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SPF鸡胚St3galⅠ基因的克隆及其在MDCK细胞中的表达 被引量：1
1
作者 陆玉建 吴信明 +4 位作者 管宇 张松林 李树芳 韩文瑜 沈志强 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2016年第2期45-51,共7页
为了提高MDCK细胞表面禽流感病毒(AIV)受体的水平,以12日龄的SPF鸡胚为试材,通过反转录PCR扩增唾液酸转移酶Ⅰ基因(St3galⅠ),并将回收的片段插入到pMD18-T载体中。酶切pMD18-T-St3galⅠ和pCI-neo质粒,将目的片段进行连接,构建含有St3ga... 为了提高MDCK细胞表面禽流感病毒(AIV)受体的水平,以12日龄的SPF鸡胚为试材,通过反转录PCR扩增唾液酸转移酶Ⅰ基因(St3galⅠ),并将回收的片段插入到pMD18-T载体中。酶切pMD18-T-St3galⅠ和pCI-neo质粒,将目的片段进行连接,构建含有St3galⅠ基因的真核表达载体。利用脂质体介导法转染MDCK细胞,在G418的筛选下,获得具有抗性的转基因细胞系。通过细胞克隆化培养和PCR检测,筛选可稳定表达St3galⅠ基因的细胞株。结果表明,从鸡胚中克隆的St3galⅠ基因成功的插入到pCI-neo质粒,从而实现真核表达载体pCI-neo-St3galⅠ的构建。在G418选择压力下,初步获得了稳转目的基因的MDCK细胞系。将抗性细胞混合克隆进行稀释,经选择后挑选出30个单克隆抗性细胞株。分别以转染细胞基因组DNA和总RNA为模板,经PCR检测显示,目的基因已整合入MDCK细胞的基因组中并可稳定的进行表达。 展开更多
关键词 唾液酸 st3galⅰ基因 MDCK 转染 G418 PCR
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siat7e基因和st3gal Ⅰ基因双表达载体的构建及其初步应用 被引量：3
2
作者 陈小云 张敏 +3 位作者 张启龙 王磊 王栋 蒋桃珍 《中国兽药杂志》 2013年第4期6-10,共5页
应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从人类基因组中扩增出全长为1011 bp的唾液酸转移酶(siat7e基因),并从鸡基因组中扩增出全长为1029 bp的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(ST3GAL Ⅰ)基因。将它们分别克隆入pMD18-T载体中。对扩增的全长si... 应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从人类基因组中扩增出全长为1011 bp的唾液酸转移酶(siat7e基因),并从鸡基因组中扩增出全长为1029 bp的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(ST3GAL Ⅰ)基因。将它们分别克隆入pMD18-T载体中。对扩增的全长siat7e基因序列采用BamH Ⅰ和PstⅠ双酶切后连接入pReceiver真核表达载体,构建pRE-SⅠAT重组表达载体,进而,对扩增的全长st3gal Ⅰ基因采用Sac Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,后连接入pRE-SIAT重组表达载体,构建pRE-SIAT-ST3重组真核表达载体。经限制性内切酶消化及DNA序列分析,证实构建的重组表达质粒是正确的。将构建的双基因表达载体转染MDCK细胞,利用荧光显微镜观察,可见细胞表达明显的绿色荧光,从而初步证实了外源基因在MDCK细胞中的正确表达。本研究为最终构建能够适应悬浮培养,并且对禽流感病毒更为易感的MDCK细胞系奠定了基础。 展开更多
关键词 siat7e基因 st3gal ⅰ基因 表达载体 MDCK细胞
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稳定表达鸡ST3GALⅠ基因BHK-21细胞株的建立
3
作者 陈欢 李明义 高轩 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第3期10-15,共6页
筛选稳定表达鸡ST3GalⅠ基因的BHK-21细胞株,为进一步研究禽流感病毒大规模细胞培养生产疫苗奠定基础。克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达质粒pcDNA3.1-EGFP中构建重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3GaⅠ,鉴定正确的真核表达载体转染BHK-21... 筛选稳定表达鸡ST3GalⅠ基因的BHK-21细胞株,为进一步研究禽流感病毒大规模细胞培养生产疫苗奠定基础。克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达质粒pcDNA3.1-EGFP中构建重组质粒pcDNA3.1-EGFP-ST3GaⅠ,鉴定正确的真核表达载体转染BHK-21细胞后,ST3GalⅠ基因在细胞中稳定表达,经G418抗性和RT-PCR筛选鉴定表达阳性的单克隆细胞株。将H9亚型禽流感病毒和H5N1Re-5禽流感病毒按不同比例接种BHK-21-ST3GalⅠ细胞和空白BHK-21细胞,同时设普通胰酶和TPCK-胰酶对照组以检测BHK-21-ST3GalⅠ细胞对H9亚型禽流感病毒和H5N1Re-5禽流感病毒的增殖效果。接毒72h后收获细胞液,常规方法测定血凝素(HA)滴度。通过在BHK-21细胞中稳定表达ST3GalⅠ基因,提高BHK-21细胞表面SAα-2,3Gal受体丰度连续传6代后仍然能检测到其表达,荧光显微镜下能看到绿色荧光,RT-PCR可检出1 029bp的目的条带。结果显示,BHK-21-ST3GalⅠ细胞在接毒量为2%时HA滴度达到1∶256,显著高于空白BHK-21细胞组,表明其更适于流感病毒的增殖,具备生产流感病毒疫苗的潜力。 展开更多
