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蓝舌病新疆分离株VP7蛋白编码基因序列分析及一步法RT-PCR方法的建立
1
作者 马晓菁 谷文喜 +5 位作者 叶锋 刘帅 刘丽娅 谢彩云 钟旗 易新萍 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期253-259,共7页
【目的】分析蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,建立蓝舌病新疆分离株一步法RT-PCR方法,为新疆BTV分子流行病学调查及防控提供技术支持。【方法】采用二代测序技术获得新疆分离株S7基因序列,登陆GenBank对序列进行同源性Blas... 【目的】分析蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,建立蓝舌病新疆分离株一步法RT-PCR方法,为新疆BTV分子流行病学调查及防控提供技术支持。【方法】采用二代测序技术获得新疆分离株S7基因序列,登陆GenBank对序列进行同源性Blast比对,用软件MEGA 5.0分析序列差异,根据蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,运用软件Oligo6.0设计引物,对蓝舌病新疆分离株S7基因进行RT-PCR扩增,并验证该方法的特异性及敏感性。【结果】蓝舌病中国新疆分离株编码VP7蛋白S7基因序列与哈尔滨报道BTV分离株S7基因片段相似度较高为89.64%,与中国云南报道BTV-29型分离株、蒙古国BTV分离株S7基因片段相似度分别为87.49%和87.39%;与德国BTV分离株S7基因片段相似度为80.70%,其余均无同源性序列。中国新疆分离株S7基因片段序列与4条同源序列间存在26处核苷酸差异,9处氨基酸差异。【结论】建立的蓝舌病中国新疆分离株S7基因片段一步法RT-PCR方法具有良好的特异性,仅BTV中国新疆分离株扩增获得目的条带,该方法的敏感性为4.0×10^(3)copies/mL。 展开更多
关键词 蓝舌病 VP7蛋白 rt-pcr
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鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
2
作者 张靖鹏 陈翠腾 +5 位作者 林琳 付环茹 李兆龙 江斌 黄瑜 万春和 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期860-866,共7页
旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进... 旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。 展开更多
关键词 信鸽 鸽微RNA病毒 3 C基因 序列分析 实时荧光定量rt-pcr方法
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猪轮状病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
3
作者 柳佳佳 梁海英 +7 位作者 曾智勇 汤德元 王彬 叶泥 边孟婷 黄书 田红利 潘向英 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期162-168,共7页
根据猪轮状病毒VP6基因序列保守区设计特异性探针和引物,建立一种特异、灵敏、通用、高效检测Po RV的实时荧光定量RT-PCR检测方法。扩增目的片段为173 bp,以构建的重组质粒p MD19-T-VP6为模板进行反应程序的优化。结果显示,该方法的标... 根据猪轮状病毒VP6基因序列保守区设计特异性探针和引物,建立一种特异、灵敏、通用、高效检测Po RV的实时荧光定量RT-PCR检测方法。扩增目的片段为173 bp,以构建的重组质粒p MD19-T-VP6为模板进行反应程序的优化。结果显示,该方法的标准曲线为y=-3.1139x+39.298,R^(2)=0.9937,E=109.5%;用该方法检测猪常发传染病病原时结果均为阴性;对标准品质粒的最低检测限为1.32 copies/μL;批内、批间变异系数分别小于0.600%、1.300%,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好。利用该方法检测114份临床腹泻病料,阳性检出率(39/114)优于常规RT-PCR(22/114),39份阳性样品经测序鉴定均为Po RV,扩增VP7基因后成功构建22份阳性质粒,测序结果显示共检出6种G型Po RV,检出率依次为9.09%(G3)、22.72%(G4)、18.18%(G5)、31.82%(G9)、4.54%(G11)、9.09%(G26)。上述结果表明,本试验建立了一种快捷、准确检出Po RV的Taq Man探针通用型实时荧光定量RT-PCR方法,对该病的诊断、病原监测、流行病学调查具有重要意义。 展开更多
关键词 猪轮状病毒 TAQMAN探针 荧光定量rt-pcr
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猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法的建立
4
作者 于浩洋 王彩霞 +5 位作者 仇松寅 刘晓飞 景宏丽 吴绍强 冯春燕 林祥梅 《中国动物检疫》 CAS 2024年第1期95-101,共7页
猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方... 猪Linda病毒能引起仔猪先天性震颤,严重危害养猪业的发展,目前在我国暂未发现感染病例。本研究根据猪Linda病毒Core-E~(ms)基因序列,设计并合成巢式RT-PCR引物,通过对退火温度、引物浓度等进行优化,建立了猪Linda病毒巢式RT-PCR检测方法。结果显示,该方法具有良好的特异性,与非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性好,对慢病毒阳性对照品的最低检出限为10~1 copies/μL,比普通RT-PCR灵敏10倍。使用该方法检测模拟病毒样品,发现最低检出限为10~1 TU/mL,与荧光定量RT-PCR方法一致。本研究首次建立了可检测猪Linda病毒的巢式RT-PCR方法,其特异性强、灵敏度高,为在口岸以及条件有限的场地对猪Linda病毒进行精准且快速的检测提供了有效技术手段,也为防范Linda病毒传入提供了有力技术支撑。 展开更多
关键词 猪Linda病毒 巢式rt-pcr 检测方法 非典型瘟病毒
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马病毒性动脉炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
5
作者 梁歆歆 王科珂 +6 位作者 蒋刚强 徐军 陈凯云 王艳 肖媛媛 白梅花 刘东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期159-163,共5页
为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量RT-PCR方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的... 为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量RT-PCR方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6μmol/L的反应条件下效果最优;质粒标准品体外转录的cRNA在1.6×10^(7)拷贝/μL~1.6×10^(2)拷贝/μL时与Ct值之间呈现良好的线性关系,标准曲线方程为y=-2.68x+32.88,R^(2)=0.9927,初步建立了EAV荧光定量RT-PCR方法。采用该方法检测EAV、马焦虫、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马流感病毒,结果显示,该方法仅能特异性检测到EAV,其他病原检测均为阴性,该方法特异性强;将体外转录合成的质粒标准品cRNA 10倍倍比稀释后利用该方法检测,结果显示该方法最低检测限为1.6×10^(2)拷贝/μL,灵敏性高;重复性试验结果显示,该方法组内及组间变异系数均小于2.0%,重复性好。采用本实验建立的荧光定量RT-PCR方法和文献发表的EAV荧光定量RT-PCR方法分别对234份临床样品进行检测,两者的阳性检出率均为14.1%(33/234),两种方法的符合率为100%。本研究建立的荧光定量RT-PCR检测方法为马病毒性动脉炎的防控提供了新的技术手段和思路。 展开更多
关键词 马病毒性动脉炎 ORF7基因 荧光定量rt-pcr
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牛病毒性腹泻病毒TaqMan探针荧光RT-PCR方法的建立和临床应用
6
作者 袁野 董雅琴 +9 位作者 张慧 刘爽 崔进 尼博 魏荣 顾丛丛 段纲 张锋 李晓成 代飞燕 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期139-145,共7页
为建立一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的快速检测方法,本研究根据国内BVDV流行毒株5'-UTR序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan探针,并优化了反应条件,最终建立了一种检测BVDV基因1型(BVDV-1)的TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法,并开展... 为建立一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的快速检测方法,本研究根据国内BVDV流行毒株5'-UTR序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan探针,并优化了反应条件,最终建立了一种检测BVDV基因1型(BVDV-1)的TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法,并开展7省份BVDV-1型检测和流行情况分析。结果显示:所建立方法能够特异性检测出BVDV-1,与基因2型BVDV、猪瘟病毒、边界病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等病原无交叉反应;灵敏度高,最低检测下限为4.3 copies/μL;批内和批间变异系数均小于2%,重复性良好。7省份规模化牛养殖场BVDV-1型平均阳性率为17.40%(161/925),序列分析表明我国主要流行的为BVDV-1a,BVDV-1c亚型。本研究成功建立了一种良好的诊断BVDV的方法,监测地区优势流行毒株为BVDV-1a与1c亚型,为临床中BVDV早期诊断和流行病学调查监测提供了技术和数据支持。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 荧光rt-pcr 诊断 流行病学调查
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猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法的建立和应用
7
作者 汪志恒 王景成 +1 位作者 佘志成 王凯 《现代畜牧科技》 2024年第1期6-9,共4页
