布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株的构建与鉴定 被引量：10

1

作者 王慧 张亚丽 +2 位作者 王远志 陈创夫 任晓丽 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2013年第1期30-34,共5页

为了构建布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株,采用PCR方法分别从亲本株16 M上扩增omp31基因的侧翼看序列及枯草芽孢杆菌SacB基因,并将所得片段与pMD18-T载体相连并测序,利用双酶切的方法分别将其连入自杀载体pGEM-7zf+,获得亚克隆pGEM-7zf+-... 为了构建布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株,采用PCR方法分别从亲本株16 M上扩增omp31基因的侧翼看序列及枯草芽孢杆菌SacB基因,并将所得片段与pMD18-T载体相连并测序,利用双酶切的方法分别将其连入自杀载体pGEM-7zf+,获得亚克隆pGEM-7zf+-Δomp31-SacB。将所构建好的自杀载体通过电转化入布鲁氏菌16M感受态细胞中,经2次同源重组后筛选出16MΔomp31基因缺失株,并对获得缺失株进行遗传稳定性检测。结果显示:成功获得布鲁氏菌16MΔomp31基因缺失株,该缺失株在15代内未发生回复性突变。本研究为今后研究布鲁氏菌抗凋亡机制奠定基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 omp31基因 缺失株

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羊种布鲁氏菌M5-90 omp31蛋白原核表达 被引量：8

2

作者 张红星 陈创夫 +1 位作者 王远志 唐利燕 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2009年第5期593-596,共4页

克隆、测序布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白基因OMP31,原核表达OMP31并对其检测。从羊种布鲁氏菌M5-90中PCR获得OMP31基因,连接到pBS-T克隆质粒并测序;将测序正确的基因片段克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a,进行SDS-PAGE,而后Western-blot... 克隆、测序布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白基因OMP31,原核表达OMP31并对其检测。从羊种布鲁氏菌M5-90中PCR获得OMP31基因,连接到pBS-T克隆质粒并测序;将测序正确的基因片段克隆入大肠杆菌表达载体pET-28a,进行SDS-PAGE,而后Western-blot检测。结果M5-90疫苗株的OMP31基因序列与羊种布鲁氏菌参考株16M的同源性为99.03%;外膜蛋白基因OMP31在大肠杆菌表达后能够被Western-blot检测到。结论:表达的布鲁氏菌疫苗株M5-90外膜蛋白OMP31可以被布鲁氏菌特异性血清识别,表现出良好的抗原性,为以后实验室诊断和疫苗的研究做好坚实的上游工作。 展开更多

关键词 羊种布鲁氏菌疫苗株M5-90 omp31基因 克隆 测序 Western—blot检测

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羊布鲁氏菌BCSP31、OMP31、L7/L12基因的原核表达载体构建及表达 被引量：7

3

作者 司瑞 白文涛 +5 位作者 张芳琳 刘艳丽 胡刚 吴兴安 阎岩 徐志凯 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第11期961-964,共4页

目的构建羊布鲁氏菌外膜蛋白BCSP31、OMP31和L7/L12基因的重组表达质粒,并在原核系统中表达。方法根据羊布鲁氏菌M5株外膜蛋白BCSP31、OMP31和抗原L7/L12蛋白基因序列设计引物,分别扩增出大小约为1kb、730bp和380bp的目的基因片断,插入p... 目的构建羊布鲁氏菌外膜蛋白BCSP31、OMP31和L7/L12基因的重组表达质粒,并在原核系统中表达。方法根据羊布鲁氏菌M5株外膜蛋白BCSP31、OMP31和抗原L7/L12蛋白基因序列设计引物,分别扩增出大小约为1kb、730bp和380bp的目的基因片断,插入pGEM7Zf(+)中测序并进行分析。将3种基因片段亚克隆入pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western-blot进行分析鉴定。结果SDS-PAGE结果表明3个目的蛋白均以融合蛋白的方式成功表达,在相对分子量57kDa、49kDa、38kDa处有表达条带,经薄层扫描分析,目的蛋白分别占全菌蛋白的42%、36%、40%。Western-blot证实3种融合蛋白均能被布鲁氏菌免疫兔血清识别。结论成功构建了3种蛋白的表达载体并进行了高效表达,3种蛋白均具有良好的免疫原性。 展开更多

