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Expression of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus ORF7 Gene and Purification and Immunological Activity Analysis of the Recombinant Protein 被引量:14
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作者 张永富 韩春华 +12 位作者 林健 刘月焕 韦海涛 祝俊杰 赵景义 李栋梁 马国文 布日额 李明刚 张婷 刘永宏 马明 张秋雨 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2009年第2期62-67,72,共7页
[Objective] The aim of this study was to realize efficient expression of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) ORF7 gene in genetic engineering bacteria and analYze the immunological activi... [Objective] The aim of this study was to realize efficient expression of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) ORF7 gene in genetic engineering bacteria and analYze the immunological activity of the recombinant protein after purification. [ Method] The constructed recombinant expression vector pET-ORF7 was transformed into Escherichia co1BL21 (DE3) and induced by IPTG under the optimal condition. After analysis of SDS-PAGE and Western Blot, the expression products were purified by Ni-NTA His · Bind Resin chrom- atographic column under denaturing condition and renatured by gradient dialysis. Subsequently, the immunological activity of the renatured recombinant protein was detected by Westem Blot and indirect ELISA. [ Result] The recombinant plasmid pET-ORF7 expressed in E. coli successfully, and the fusion protein was in the form of inclusion body. By SDS-PAGE detection, the molecular weight of the expression protein was approximate 33 kD, according with the expectation. Analysis by Bandscan software showed that the expressed fusion protein was about 50% of total bacterial protein of BL21 (DE3). Wastem Blot and indirect ELISA detection showed that the renatured protein could react with PRRSV positive serum specifically, indicating its good immunological activity. [ Conclusion] This study lays a foundation for the preparation of PRRSV monoclonal antibody and diagnostic kit. 展开更多
关键词 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus orf7 gene EXPRESSION PURIFICATION Immunological activity
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基于ORF7基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-RAA检测方法的建立
2
作者 于娜 马佳镁 +6 位作者 张紫薇 黄春媛 范悦轩 郑佳馨 张艳 刘光亮 曹宗喜 《动物医学进展》 北大核心 2024年第8期117-119,共3页
根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)... 根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)copies/μL;与PRVBartha-K61、PCV、CSFV、PRRSVGD、PRRSVXH-GD、PRRSVGM2、PRRSVCH-1a病毒均无交叉反应。分别对157份样品进行荧光RT-RAA法与PCR方法的检测进行比对,结果显示,荧光RT-RAA法敏感性为94.0%,特异性为100%。建立的PRRSV荧光RT-RAA法操作简便,特异性强,灵敏度高。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 orf7基因 反转录-重组酶介导等温扩增 特异性 灵敏度
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因实时荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 安乐乐 罗迅 +2 位作者 杨宣叶 胡欣妍 赵永清 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第9期1681-1688,共8页