目的:建立一种猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法。方法:选择云南省大理地区患有猪支原体肺炎疾病的60只猪作为研究对象,针对猪肺炎支原体的保守序列p36基因设计了引物和探针,建立猪支原体肺炎RT-PCR检测反应体系,并对其灵敏度、特异性、重复... 目的:建立一种猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法。方法:选择云南省大理地区患有猪支原体肺炎疾病的60只猪作为研究对象,针对猪肺炎支原体的保守序列p36基因设计了引物和探针,建立猪支原体肺炎RT-PCR检测反应体系,并对其灵敏度、特异性、重复性进行分析及临床样本验证。结果:RT-PCR检测灵敏度为10^(2)拷贝、与PRRSV、PPV、FMDV、PCV、CSFV、APP等无交叉反应,批内和批间变异系数均小于2.00%,肺组织样本检出阳性数26例(86.67%),鼻拭子样本检出阳性数19例(63.33%)。结论:该研究成功建立了一种猪支原体肺炎RT-PCR诊断方法,具有较高的检测灵敏度和特异性,重复性能良好,这为后期MPS的临床精准诊断和疫病科学防控提供试验依据。 展开更多
关键词 猪支原体肺炎 rt-pcr 灵敏度 特异性
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牛病毒性腹泻病毒、牛肠道病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒四重一步法RT-PCR鉴别检测方法的建立与应用
8
作者 季彬 彭轶楠 +2 位作者 叶泽 王莎莎 王治业 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第5期120-127,共8页
为了建立一种能够同时、快速鉴别检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)的方法,根据BVDV 5'UTR基因、BEV 5'UTR基因、BRV VP6基因、BCV N基因设计引物,建立了能够同时鉴别检测BVDV、... 为了建立一种能够同时、快速鉴别检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)的方法,根据BVDV 5'UTR基因、BEV 5'UTR基因、BRV VP6基因、BCV N基因设计引物,建立了能够同时鉴别检测BVDV、BEV、BRV、BCV的四重一步法RT-PCR方法,该方法检测IBRV、BPIV-3、BRSV均为阴性,对BVDV、BEV、BRV、BCV的核酸检测下线分别为3.28、28.2、23.6、25.0 pg,与现有标准或商品化RT-PCR试剂盒的符合率均为100%,批内和批间重复性试验的检测结果均完全一致,检测222份临床样品的BVDV、BEV、BRV、BCV阳性率分别为15.32%、18.02%、6.31%和4.05%。说明四重一步法RT-PCR方法特异性好、灵敏度高、稳定性强,可用于BVDV、BEV、BRV、BCV的临床鉴别诊断、流行病学调查以及疫病防控。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 牛肠道病毒 牛轮状病毒 牛冠状病毒 一步法rt-pcr
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大蒜病毒多重RT-PCR检测体系的建立与应用
9
作者 赵永强 樊继德 +6 位作者 陆信娟 刘灿玉 张碧薇 杨青青 葛洁 史新敏 杨峰 《北方农业学报》 2023年第1期22-30,共9页
【目的】建立一套多重RT-PCR方法,用于同时检测和鉴别大蒜大田植株和组培苗5种病毒/病毒组。【方法】根据相关文献和GenBank公布的参考病毒株序列,设计了5对分别针对青葱潜隐病毒(Shallot latent virus,ShLV)、大蒜普通潜隐病毒(Garlic ... 【目的】建立一套多重RT-PCR方法,用于同时检测和鉴别大蒜大田植株和组培苗5种病毒/病毒组。【方法】根据相关文献和GenBank公布的参考病毒株序列,设计了5对分别针对青葱潜隐病毒(Shallot latent virus,ShLV)、大蒜普通潜隐病毒(Garlic common latent virus,GarCLV)、韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus,LYSV)、洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)和青葱X病毒属病毒(allexiviruses)的特异性引物,扩增产物大小分别为592、431、338、265、190 bp。利用建立的多重RT-PCR方法,分别对24份大蒜组培苗和48份大田样本进行病毒检测分析。【结果】通过单重/多重PCR及序列比对验证了检测系统的特异性。通过退火温度和引物比例优化,确定退火温度为56.6℃且ShLV、GarCLV、LYSV、OYDV、allexiviruses引物体积比为10∶8∶3∶3∶16时,扩增效果最好。5种病毒/病毒组的最低检测浓度均为1.0×10^(2) copies/μL。大蒜组培苗病毒检测结果具有丰富的多样性,大田样品被至少2种病毒/病毒组感染,病毒/病毒组之间可以清晰区分。【结论】开发的多重RT-PCR方法可以快速、有效地检测和鉴别大蒜ShLV、GarCLV、LYSV、OYDV和allexiviruses这5种病毒/病毒组的感染情况。 展开更多
关键词 大蒜 病毒 多重rt-pcr 检测体系
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牛源新型环状病毒RT-qPCR方法的建立和应用
10
作者 杨振兴 何于雯 +1 位作者 谢佳芮 朱建波 《动物医学进展》 北大核心 2023年第11期8-14,共7页