关键词 羊布鲁氏菌 BCSP31蛋白 omp31蛋白 L7/L12蛋白 基因表达

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布鲁氏菌外膜蛋白OMP31基因克隆及番茄转化 被引量：2

4

作者 王晶妍 王建英 +4 位作者 玉花 赵宏宇 赵亮 辛翠花 王彬 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期119-123,共5页

作为发展可食性疫苗的第一步,将猪源布鲁氏菌蛋白OMP31的编码基因转入番茄,获得了转基因番茄。利用不依赖于连接反应的克隆方法(ligation-independent cloning,LIC)构建了pJG045-Omp31植物表达载体,将此表达载体通过三亲融合法转入农杆... 作为发展可食性疫苗的第一步,将猪源布鲁氏菌蛋白OMP31的编码基因转入番茄,获得了转基因番茄。利用不依赖于连接反应的克隆方法(ligation-independent cloning,LIC)构建了pJG045-Omp31植物表达载体,将此表达载体通过三亲融合法转入农杆菌AGL-0中,用农杆菌介导的植物叶盘转化法转化番茄,并通过对再生植株的基因组中OMP31的编码基因扩增测序,最终筛选出5株转基因番茄。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 蛋白omp31编码基因 转基因番茄

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宁夏布鲁氏菌Omp31基因序列特征分析 被引量：1

5

作者 高建炜 马学平 +5 位作者 王志翔 韩坤 张术斌 巨艳 陈丽莉 詹军 《宁夏医学杂志》 CAS 2015年第11期967-969,共3页

目的目的对宁夏布鲁氏菌Omp31基因序列进行分析,为菌株种型鉴定和试剂研究奠定基础。方法根据Genebank公布Omp31基因序列设计引物,采用PCR扩增、电泳检测、胶回收、纯化、送基因公司双向测序,用Contig Express软件对测序结果拼接,用DNAs... 目的目的对宁夏布鲁氏菌Omp31基因序列进行分析,为菌株种型鉴定和试剂研究奠定基础。方法根据Genebank公布Omp31基因序列设计引物,采用PCR扩增、电泳检测、胶回收、纯化、送基因公司双向测序,用Contig Express软件对测序结果拼接,用DNAstar软件进行结果分析。结果经PCR扩增测序得到Omp31基因全长序列大小为723 bp,编码240个氨基酸,与Genebank上羊种布鲁氏菌Omp31基因同源性达99.9%,氨基酸序列的同源性100%。通过遗传分析,分离株与参考菌亲缘关系相近,与羊种布鲁氏菌处在同一分枝。结论宁夏布鲁氏菌Omp31序列与发布的参考序列之间的同源性很高,而且与羊种布鲁氏菌处在同一分支。 展开更多

关键词 宁夏布鲁氏菌 omp31基因 序列分析

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猪型布鲁氏菌omp31基因的原核表达与亲和纯化

6

作者 杜志强 吴亚坤 +2 位作者 单生苗 刘晓燕 王建英 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第1期26-28,共3页

以猪型布鲁氏菌基因组作为模板进行基因序列的扩增,利用大肠杆菌原核表达系统进行重组表达,来研究外膜蛋白基因omp31的序列特性与重组表达情况。结果表明:猪型布鲁氏菌omp31基因的开放阅读框序列全长为723 bp,编码240个氨基酸。通过大... 以猪型布鲁氏菌基因组作为模板进行基因序列的扩增,利用大肠杆菌原核表达系统进行重组表达,来研究外膜蛋白基因omp31的序列特性与重组表达情况。结果表明:猪型布鲁氏菌omp31基因的开放阅读框序列全长为723 bp,编码240个氨基酸。通过大肠杆菌原核表达,成功表达出了目标重组蛋白,利用GSTtag亲和柱进行蛋白质纯化,重组蛋白分子量与预期的55.3 kD相一致。 展开更多

关键词 猪型布鲁氏菌 omp31基因 序列克隆 原核表达 纯化

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猪型布鲁氏菌Omp31基因的抗原表位预测与分析

7

作者 杜志强 刘丽娜 王建英 《云南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期693-696,共4页

