈克平
机构
江苏大学生命科学研究院
出处
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2007年第5期801-805,共5页
基金
江苏大学高级人才基金(No.1283000169)
国家重点基础研究发展计划(973)项目(No.2005CB121000)~~
文摘
用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPVorf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPVbacmid,将其电转化到含有质粒pKD46(能表达Red重组酶)的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物(5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列),以pKD3质粒(含cat)为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPVbacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPVorf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。
关键词
RED重组系统
orf60
基因敲除
Keywords
λ Red recombination system,
orf60
,gene disruption
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
杆状病毒Ac60基因的原核表达与亚细胞定位研究
2
作者
李玲玲
李朝飞
庞义
杨凯
机构
中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室
华南师范大学激光生命科学教育部重点实验室
出处
《微生物学杂志》
CAS
CSCD
2009年第4期20-23,共4页
基金
国家重大基础研究项目(G2000016209)
文摘
用PCR方法从AcMNPV基因组中扩增到ORF60基因,插入原核表达载体pET-28a(+),构建pET-Ac60质粒,再将该质粒转化大肠埃希菌BL21,在IPTG诱导下表达了分子量约为16 ku的融合蛋白。用纯化的表达产物免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,应用该抗体检测了AcMNPV感染的昆虫宿主细胞(Sf9)中ORF60基因的表达,结果显示:在感染后的细胞中有2条分子量分别约为33 ku和17 ku蛋白质带能与所制备的抗体发生特异性反应。间接免疫荧光分析发现:在病毒感染的晚期,Ac60蛋白同时存在于所感染宿主的细胞核和细胞质中。
关键词
苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒
orf60
原核表达
亚细胞定位
Keywords
Autographa californica nucleopolyhedrovirus
orf60
prokaryotic expression
antiserum prepatation
subcellular localization
分类号
Q93 [生物学—微生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因
王强
郭忠建
姚勤
王海燕
陈克平
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2007
6
下载PDF
职称材料
2
杆状病毒Ac60基因的原核表达与亚细胞定位研究
李玲玲
李朝飞
庞义
杨凯
《微生物学杂志》
CAS
CSCD
2009
0
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职称材料
已选择
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