目前世界范围内仅分别从日本西南的与那国岛(2015年)及中国云南省景洪市勐罕镇(2019年)的哨兵动物牛上分离到过新型环状病毒Yonaguni orbivirus(YONOV),但尚缺乏该病毒核酸的特异性检测方法。该研究对比我国分离的YONOV毒株JH2019C603... 目前世界范围内仅分别从日本西南的与那国岛(2015年)及中国云南省景洪市勐罕镇(2019年)的哨兵动物牛上分离到过新型环状病毒Yonaguni orbivirus(YONOV),但尚缺乏该病毒核酸的特异性检测方法。该研究对比我国分离的YONOV毒株JH2019C603和日本毒株(ON-7/E/15)的基因序列,选择编码非结构蛋白3(Non-structural protein 3,NS3)的Segment-10(Seg-10)节段的保守区设计引物和探针,并分别进行了特异性、灵敏度、重复性和临床血液样品的测试,建立了牛YONOV的RT-qPCR和RT-PCR检测方法。结果显示,两种方法能特异性扩增YONOV核酸片段,对其他环状病毒无有效扩增;RT-qPCR和RT-PCR检出YONOV核酸浓度的下限分别为11.5 copies/μL和115.0 copies/μL;两种方法均能检测出毒株或动物临床血样中的YONOV核酸,并且能在动物感染并产生中和抗体前1周检测出病毒核酸,因此更适用于病毒感染动物的早期诊断。RT-qPCR因其更高的灵敏度和实效性,能用于大量临床样品的快速检测,而RT-PCR的扩增产物可以进行测序,获取待测毒株的基因信息,两种检测方法相互辅助,可以为YONOV的核酸检测及动物感染该病毒的诊断及流行病学研究提供技术支撑。 展开更多
关键词 环状病毒 实时荧光定量pcr 常规rt-pcr 病毒检测
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猪δ冠状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
11
作者 孙彦婷 康宇 +5 位作者 路亚男 井汇源 董望 李向辉 王金合 唐光武 《现代牧业》 2023年第3期12-17,共6页
建立一种快速检测猪δ冠状病毒(PDCoV)的方法。根据GeneBank收录的PDCoV M基因序列,设计两对特异性引物和TaqMan探针,对PDCoV TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件进行优化。Ct值与质粒模板之间呈现良好的线性关系,标准方程为y=-3.6421x+34.1... 建立一种快速检测猪δ冠状病毒(PDCoV)的方法。根据GeneBank收录的PDCoV M基因序列,设计两对特异性引物和TaqMan探针,对PDCoV TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件进行优化。Ct值与质粒模板之间呈现良好的线性关系,标准方程为y=-3.6421x+34.194,相关系数R 2=0.9992。荧光定量RT-PCR方法仅对PDCoV呈现特异性扩增,无交叉反应。敏感度试验结果显示,最低检出量为1.25×10^(1)copies/μL,灵敏度高。重复性试验结果显示,批内和批间测定均具有良好的重复性。TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法是一种可靠的快速检测PDCoV的方法。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 M基因 荧光定量rt-pcr TAQMAN
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牛轮状病毒RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
12
作者 刘维巍 林裕胜 +4 位作者 张龙 江锦秀 张靖鹏 刘庆华 胡奇林 《福建农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期431-435,共5页
【目的】建立牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)便捷检测方法,为福建省BRV的流行病学调查检测提供便捷技术支持。【方法】根据GenBank公布的BRV基因组序列,利用Oligo7.0软件设计并合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测BRV的RT... 【目的】建立牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)便捷检测方法,为福建省BRV的流行病学调查检测提供便捷技术支持。【方法】根据GenBank公布的BRV基因组序列,利用Oligo7.0软件设计并合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测BRV的RT-PCR方法,同时开展了特异性、敏感性和重复性试验,并将建立的方法应用于22份临床样品的检测。【结果】建立的方法仅能够扩增出BRV的特异性片段,对其他畜禽常见病原体无特异性扩增;该方法的灵敏度为6.86×10^(5)copies·μL^(-1)。对22份临床样品进行检测,检测出12份阳性样品,阳性率为54.55%。【结论】本研究建立的BRV RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可应用于临床样本的检测,为福建省BRV的诊断和流行病学调查提供了技术支持。 展开更多
关键词 牛轮状病毒 检测方法 rt-pcr
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猪腹泻病毒一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法的建立及应用 被引量：2
13
作者 王一丹 杨发龙 +2 位作者 陈弟诗 向华 任玉鹏 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期179-192,共14页