布鲁氏菌的外膜蛋白在维持细胞结构方面发挥着重要作用,其中,有些外膜蛋白与细菌本身的毒性相关,成为了重要的抗原决定簇相关分子。Omp31分子就是猪型布鲁氏菌的一个重要的抗原表位分子,在研制亚单位疫苗方面有重要作用。本论文以猪型... 布鲁氏菌的外膜蛋白在维持细胞结构方面发挥着重要作用,其中,有些外膜蛋白与细菌本身的毒性相关,成为了重要的抗原决定簇相关分子。Omp31分子就是猪型布鲁氏菌的一个重要的抗原表位分子,在研制亚单位疫苗方面有重要作用。本论文以猪型布鲁氏菌Omp31基因作为研究对象,利用DNAStar生物学软件对Omp31分子的立体结构、分子的表面可能性、亲水性、蛋白骨架区的柔韧性、分子的抗原指数进行了详细分析。结果显示:猪型布鲁氏菌Omp31分子一级结构的氨基酸序列中存在4段可能的抗原表位区段,其中,51～80氨基酸残基组成的区段和193～228氨基酸残基组成的区段的抗原指数较高,成为抗原决定簇的可能性很大。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 omp31基因 二级结构 抗原表位 预测

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羊布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的基因克隆、原核表达及其对小胶质细胞凋亡的影响

8

作者 刘爱翠 刘静怡 +1 位作者 马巧丽 王振海 《宁夏医科大学学报》 2017年第6期667-671,F0003,共6页

目的本研究旨在构建布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的原核重组质粒pET-30a-omp31,表达并纯化Omp31融合蛋白,初步探讨布鲁氏菌外膜蛋白Omp31对小胶质细胞凋亡的影响。方法对羊种布鲁氏菌Omp31基因进行PCR扩增,并将其定向克隆到原核表达载体pET-30... 目的本研究旨在构建布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的原核重组质粒pET-30a-omp31,表达并纯化Omp31融合蛋白,初步探讨布鲁氏菌外膜蛋白Omp31对小胶质细胞凋亡的影响。方法对羊种布鲁氏菌Omp31基因进行PCR扩增,并将其定向克隆到原核表达载体pET-30a上,构建原核表达重组质粒pET-30a-omp31,表达、纯化布鲁氏菌Omp31融合蛋白,并用Omp31融合蛋白刺激小鼠小胶质细胞株BV2,利用流式细胞术分析其对小胶质细胞凋亡的影响。结果经过双酶切及测序验证证明成功构建了Omp31基因的原核表达载体pET-30a-omp31,将其进行蛋白的诱导表达、纯化,得到了较纯的Omp31融合蛋白,其融合蛋白的分子量为31kDa左右。将Omp31蛋白刺激小鼠小胶质细胞,发现不同浓度Omp31蛋白刺激组的细胞凋亡率均低于空白对照组(P<0.05)。结论通过基因克隆技术成功构建了Omp31基因的原核表达载体pET-30a-omp31,并对其进行蛋白诱导表达、纯化、复性后得到了Omp31融合蛋白,Omp31融合蛋白能够抑制小胶质细胞的凋亡。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 omp31基因 原核表达载体 omp31融合蛋白 细胞凋亡

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猪型布鲁氏菌Omp31抗原表位基因的性质分析

9

作者 杜志强 程佳 王建英 《四川师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期631-634,共4页

布鲁氏菌病是一种由革兰氏阴性小杆菌:布鲁氏菌(Brucella)引起的,主要在动物中以流产和发热为表现特征的疾病.以猪型布鲁氏菌病Omp31抗原表位基因作为研究对象,对基因的种间同源性、亚型分类、结构性质、抗原表位性质等信息进行了分析,... 布鲁氏菌病是一种由革兰氏阴性小杆菌:布鲁氏菌(Brucella)引起的,主要在动物中以流产和发热为表现特征的疾病.以猪型布鲁氏菌病Omp31抗原表位基因作为研究对象,对基因的种间同源性、亚型分类、结构性质、抗原表位性质等信息进行了分析,并且作出了相关预测.随着预测方法的不断完善,将会对布鲁氏菌病其它抗原表位基因的研究提供帮助,从而为该疾病的防疫、治疗提供理论依据,同时也可以促进相关疫苗的研制. 展开更多