为建立一种快速、高效检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank公布的中国流行PRRSV病毒株基因序列,制备包含PRRSV ORF7基因的重组质粒标准品,同时,针对PRRSV保守区域ORF7基因序列设计特异性引物和探... 为建立一种快速、高效检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank公布的中国流行PRRSV病毒株基因序列,制备包含PRRSV ORF7基因的重组质粒标准品,同时,针对PRRSV保守区域ORF7基因序列设计特异性引物和探针,并优化引物和探针终浓度,建立PRRSV Taq Man实时荧光定量PCR检测方法。以质粒标准品为模板构建检测方法线性模型,评估灵敏度、重复性和特异性,并在疑似临床样品中初步应用。本研究建立的PRRSV Taq Man荧光定量PCR检测方法线性关系良好,线性决定系数为0.9975;病毒载量检测限度为1μL 3.32×10^(1)拷贝;变异系数在组内和组间重复中均小于1.500%;仅与PRRSV发生特异性反应,未与其他病毒发生交叉反应。临床样品qPCR检测阳性率为36.92%,高于PCR检测阳性率(26.15%),阳性符合率为100%。基于PRRSV ORF7基因构建的Taq Man荧光定量PCR检测方法线性关系良好、灵敏度高、重复性好、特异性强,可快速、高效检测临床样品PRRSV,为PRRSV早期诊断、及时防控和流行病学调查提供了科学的技术支撑。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征 orf7基因 Taq Man实时荧光定量PCR 早期诊断
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Establishment of Fluorescence Quantitative RT-PCR Assay for Detection of Equine Arteritis Virus
4
作者 Wang Keke Liang Xinxin +7 位作者 Jiang Gangqiang Long Zhixin Hudusi Aierken Liu Zhiling Wang Yan Wu Xiaowei Xiao Yuanyuan Bai Meihua 《Animal Husbandry and Feed Science》 CAS 2024年第1期21-25,共5页
[Objective]The paper was to establish a fluorescence quantitative RT-PCR method for detection of equine arteritis virus(EAV).[Method]Primers and probes were developed for the EAV ORF7 gene sequence,and the reaction sy... [Objective]The paper was to establish a fluorescence quantitative RT-PCR method for detection of equine arteritis virus(EAV).[Method]Primers and probes were developed for the EAV ORF7 gene sequence,and the reaction system was optimized.Standard curves were established,leading to the initial development of the EAV fluorescence quantitative RT-PCR assay.The accuracy,specificity,and sensitivity of this method were subsequently evaluated.[Result]The EAV fluorescence quantitative RT-PCR assay demonstrated optimal performance at an annealing temperature of 61 C,with a final concentration of primer and probe set at 0.6μmol/L.The plasmid standard demonstrated a strong linear correlation with Ct values within the range of 1.6×10^(7)-1.6×10^(2)copies/μL.The equation of the standard curve was determined to be y=-2.68x+32.88,with an R^(2) value of 0.9927.Consequently,the EAV fluorescence quantitative RT-PCR assay was successfully established.The methodology employed was effective in detecting EAV,Theileria equi,equine herpesvirus-1(EHV-1),equine herpesvirus-4(EHV-4),and equine influenza virus(EIV).The findings indicated that the method was specifically capable of detecting EAV,while the other pathogens tested yielded negative results.The method demonstrated a high degree of specificity.It was employed to detect the standard plasmid cRNA synthesized through in vitro transcription following a 10-fold dilution.The results indicated that the minimum detection limit of the method was 