【目的】建立一种可同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株、猪A群轮状病毒(GARV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪阿尔法冠状病毒(SADS-CoV)及猪捷申病毒(PTV)5种猪腹泻病毒的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法。为猪腹泻病的快速诊... 【目的】建立一种可同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株、猪A群轮状病毒(GARV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪阿尔法冠状病毒(SADS-CoV)及猪捷申病毒(PTV)5种猪腹泻病毒的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法。为猪腹泻病的快速诊断和流行病学调查提供高效灵敏的工具。【方法】对PEDV多个基因型毒株ORF3基因比对分析,以PEDV野毒株为模板,对疫苗株ORF3基因稳定缺失区域设计特异性探针,并在两端保守区域设计上下游引物;在靠近GARV G3、G4、G5和G9型NSP5基因5′端保守碱基区域设计引物及探针,并加入简并碱基。同时,分别选择PDCoV M基因、PTV 5′UTR序列、SADS-CoV N基因等保守基因设计特异性引物及探针,用于多重荧光定量PCR方法的建立。对引物、探针浓度和退火温度进行优化;用RStudio参照代码绘制ROC曲线,确定检测方法的敏感度值、特异度值及曲线下面积AUC,并计算Youden指数,最终确定检测临界值;从阳性核酸中扩增靶基因,并克隆至pEASY-T1载体。通过体外转录,获得5种标准品分别命名为:cRNA-PEDV、cRNA-GARV、cRNA-PDCoV、cRNA-PTV和cRNA-SADS-CoV。对检测方法的敏感性、特异性和重复性等进行评估;并与同类方法对临床样本的检测符合率进行比较。【结果】得到了5种病原检测的最佳引物、探针浓度和最佳退火温度。根据ROC曲线确定PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV临界CT值分别为:35.78、34.25、34.98、34.60和35.70;5种病原的检测下限均可达到1×10^(2) copies/μL,标准曲线线性关系良好,扩增效率在96.3%-104%之间;该方法对PEDV CV777疫苗株、PEDV AJ1102疫苗株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、多杀性巴氏杆菌(P.multocida)、大肠杆菌(E.coli)、猪链球菌(S.suis)和葡萄球菌(S.aureus)等多种菌毒株均不检出,具有良好的特异性;经重复性检验,组内变异系数在0.22%-3.08%之间,组间变异系数在0.89%-4.0%之间;对242份临床样本检测并与同类方法的检测结果进行比较,符合率分别为:PEDV 97.9%、GARV 98.8%、PDCoV 100%、PTV98.3%和SADS-CoV100%,Kappa值均大于0.9。对PEDV野毒株的检测准确性高于同类方法。此外,对临床样本检测结果显示,当前四川省腹泻猪群中尚无SADS-COV检出;但PEDV、GARV、PDCoV和PTV仍持续流行,其总体阳性率分别达到:10.7%(26/242)、13.6%(33/242)、18.2%(44/242)和14.5%(35/242),且各腹泻病原之间存在不同形式和程度的混合感染,使感染猪腹泻病情加剧。故需进一步加强几种猪腹泻病毒在本地区猪群中流行情况调查和遗传变异规律研究,为制定更具针对性的防控措施提供依据。【结论】本研究成功建立了一种同时检测PEDV野毒、PDCoV、SADS-CoV和GARV、PTV多基因型的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR,为猪腹泻病的快速鉴别诊断和流行病学调查提供了一种高效灵敏的工具。 展开更多
关键词 一步法多重TaqMan荧光定量rt-pcr 猪腹泻相关病毒 鉴别诊断 检测临界值
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4种猪腹泻病毒恒温隔绝式荧光RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
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作者 侯闻闻 余良政 +4 位作者 樊毛迪 朱振邦 林成贤 陈昌海 李向东 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第9期83-88,共6页
为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒,本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针,经过方阵法优化... 为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒,本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针,经过方阵法优化恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)反应条件,建立了检测这4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法。