关键词 布鲁氏菌 omp31抗原表位基因 序列对比 结构预测 抗原性质分析

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布鲁氏菌外膜蛋白omp31基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在巨噬细胞中的表达 被引量：6

10

作者 黄小强 王慧 +4 位作者 葛阳春 诸婷婷 王远志 陈创夫 杜军伟 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2012年第4期444-447,共4页

为了构建一种具有指示作用的融合表达蛋白,将布鲁氏菌外膜蛋白omp31基因与EGFP基因融合后观察融合表达蛋白在巨噬细胞中的表达情况。从灭活的绵羊种布鲁氏菌019株菌液中获得omp31基因片段,克隆入融合表达载体pTY,构建重组质粒pTY-omp31... 为了构建一种具有指示作用的融合表达蛋白,将布鲁氏菌外膜蛋白omp31基因与EGFP基因融合后观察融合表达蛋白在巨噬细胞中的表达情况。从灭活的绵羊种布鲁氏菌019株菌液中获得omp31基因片段,克隆入融合表达载体pTY,构建重组质粒pTY-omp31,脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7,通过激光共聚焦显微镜观察融合蛋白能够在细胞内的表达。研究结果显示:重组质粒pTY-omp31经酶切及测序鉴定证明构建正确,脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 omp31基因 巨噬细胞RAW264 7

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布鲁氏菌内蒙古分离株omp31基因的克隆与序列分析 被引量：3

11

作者 陆静 关平原 +3 位作者 乌日罕 特木尔巴根 马立峰 菊花 《畜牧与饲料科学》 2009年第10期15-17,共3页

对三株布鲁氏菌内蒙古分离株的omp31基因进行克隆与序列分析。参照GenBank中布鲁氏菌的omp31基因序列,设计一对特异性引物,用PCR方法扩增布鲁氏菌omp31基因,对PCR产物进行克隆、测序,将测定序列拼接后与GenBank中获得的参考毒株omp31基... 对三株布鲁氏菌内蒙古分离株的omp31基因进行克隆与序列分析。参照GenBank中布鲁氏菌的omp31基因序列,设计一对特异性引物,用PCR方法扩增布鲁氏菌omp31基因,对PCR产物进行克隆、测序,将测定序列拼接后与GenBank中获得的参考毒株omp31基因序列进行了比较。结果显示,三株布鲁氏菌分离株的omp31基因开放阅读框核苷酸序列同源性均为100.0%;与Brucella ceti B14/94、Brucella neotomae 5K33、Brucella suis1330三个参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性最高,为100.0%;与Brucella canisRM6/66、Brucella melitensis183、Brucella melitensis16M三个参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性为99.9%;与Brucella melitensis Rev1参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性为99.6%;与Brucella ovis ATCC25840参考毒株omp31基因核苷酸序列同源性最低,为98.8%。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 omp31 序列分析

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猪型布鲁氏菌rOmp31_(48-74)-BLS融合肽的诱导表达与纯化 被引量：1

12

作者 杜志强 程佳 王建英 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期20-23,共4页

目的:为了研究布鲁氏菌Omp31分子的抗原性质,以及布鲁氏菌BLS蛋白质的聚合功能,通过融合PCR技术,制备布鲁氏菌Omp3148-74与BLS的融合蛋白质,并且进行蛋白质的纯化。方法:以猪型布鲁氏菌Omp31基因和BLS基因作为研究对象,通过融合PCR技术... 目的:为了研究布鲁氏菌Omp31分子的抗原性质,以及布鲁氏菌BLS蛋白质的聚合功能,通过融合PCR技术,制备布鲁氏菌Omp3148-74与BLS的融合蛋白质,并且进行蛋白质的纯化。方法:以猪型布鲁氏菌Omp31基因和BLS基因作为研究对象,通过融合PCR技术构建重组表达载体,IPTG诱导融合蛋白质表达之后,利用His-tag亲和层析柱进行亲和纯化。结果:Omp3148-74-BLS融合DNA长度为531 bp,编码177个氨基酸;加上原核表达载体上的His-tag标签,融合蛋白质的实际大小为25.07 kD,实验结果证实表达载体构建正确,重组表达正确。结论:通过融合PCR技术构建的重组子pET-28-a-Omp3148-74-BLS,可以在大肠杆菌中成功表达;His-tag亲和层析技术可以纯化到Omp3148-74-BLS融合蛋白,而且蛋白质纯度较高。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 omp31基因 BLS基因 融合蛋白质