1.6×10^(2) copies/μL,and it exhibited high sensitivity.The coefficient of variation,both within and between groups,was maintained at 1.8%,indicating good reproducibility.In this study,the fluorescence quantitative RT-PCR assay developed was utilized alongside the EAV fluorescence quantitative RT-PCR assay established by previous researchers to analyze a total of 234 clinical samples.Both methods yielded a positive detection rate of 14.1%,and the coincidence rate between the two techniques was found to be 100%.[Conclusion]The fluorescence quantitative RT-PCR assay developed in this study offers a novel approach and concept for the prevention and control of equine viral arteritis(EVA). 展开更多
关键词 Equine arteritis virus(EAV) orf7 gene Fluorescence quantitative RT-PCR
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猪繁殖与呼吸综合征病毒河北地方株GF1107株ORF7基因的克隆与表达 被引量:6
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作者 李鹏 郑其升 +3 位作者 李斐 周斌 曹瑞兵 陈溥言 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期468-470,共3页
根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR2332株的核衣壳蛋白基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物。应用RT-PCR方法扩增PRRSV GF1107株(GenBank登陆号:AY684124)的ORF7片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中获得含... 根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR2332株的核衣壳蛋白基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物。应用RT-PCR方法扩增PRRSV GF1107株(GenBank登陆号:AY684124)的ORF7片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中获得含有相应片段的重组质粒pMDHB-ORF7。对质粒中的插入片段进行测序,应用DNAstar序列分析软件对所测序列与GenBank中PRRSV毒株进行同源性比较。将ORF7基因克隆入原核表达载体pET-32a(+)中,在IPTG的诱导下成功获得表达,经Western blotting分析表明,表达蛋白能够与PRRSV的阳性血清发生特异性反应,为PRRSV新型诊断试剂的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 0RF7基因 克隆 原核表达
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的遗传变异分析 被引量:8
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作者 鲁韦韦 姜平 +2 位作者 唐泰山 李玉峰 张常印 《动物医学进展》 CSCD 2007年第11期26-30,共5页
从GenBank中随机选取25株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的全基因序列进行同源性分析并构建了基因进化树,同时对PRRSV ORF7基因序列进行遗传变异分析,发现PRRSV美洲株之间或欧洲株之间的ORF7基因相对保守,但美洲株和欧洲株的ORF7基因的... 从GenBank中随机选取25株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的全基因序列进行同源性分析并构建了基因进化树,同时对PRRSV ORF7基因序列进行遗传变异分析,发现PRRSV美洲株之间或欧洲株之间的ORF7基因相对保守,但美洲株和欧洲株的ORF7基因的核苷酸及氨基酸同源性较低。说明建立的针对N蛋白的多种检测方法在高致病性PRRSV肆虐的现今仍具有实用性。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 orf7基因 基因进化树
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欧洲型PRRSV RT-PCR检测方法的建立及ORF7基因序列比较 被引量:13
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作者 张战峰 李肖梁 +2 位作者 张莹 查云侠 方维焕 《动物医学进展》 CSCD 2007年第5期26-29,共4页
根据PRRSV(LV株)ORF7基因设计一对引物,建立了欧洲型PRRSV的RT-PCR检测方法。通过对50份组织病料检测及其ORF7基因序列分析,结果表明,有4份组织病料扩增出欧洲型PRRSV576bp特异性片段,阳性率为8%,其ORF7基因序列和氨基酸推导序... 根据PRRSV(LV株)ORF7基因设计一对引物,建立了欧洲型PRRSV的RT-PCR检测方法。通过对50份组织病料检测及其ORF7基因序列分析,结果表明,有4份组织病料扩增出欧洲型PRRSV576bp特异性片段,阳性率为8%,其ORF7基因序列和氨基酸推导序列与欧洲型PRRSV弱毒疫苗株(AMER-VAC-PRRS)的同源性分别在99.0%~99.7%和98.5%~100%之间,而与标准毒株(LV)的同源性分别在95.9%~96.6%和96.99,6~97.7%之间。表明该PT-PCR体系适合组织病料中欧洲型PRRSV的直接检测,同时也证实了欧洲型PRRSV在我国的存在,并且与疫苗株之间具有较高的同源性。 展开更多