用建立的iiRT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV),并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果显示该方法特异性强,对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的检测下限分别为10^(2)、10^(2)、10^(3)、10^(3)TCID_(50)/mL,并具有良好的组内和组间重复性;而荧光定量PCR方法的检测下限分别为10^(1)、10^(2)、10^(2)、10^(2)TCID_(50)/mL,敏感性略高于iiRT-PCR。2种方法对22份临床样品的检测结果符合率为100%,PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV阳性率分别为40.91%、9.09%、45.45%、9.09%,其中PEDV与PoRV混合感染率为18.18%,PDCoV与PoRV混合感染率为4.55%。本研究建立的iiRT-PCR为临床现场检测4种猪腹泻病毒提供了一种简便快速的方法。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪轮状病毒 猪德尔塔冠状病毒 恒温隔绝式荧光rt-pcr
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鹅星状病毒基因Ⅰ型和Ⅱ型双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用
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作者 王宏宇 朱寅初 +2 位作者 云涛 张存 鲍恩东 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1616-1623,共8页
鹅星状病毒(goose astroviruses,GAstV)作为一种雏鹅新发病原,对养鹅业造成巨大经济损失,在尚无有效治疗手段情况下,加强疫病及时检测和防控十分重要。为建立快速、特异且灵敏的鉴别GAstVⅠ型和GAstVⅡ型的病毒检测方法,本研究根据GAst... 鹅星状病毒(goose astroviruses,GAstV)作为一种雏鹅新发病原,对养鹅业造成巨大经济损失,在尚无有效治疗手段情况下,加强疫病及时检测和防控十分重要。为建立快速、特异且灵敏的鉴别GAstVⅠ型和GAstVⅡ型的病毒检测方法,本研究根据GAstVⅠ和GAstVⅡ的保守区域RdRp基因序列,设计合成2对特异性引物和2种不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了一种双重荧光定量PCR检测方法,以达到在同一反应体系中同时定量检测GAstVⅠ和GAstVⅡ的目的。结果显示,GAstVⅠ和GAstVⅡ的最小检出量分别为43.3、6.49 copies·μL^(-1);重复试验的变异系数不超过0.5%;该方法对DPV、GPV、GTMUV、GRV、AIV(H9N2)等病毒核酸无交叉反应。综上表明,本研究建立的可鉴别GAstVⅠ和GAstVⅡ的双重荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好。可用于临床GAstVⅠ和GAstVⅡ的快速鉴别诊断,也可用于两种基因型GAstV的定量分析。 展开更多
关键词 鹅星状病毒Ⅰ型 鹅星状病毒Ⅱ型 双重荧光定量rt-pcr TAQMAN探针
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广东省蒲瓜病毒种类鉴定及多重RT-PCR检测方法的建立
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作者 苏琦 汤亚飞 +5 位作者 佘小漫 蓝国兵 于琳 吴正伟 李正刚 何自福 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第23期4684-4695,共12页
【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类,建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法,提高蒲瓜病毒种类鉴定效率,为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间,从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和湛江... 【目的】探明侵染广东省蒲瓜的病毒种类,建立一种可以同时检测多种蒲瓜病毒的RT-PCR检测方法,提高蒲瓜病毒种类鉴定效率,为蒲瓜病毒病的精准监测与防控提供依据。【方法】2018—2022年间,从广东省广州市、惠州市、清远市、汕头市和湛江市的蒲瓜主要种植区采集蒲瓜病毒病疑似样品78份,对采集的样品按照地区和症状进行分类,提取每份样品的总RNA,将一个地区具有相同症状样品的RNA等量混合后进行小RNA深度测序分析。根据小RNA深度测序分析结果,设计特异引物进行RT-PCR验证,从而明确侵染广东省蒲瓜的病毒种类。挑选6种检出率高、危害严重的蒲瓜病毒,根据GenBank数据库设计多重PCR检测引物,通过优化反应体系和反应条件,建立同时检测6种蒲瓜病毒的多重RT-PCR方法。