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布鲁氏菌rOmp31_(48-74)-BLS蛋白的多克隆抗体制备与检测 被引量：1

13

作者 杜志强 王建英 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期43-45,共3页

目的:研究布鲁氏菌Omp31分子的免疫原性。方法:利用IPTG诱导rOmp3148-74-BLS融合重组蛋白表达,经过His-tag镍柱进行亲和纯化之后,作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。结果:rOmp3148-74-BLS重组蛋白能够被大肠杆菌正确表达,而且,能够作为... 目的:研究布鲁氏菌Omp31分子的免疫原性。方法:利用IPTG诱导rOmp3148-74-BLS融合重组蛋白表达,经过His-tag镍柱进行亲和纯化之后,作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。结果:rOmp3148-74-BLS重组蛋白能够被大肠杆菌正确表达,而且,能够作为有效的抗原刺激家兔产生可以相互识别的多克隆抗体。结论:Omp31分子具有较好的免疫原性,可以引起较强的免疫反应。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 bls基因 omp31基因 融合蛋白质 多克隆抗体

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内蒙古分离株M3253羊种布鲁菌omp31基因的表达及抗原性分析

14

作者 吴杰 吴树清 刘艳琴 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第12期10-12,共3页

为了在大肠杆菌中表达羊种布鲁菌omp31基因并鉴定重组蛋白的抗原性,试验采用PCR技术从内蒙古分离株M3253羊种布鲁菌中扩增得到布鲁菌omp31基因片段,插入pMD18-T载体克隆测序,并将目的基因插入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET-30a... 为了在大肠杆菌中表达羊种布鲁菌omp31基因并鉴定重组蛋白的抗原性,试验采用PCR技术从内蒙古分离株M3253羊种布鲁菌中扩增得到布鲁菌omp31基因片段,插入pMD18-T载体克隆测序,并将目的基因插入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET-30a-omp31,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达该基因,并用SDS-PAGE和Western-blot检测该蛋白。结果表明:成功构建了重组质粒pET-30a-omp31,并在大肠杆菌中成功表达了omp31基因,融合蛋白与布鲁菌阳性血清发生特异性反应。说明布鲁菌omp31基因成功表达,重组蛋白可与羊种布鲁菌阳性血清发生特异性反应。 展开更多

关键词 布鲁菌基因 omp31 表达 抗原性

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环介导等温扩增与实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌的比较 被引量：8

15

作者 刘玉梅 古丽扎尔·阿不都纳斯尔 +1 位作者 丁剑冰 马秀敏 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2016年第12期1070-1073,共4页

目的 为快速、特异、灵敏的检测和鉴定布鲁氏菌,本研究依据环介导等温扩增技术与实时荧光定量PCR技术原理设计引物,建立两种检测布鲁氏菌的方法并进行评价。方法 根据布鲁氏菌OMP31基因序列设计6条LAMP引物和2条Real-time PCR引物,对新... 目的 为快速、特异、灵敏的检测和鉴定布鲁氏菌,本研究依据环介导等温扩增技术与实时荧光定量PCR技术原理设计引物,建立两种检测布鲁氏菌的方法并进行评价。方法 根据布鲁氏菌OMP31基因序列设计6条LAMP引物和2条Real-time PCR引物,对新疆医科大学第一附属医院院确诊的10例布鲁氏菌病患者全血标本进行DNA检测。LAMP反应前加入羟基萘芬蓝（HNB）作为扩增指示剂,根据指示剂的颜色变化判定结果,并比较两种方法的特异性及灵敏度差异。结果 LAMP反应只需30-60min完成,在检测特异性和灵敏度方面两者结果相同,均能检出100个拷贝数的质粒DNA,且均无假阳性。结论 LAMP方法快速、简便,经济,无需专用仪器设备,更适用于基层医院对布鲁氏菌的快速检测。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 环介导等温扩增 REAL-TIME PCR omp31基因

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