关键词 欧洲型猪繁殖与呼吸综合征 逆转录-聚合酶链反应 orf7基因
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PRRSV安徽分离株NSP2和ORF7基因的克隆与序列分析 被引量:4
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作者 姚雪静 占松鹤 +3 位作者 朱良强 祁克宗 王非 王爱萍 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第5期58-63,共6页
2008年从安徽两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,在Marc-145细胞上盲传4代~5代,发现明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HS08株和ZJ08株)。用RT-PCR扩增这两个分离毒株的NSP2和ORF7基因,进行克隆和序列分析。... 2008年从安徽两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,在Marc-145细胞上盲传4代~5代,发现明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HS08株和ZJ08株)。用RT-PCR扩增这两个分离毒株的NSP2和ORF7基因,进行克隆和序列分析。结果表明,这两个分离毒株核苷酸同源性高于99.0%;在NSP2基因上,这两个分离毒株均发生30个氨基酸的不连续缺失,它们与CH-1a株之间核苷酸同源性分别为80.7%和80.2%;在ORF7基因上,与2007年国内高致病性猪蓝耳病毒株HuN4核苷酸同源性较高,分别为98.4%和99.5%,且ORF7基因均存在K46→R46,H109→Q109,V117→A117氨基酸突变。这些信息显示这两个安徽分离株属美洲型毒株,具有高致病性特征,与国内高致病性毒株位于同一基因群。 展开更多
关键词 PRRSV NSP2基因 orf7基因 克隆 序列分析
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析 被引量:5
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作者 张永富 韩春华 +12 位作者 林健 刘月焕 韦海涛 祝俊杰 赵景义 李栋梁 马国文 布日额 李明刚 张婷 刘永宏 马明 张秋雨 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第10期4439-4442,4445,共5页
[目的]在基因工程菌中实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因的高效表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其免疫学活性及应用价值。[方法]将已构建好的重组表达载体pET-ORF7转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG在最适条件下诱导表达,其... [目的]在基因工程菌中实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因的高效表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其免疫学活性及应用价值。[方法]将已构建好的重组表达载体pET-ORF7转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG在最适条件下诱导表达,其表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行检测。应用Ni-NTAHis.Bind Resin层析柱在变性条件下纯化表达产物,通过梯度透析进行复性。采用Western Blot及间接ELISA法检测复性后重组蛋白的免疫学活性。[结果]重组质粒pET-ORF7在大肠杆菌中以融合形式成功表达,融合表达产物主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE检测所表达的重组蛋白分子量为33 kD左右,与预期大小相符。Band-scan软件对表达蛋白分析发现,表达产物约占菌体蛋白的50%。Western Blot及间接ELISA法显示复性后的重组蛋白与PRRSV阳性血清有特异性结合反应,表明其具有良好的免疫学活性。[结论]该试验将为进一步研制PRRSV单克隆抗体及诊断试剂盒奠定基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 orf7基因 表达 纯化 免疫学活性
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福建地区猪繁殖与呼吸综合征ORF7基因遗传变异分析 被引量:4
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作者 刘建奎 魏春华 +2 位作者 戴爱玲 李晓华 杨小燕 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2015年第10期17-19,23,共4页
为了解福建地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律,收集了福建省不同地区的12株PRRSV,并对其ORF7基因进行遗传变异分析。结果表明,福建地区存在欧洲型PRRS和美洲型PRRS,10株为美洲型PRRSV,与VR-2332、... 为了解福建地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律,收集了福建省不同地区的12株PRRSV,并对其ORF7基因进行遗传变异分析。结果表明,福建地区存在欧洲型PRRS和美洲型PRRS,10株为美洲型PRRSV,与VR-2332、JXA1等美洲型参考毒株的氨基酸的同源性为89.5%-100%,与欧洲代表毒株LV的氨基酸的同源性分别为59.5%-63.6%。而FJ-11、FJ-12 2株分离株为欧洲型PRRSV,与欧洲代表毒株LV的氨基酸的同源性分别为91.4%、92.2%,而与VR-2332、CH-1a等美洲参考毒株的氨基酸的同源性为60.3%-64.5%。美洲型PRRSV ORF7编码N蛋白氨基酸虽然发生了变异,但相对保守。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 orf7基因 遗传变异