【结果】从采集的78份蒲瓜疑似病毒病样品中,共检测到12种病毒,按照检出率从高到低分别为葫芦内源RNA病毒(Lagenaria sicerariaalphaendornavirus,LSEV)(64.1%)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)(62.8%)、小西葫芦虎纹花叶病毒(zucchini tigre mosaic virus,ZTMV)(51.3%)、西瓜绿斑驳花叶病毒(watermelon green mottle mosaic virus,WGMMV)(43.6%)、西瓜病毒A(watermelon virus A,WVA)(32.1%)、番木瓜环斑病毒(papaya ringspot virus,PRSV)(19.2%)、小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)(9.0%)、瓜类蚜传黄化病毒(cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)(7.7%)、中国南瓜曲叶病毒(squash leaf curl China virus,SLCCNV)(7.7%)、瓜类褪绿黄化病毒(cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)(5.1%)、瓜类黄矮失调病毒(cucurbit yellow stunting disorder virus,CYSDV)(3.8%)、甜瓜黄斑病毒(melon yellow spot virus,MYSV)(1.3%)。78份样品中,复合侵染率高达80.8%,其中2、3、4、5、6和7种病毒复合侵染的检出率分别为14.1%、16.7%、23.1%、17.9%、7.7%和1.3%。在多重RT-PCR体系中先加入WVA+CCYV+ZTMV+PRSV引物,12个反应后再加入CGMMV+WGMMV引物,引物体积依次为WVA 0.5μL、CCYV 0.5μL、CGMMV 0.4μL、WGMMV 0.4μL、ZTMV 0.6μL、PRSV 0.6μL,从而确立了一种同时扩增6种病毒的多重RT-PCR检测方法。【结论】危害广东省蒲瓜的主要病毒有12种,其中CGMMV、ZTMV、WGMMV、WVA为优势病毒;复合侵染现象较普遍,以3、4和5种病毒的复合侵染形式占比较高;研发出一种同时检测蒲瓜上6种病毒的多重RT-PCR检测技术,提高了蒲瓜病毒种类鉴定效率。 展开更多
关键词 蒲瓜 病毒病 小RNA深度测序 rt-pcr检测 多重pcr方法
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多重RT-PCR同时检测6种马铃薯病毒及1种类病毒
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作者 邹莹 杨立杰 +6 位作者 谢锦 赵冀 毕恒翊 陈火云 宋波涛 马恢 聂碧华 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期164-170,184,共8页
病毒病是限制我国马铃薯生产的重要因子之一。本研究通过引物设计和体系优化建立了一套多重RT-PCR检测方法,可以在一个反应体系中同时检测6种马铃薯病毒和1种马铃薯类病毒以及1个马铃薯内参基因,包括马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)、... 病毒病是限制我国马铃薯生产的重要因子之一。本研究通过引物设计和体系优化建立了一套多重RT-PCR检测方法,可以在一个反应体系中同时检测6种马铃薯病毒和1种马铃薯类病毒以及1个马铃薯内参基因,包括马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)、马铃薯M病毒(potato virus M,PVM)、马铃薯S病毒(potato virus S,PVS)、马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)、马铃薯A病毒(potato virus A,PVA)、马铃薯卷叶病毒(potato leaf curl virus,PLRV)、马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTVd)和细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunitⅠ,CoxⅠ)基因的特异片段,产物大小依次为181、226、275、565、630、681、359、500 bp,符合理论预期。采用建立的方法以相应病毒和类病毒的质粒作模板进行检测,其检测灵敏度在1.6×10^(-3)~1.8×10^(-1) ng/μL。用该方法检测田间未知样品,结果与DAS-ELISA检测结果高度相符,同时PVY、PVM、PVS、PVX 4种病毒的检出率高于DAS-ELISA,表明该方法准确可靠,可用于以上马铃薯主要病毒和类病毒的快速检测。 展开更多
关键词 马铃薯 病毒 类病毒 检测方法 多重rt-pcr
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半夏3种花叶病毒的mRT-PCR鉴定及遗传进化分析
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作者 李锦超 董俊美 +2 位作者 孟义江 杨太新 葛淑俊 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期80-87,共8页
半夏(Pinellia ternata)因长期无性繁殖导致病毒病高发。本研究以河北安国疑似病毒感染的半夏为材料,通过优化扩增反应体系及反应程序,建立了可以同时检测黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus... 半夏(Pinellia ternata)因长期无性繁殖导致病毒病高发。本研究以河北安国疑似病毒感染的半夏为材料,通过优化扩增反应体系及反应程序,建立了可以同时检测黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV)和芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus, DsMV)的多重RT-PCR体系,RNA稀释106倍时亦能同时检测3种病毒。对侵染病毒外壳蛋白进行基因克隆和遗传进化分析,结果表明CMV的外壳蛋白编码区序列为657 bp,与浙江侵染半夏的CMV(DQ399550.1)序列相似性高达96.16%,与感染其他寄主的病毒序列差异较大;SMV和DsMV外壳蛋白序列分别为843和828 bp,与同种株系遗传变异度分别达到0.38和0.37以上,独立为1个进化支。生物信息学统计分析发现,病毒外壳蛋白序列高度保守,具有较为丰富的变异位点,碱基转换率大于颠换率,CMV AT偏倚度大于GC,SMV、DsMV与之相反。研究结果为半夏病毒检测和脱毒提供了技术和理论基础。 展开更多