关键词 鸡 st3galⅰ基因 重组质粒 稳定表达 BHK-21细胞
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稳定表达鸡ST3GalⅠ的BHK-21细胞株的构建及禽流感病毒的增殖 被引量：1
4
作者 陈欢 李明义 高轩 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期1527-1532,共6页
克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达载体pcDNA3.1-EGFP中构建真核表达质粒,转染BHK-21细胞后,通过G418抗性和绿色荧光蛋白标记双重筛选,鉴定1株表达ST3GalⅠ阳性的单克隆细胞株,绿色荧光丰富。经流式细胞仪检测,BHK-21-ST3GalⅠ细胞... 克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达载体pcDNA3.1-EGFP中构建真核表达质粒,转染BHK-21细胞后,通过G418抗性和绿色荧光蛋白标记双重筛选,鉴定1株表达ST3GalⅠ阳性的单克隆细胞株,绿色荧光丰富。经流式细胞仪检测,BHK-21-ST3GalⅠ细胞株中α-2,3连接型受体丰度较亲代BHK-21细胞显著提高。连续传5代10代后仍能检测到其表达,表明ST3GalⅠ基因在细胞中稳定表达。为了检测BHK-21-ST3GalⅠ细胞对H9亚型流感病毒和H5N1Re-5病毒的增殖效果,将H9亚型流感病毒和H5N1Re-5病毒接种BHK-21-ST3GalⅠ细胞和BHK-21细胞,同时设普通胰酶和TPCK-胰酶对照组。接毒72h后收获细胞液,常规方法测定血凝素(HA)滴度。试验结果表明,BHK-21-ST3GalⅠ细胞中禽流感病毒的HA滴度达到1∶256,显著高于BHK-21细胞组,表明其更适于流感病毒的增殖,具备生产流感病毒疫苗的潜力。 展开更多
关键词 st3galⅰ重组质粒pcDNA3 1-EGFP—st3galⅰ 转染 稳定表达 BHK-21-st3galⅰ细胞
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α-2、3唾液酸转移酶Ⅰ对前列腺癌细胞系PC3生物学行为的影响 被引量：1
5
作者 崔振鹏 刘建华 +5 位作者 罗林 刘山 刘鸿燕 毛文博 范清萍 刘鹤 《国际泌尿系统杂志》 2020年第6期987-990,共4页
目的探讨α-2,3唾液酸转移酶Ⅰ(ST3Gal-Ⅰ)对PC3生物学行为的影响。方法将前列腺癌细胞系PC3分为空白对照组、阴性对照组、干预组。空白对照组不作任何处理,阴性对照组转染pEGFP-N1质粒,干预组转染pEGFP-N1-ST3Gal-Ⅰ质粒。采用Western ... 目的探讨α-2,3唾液酸转移酶Ⅰ(ST3Gal-Ⅰ)对PC3生物学行为的影响。方法将前列腺癌细胞系PC3分为空白对照组、阴性对照组、干预组。空白对照组不作任何处理,阴性对照组转染pEGFP-N1质粒,干预组转染pEGFP-N1-ST3Gal-Ⅰ质粒。采用Western blot检测三组中ST3Gal-Ⅰ蛋白表达量,采用CCK8法检测三组PC3增殖率,通过Transwell小室侵袭实验检测三组PC3侵袭能力,采用流式细胞术检测三组PC3凋亡率。结果干预组PC3增殖率、侵袭能力及ST3Gal-Ⅰ蛋白表达量明显高于空白对照组、阴性对照组(P<0.05);干预组PC3凋亡率明显低于空白对照组、阴性对照组(P<0.001);阴性对照组PC3增殖率、侵袭能力、凋亡率及T3Gal-I蛋白表达量与空白对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 ST3Gal-Ⅰ能够促进PC3增殖、侵袭,抑制其凋亡。 展开更多
关键词 前列腺肿瘤 st3gal1-ⅰ 细胞增殖 细胞凋亡
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适应H_9亚型禽流感病毒增殖的重组R-MDCK细胞系的建立 被引量：1
6
作者 吴亚丽 宋玉慧 +4 位作者 徐倩 潘梦梦 张剑 武志丹 李新生 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期579-584,共6页
克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达质粒p IRES中,构建重组质粒p IRES-ST3GalⅠ,鉴定正确的真核表达载体转染MDCK细胞,用G418抗性筛选稳定表达的重组细胞R-MDCK。PCR及RT-PCR鉴定表达阳性的单克隆细胞株。将不同H_9亚型禽流感病毒毒... 克隆鸡ST3GalⅠ基因并将其插入真核表达质粒p IRES中,构建重组质粒p IRES-ST3GalⅠ,鉴定正确的真核表达载体转染MDCK细胞,用G418抗性筛选稳定表达的重组细胞R-MDCK。PCR及RT-PCR鉴定表达阳性的单克隆细胞株。将不同H_9亚型禽流感病毒毒株按相同滴度接种R-MDCK细胞和空白MDCK细胞,通过HA试验和TCID_(50)试验,检测不同H_9亚型禽流感病毒毒株在R-MDCK细胞上的增殖效果。结果发现,所有H_9亚型禽流感病毒毒株在RMDCK细胞HA和TCID_(50)结果均显著高于空白MDCK细胞。ST3GalⅠ基因在第12代R-MDCK细胞中仍能稳定表达,R-MDCK细胞可显著提升H_9亚型低致病性禽流感病毒培养的滴度,可以替代鸡胚用于H_9亚型低致病性禽流感病毒的生产。 展开更多
关键词 st3galⅰ基因 重组质粒 H9亚型AIV 重组MDCK细胞
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