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PRRSV云南A06株ORF5和ORF7基因的克隆与序列分析 被引量:2
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作者 曾少灵 林庆燕 +8 位作者 花群义 张彩虹 阮周曦 杨俊兴 孙洁 秦智锋 曹琛福 陈兵 吕建强 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第3期12-17,共6页
设计2对引物分别扩增PRRSV的ORF5和ORF7基因,对从云南某猪场分离到的毒株A06进行RT-PCR检测,得到2条特异性扩增带,克隆至pMD18-T载体并测序。将A06株的ORF5和ORF7基因及其推断氨基酸序列分别与PRRSV欧洲型代表株LV、美洲型代表株VR2332... 设计2对引物分别扩增PRRSV的ORF5和ORF7基因,对从云南某猪场分离到的毒株A06进行RT-PCR检测,得到2条特异性扩增带,克隆至pMD18-T载体并测序。将A06株的ORF5和ORF7基因及其推断氨基酸序列分别与PRRSV欧洲型代表株LV、美洲型代表株VR2332和7株中国分离的美洲型毒株相应基因进行核苷酸和氨基酸序列比对分析。结果显示,A06株属于美洲型,其ORF5和ORF7基因及推断氨基酸与我国2006年分离的4株HP-PRRSV代表株的相似性高达98%~99%,与欧洲型代表株LV的相似性只有56%~64%。分别构建了以上毒株ORF5和ORF7基因的亲缘关系图谱,反映了A06株ORF5和ORF7基因的进化位置,完成2个基因的遗传变异分析。 展开更多
关键词 PRRSV ORF5基因 orf7基因 亲缘关系图谱
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因原核表达载体的构建及序列分析 被引量:3
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作者 张永富 马国文 +4 位作者 刘月焕 刘永宏 李明刚 张秋雨 刘锋 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2008年第12期25-27,30,共4页
根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因序列,设计合成一对引物,应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因(N基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF7重组质粒转化DH5a宿主菌... 根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因序列,设计合成一对引物,应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因(N基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF7重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF7基因序列进行分析。结果表明,ORF7基因的原核表达载体构建成功。ORF7基因序列与美洲型的ORF7基因核苷酸同源性为92.8%~99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为65.3%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为92.0%~99.2%,与LV株的同源性为65.3%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。本研究为N蛋白的进一步研究和制备诊断性抗原奠定了基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 orf7基N 原核表达载体
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猪繁殖与呼吸综合征病毒S-1株ORF5和ORF7基因的克隆及变异分析 被引量:2
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作者 张春玲 张婉华 +5 位作者 臧克伟 王英 蒋凤英 邹勇 李春华 何锡忠 《上海农业学报》 CSCD 2008年第2期40-45,共6页
PRRSV S-1株经Marc-145复苏后,通过RT-PCR扩增了ORF5和ORF7基因。利用酶切位点将2个基因分别连接到原核表达载体PET-32C中,筛选阳性克隆送测序,序列分析表明:PRRSV S-1株ORF5基因变异性较高,与VR-2332毒株和CH-1 a毒株的同源性分别是:... PRRSV S-1株经Marc-145复苏后,通过RT-PCR扩增了ORF5和ORF7基因。利用酶切位点将2个基因分别连接到原核表达载体PET-32C中,筛选阳性克隆送测序,序列分析表明:PRRSV S-1株ORF5基因变异性较高,与VR-2332毒株和CH-1 a毒株的同源性分别是:核苷酸同源性为91%和89%,氨基酸同源性是87%和85%;ORF7基因相对保守,核苷酸的同源性分别是97%和94%,氨基酸的同源性分别是95%和93%。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5基因 orf7基因 变异分析
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猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株ORF7基因序列分析 被引量:1
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作者 樊振华 刘文俊 +4 位作者 武守艳 吴忻 孟帆 焦福林 薛翼鹏 《山西农业科学》 2020年第3期446-448,共3页