关键词 半夏 花叶病毒 多重rt-pcr 遗传进化
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鸽A群轮状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立及应用
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作者 邢安琪 彭真奇 +7 位作者 蒋文明 克军宏 李阳 陈璐 王静静 许立华 于晓慧 刘华雷 《中国动物检疫》 CAS 2023年第9期91-97,共7页
鸽A群轮状病毒(group A rotavirus,RVA)是影响养鸽业健康发展的主要病原之一。为实现鸽RVA的高通量快速检测,根据目前国内外流行的鸽RVA VP6基因保守区域设计特异性引物与探针,建立了一种可以特异性检测鸽RVA的实时荧光RT-PCR方法,并对... 鸽A群轮状病毒(group A rotavirus,RVA)是影响养鸽业健康发展的主要病原之一。为实现鸽RVA的高通量快速检测,根据目前国内外流行的鸽RVA VP6基因保守区域设计特异性引物与探针,建立了一种可以特异性检测鸽RVA的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评估。结果显示,该方法灵敏度高,最低检测限为7.22×10^(2)copies/μL;特异性强,与鸽群其他常见病毒无交叉反应;重复性好,组内与组间重复变异系数均小于1.5%。利用该方法和普通RT-PCR方法对200份临床样品进行检测,发现荧光RT-PCR方法的病毒阳性检出率高于普通RT-PCR方法,二者符合率为94.00%。结果表明,本研究建立的实时荧光RT-PCR方法敏感、特异、准确,重复性好,可为开展鸽RVA的临床检测及流行病学调查提供技术支持。 展开更多
关键词 鸽A群轮状病毒 实时荧光rt-pcr 性能评估 应用
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基于盖他病毒nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用
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作者 魏新宇 王铭 +3 位作者 杜炳辰 史智宾 杨德成 王靖飞 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期910-915,929,共7页
为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,本研究根据GETV的nsP3基因设计特异性引物及探针,以GETV (SC483株) cDNA作为模板,扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中,构建重组质粒标准品p ET29a-nsP3并经... 为建立一种灵敏、特异且高效的检测盖他病毒(GETV)的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,本研究根据GETV的nsP3基因设计特异性引物及探针,以GETV (SC483株) cDNA作为模板,扩增目的基因并克隆至p ET-29a载体中,构建重组质粒标准品p ET29a-nsP3并经PCR和测序鉴定。基于该质粒标准品,采用方阵法优化引物、探针浓度以及退火温度,初步建立了一种基于GETV nsP3基因的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并绘制标准曲线。以GETV (SC483株、SC266株)、辛德毕斯病毒(SINV)、猪流感病毒(H3N2、SIV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)等病毒的基因组RNA反转录为cDNA作为模板,利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测,结果显示,仅GETV为阳性,SINV、SIV、TGEV、PEDV、PRRSV均为阴性,表明该方法特异性较强;分别以10倍倍比稀释(3.07×10^(-1)拷贝/μL~3.07×10^(8)拷贝/μL)的重组质粒标准品p ET29a-nsP3作为模板,利用本研究建立的方法和普通RT-PCR方法分别检测,结果显示,本研究建立的方法对重组质粒标准品的检测限为30.7拷贝/μL,敏感性是普通RT-PCR的100倍,敏感性较高;分别以同一时间及不同时间提取的不同浓度的质粒标准品作为模板,利用本研究建立的荧光定量RT-PCR进行组内与组间的重复性试验检测,结果显示,该方法的组内组间变异系数均小于2%,重复性较好。利用本实验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法与普通RT-PCR方法分别对来源于GETV感染小鼠的84份组织样品中的病毒核酸进行检测,结果显示,该TaqMan荧光定量RT-PCR方法对GETV检出率为95.24%(80/84),而普通RT-PCR对GETV的检出率为67.86%(57/84)。二者的阳性符合率达100%。本研究首次基于GETV nsP3基因建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为GETV的检测提供了有效工具。 展开更多
关键词 盖他病毒 荧光定量rt-pcr nsP3 检测方法
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