采用RT-PCR方法对疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得2个ORF7基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性比较分析。序列分析结果显示,2个ORF7基因之间核苷酸和氨基酸同源性分别为99.7%... 采用RT-PCR方法对疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得2个ORF7基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性比较分析。序列分析结果显示,2个ORF7基因之间核苷酸和氨基酸同源性分别为99.7%和98.4%,其与欧洲型代表毒株LV、美洲型代表毒株VR-2332、高致病性PRRSV变异株(JXA1、HUN4、HEB1、HUB1)及我国早期分离毒株CH-1a的核苷酸同源性分别为65.9%、93.0%~93.3%、97.6%~98.1%、94.6%~94.9%,氨基酸同源性分别为58.1%、93.5%~94.4%、95.2%~96.0%、91.9%~92.7%。遗传进化树分析结果表明,分离的2个ORF7基因与美洲型代表毒株VR-2332亲缘关系较近,属于美洲型,与CH-1a、HB-2(sh)、我国2006年以后分离的10株(JXA1、SD-09、HUB1、HEB1、HUN4、Henan-A14、GD、GDQY2、GZgy15-1、GD-2011)组成同一个亚群。 展开更多
关键词 猪繁殖和呼吸综合征病毒 orf7基因 序列分析
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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆与原核表达 被引量:1
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作者 李国旺 苗志国 陈俊杰 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期141-145,共5页
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害全球养猪业的重要病毒性传染病。通过PCR方法从高致病性PRRSV WUH1株中扩增得到结构蛋白ORF7的基因片段,并将目的基因插入原核表达载体pET-30a中,得到重组表达质粒pET-30a-ORF7。重组表达质粒转化大... 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害全球养猪业的重要病毒性传染病。通过PCR方法从高致病性PRRSV WUH1株中扩增得到结构蛋白ORF7的基因片段,并将目的基因插入原核表达载体pET-30a中,得到重组表达质粒pET-30a-ORF7。重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,融合蛋白得到了高效表达,表达的融合蛋白分子量约20kD。 展开更多
关键词 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 结构蛋白orf7基因 克隆 原核表达 融合蛋白
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马病毒性动脉炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
16
作者 梁歆歆 王科珂 +6 位作者 蒋刚强 徐军 陈凯云 王艳 肖媛媛 白梅花 刘东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期159-163,共5页
为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量RT-PCR方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的... 为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量RT-PCR方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的反应条件下效果最优;质粒标准品体外转录的cRNA在1.6×10^(7)拷贝/μL~1.6×10^(2)拷贝/μL时与Ct值之间呈现良好的线性关系,标准曲线方程为y=-2.68x+32.88,R^(2)=0.9927,初步建立了EAV荧光定量RT-PCR方法。采用该方法检测EAV、马焦虫、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马流感病毒,结果显示,该方法仅能特异性检测到EAV,其他病原检测均为阴性,该方法特异性强;将体外转录合成的质粒标准品cRNA 10倍倍比稀释后利用该方法检测,结果显示该方法最低检测限为1.6×10^(2)拷贝/μL,灵敏性高;重复性试验结果显示,该方法组内及组间变异系数均小于2.0%,重复性好。采用本实验建立的荧光定量RT-PCR方法和文献发表的EAV荧光定量RT-PCR方法分别对234份临床样品进行检测,两者的阳性检出率均为14.1%(33/234),两种方法的符合率为100%。本研究建立的荧光定量RT-PCR检测方法为马病毒性动脉炎的防控提供了新的技术手段和思路。 展开更多
关键词 马病毒性动脉炎 orf7基因 荧光定量RT-PCR
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猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2株ORF7基因的克隆、序列分析及原核表达
17
作者 梁望旺 熊忠良 +7 位作者 刘泽文 杨克礼 伍锐 邓均华 段正赢 余爱冬 唐文娟 徐涤平 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第35期17406-17408,共3页
[目的]对猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2毒株核蛋白编码基因ORF7进行研究,为进一步了解其编码蛋白的功能和研制新的血清学诊断方法奠定基础。[方法]采用RT-PCR方法扩增HBKM2株的ORF7基因,然后利用DNA Star软件包对克隆的序列进行序列分析,... [目的]对猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2毒株核蛋白编码基因ORF7进行研究,为进一步了解其编码蛋白的功能和研制新的血清学诊断方法奠定基础。[方法]采用RT-PCR方法扩增HBKM2株的ORF7基因,然后利用DNA Star软件包对克隆的序列进行序列分析,将ORF7基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG上,构建重组表达质粒pKG-N。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21,并经IPTG诱导表达,最后利用Western-blot对表达蛋白的免疫反应活性进行鉴定。[结果]HBKM2毒株的ORF7基因长约372 bp;序列分析表明与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的同源性达99%以上;SDS-PAGE表明克隆的ORF7基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达;Western-blot分析表明,重组蛋白GST-N能够与PRRSV高免猪血清发生特异性的免疫反应。[结论]成功地扩增了ORF7基因,且GST-N融合蛋白能在大肠杆菌中高效表达。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合症病毒 核衣壳蛋白 orf7基因 克隆 原核表达
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因变异分析
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作者 曹素芳 王岩 +1 位作者 肖松云 唐桂芬 《郑州牧业工程高等专科学校学报》 2009年第1期1-3,14,共4页
采用RT-PCR方法对疑似PRRS阳性病料进行克隆和测序获得了ORF7基因片段。序列分析结果表明获得的ORF7基因序列不存在缺失现象。与美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列的同源性为91.3%,氨基酸同源性为92.6%;与我国最早的PRRSV分离株CH-la相... 采用RT-PCR方法对疑似PRRS阳性病料进行克隆和测序获得了ORF7基因片段。序列分析结果表明获得的ORF7基因序列不存在缺失现象。与美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列的同源性为91.3%,氨基酸同源性为92.6%;与我国最早的PRRSV分离株CH-la相比,核苷酸同源性为93.5%,氨基酸同源性为92.6%;与我国高致病性PRRSV毒株SD-ZQ的核苷酸同源性最高为98.1%,氨基酸只有两个不同,同源性为98.3%;与本省的Hn-1/06毒株的核苷酸同源性为97.3%,氨基酸同源性为97.5%;与2004年分离的FJ-2株与ORF7基因的核苷酸差异稍大为85.4%,氨基酸同源性为88.6%;与欧洲型分离株LV株和N-34株ORF7基因的核苷酸差异很大,同源性仅为41.1%和40%,氨基酸同源性为47.1%和47.6%。表明所获得序列的流行毒株属于美洲型,但其毒力已发生了变异。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 orf7基因 变异
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部分地区猪传染性胃肠炎病毒株ORF7基因的序列分析
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作者 满朝来 于晓龙 《黑龙江农业科学》 2011年第8期41-43,共3页
猪传染性胃肠炎(Porcine Transmissible Gastraenteritis,TGE)是猪的一种高度接触性肠道疾病。以不同地区猪传染性胃肠炎病毒株的ORF7基因为靶序列,序列分析不同地区TGEV病毒株ORF7基因的同源性和进化性关系,序列分析包括同源性比较、... 猪传染性胃肠炎(Porcine Transmissible Gastraenteritis,TGE)是猪的一种高度接触性肠道疾病。以不同地区猪传染性胃肠炎病毒株的ORF7基因为靶序列,序列分析不同地区TGEV病毒株ORF7基因的同源性和进化性关系,序列分析包括同源性比较、进化树分析和碱基替换分析等。结果表明:ORF7基因在TGEV不同毒株间高度保守,但ORF7基因存在腺嘌呤碱基(A)向胸腺嘧啶(T)突变的倾向。通过对TGEVORF7基因核苷酸序列分析可为深入研究TGEV的毒力变化和流行病学提供参考。 展开更多
关键词 传染性胃肠炎病毒 orf7基因 序列分析
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定 被引量:1
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作者 张秀云 吴斌 +3 位作者 肇慧君 贾赟 刘霞 张瑞 《大连工业大学学报》 CAS 北大核心 2011年第1期18-22,共5页
根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析。双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a... 根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析。双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-N。再转化至BL21宿主菌,对诱导表达条件(IPTG质量浓度、诱导时间、诱导温度)进行优化。结果显示,在37℃、0.2 mmol/LIPTG诱导5 h可实现重组N蛋白的高效表达。该重组N蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,Western-blotting分析显示,重组的N蛋白与PRRSV阳性血清发生特异性反应,表明表达的重组N蛋白具有较好的反应活性。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 核衣壳蛋白基因(orf7) 基因克隆 原核表达
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