大肠杆菌耐药基因TD-PCR检测方法的建立及应用

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作者 潘永 王可人 +4 位作者 李婷 杨莉 李刚 张亚楠 徐景峨 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期269-277,共9页

为建立一种检测大肠杆菌主要耐药基因(ARG)的通用降落PCR(TD-PCR)方法,本研究参考大肠杆菌标准菌株K12 MG1655 yeeJ基因序列设计合成不同Tm值引物、不同产物长度引物、不同长度引物,并参考Gen Bank中登录的β-内酰胺酶、氨基糖苷类、酰... 为建立一种检测大肠杆菌主要耐药基因(ARG)的通用降落PCR(TD-PCR)方法,本研究参考大肠杆菌标准菌株K12 MG1655 yeeJ基因序列设计合成不同Tm值引物、不同产物长度引物、不同长度引物,并参考Gen Bank中登录的β-内酰胺酶、氨基糖苷类、酰胺醇类、喹诺酮类和黏菌素类部分ARG序列设计合成共29对引物。以大肠杆菌标准菌株K12 MG1655总DNA为模板,采用TD-PCR和普通PCR方法,分别利用不同Tm值引物(P1~P8)、不同产物长度引物(P9~P16)、不同长度的引物(P17~P22)分别扩增yeeJ基因,均用于检测TD-PCR方法的特异性;利用引物P5扩增yeeJ基因,根据目的条带平均亮度值,对TD-PCR方法的扩增产物量分析。不同Tm值引物的扩增结果显示,TD-PCR方法中利用8对不同Tm值引物扩增后均出现目的条带,且均无非特异性条带,而普通PCR方法仅有部分引物扩增后出现目的条带,表明以不同Tm值引物扩增时,TD-PCR方法特异性更强,且适用引物Tm值范围较广。不同产物长度扩增结果显示,TD-PCR方法中利用8对引物扩增后均出现相应目的条带,且无非特异条带,而普通PCR方法虽然均出现目的条带,但部分引物扩增后还出现了非特异性条带,表明以不同产物长度引物扩增时,TD-PCR方法的特异性更强。不同长度的引物扩增结果显示,TD-PCR方法中利用6对不同长度的引物扩增后均出现目的条带,且无非特异条带,而普通PCR方法在52℃退火温度时引物P22出现非特异性扩增,表明TD-PCR方特异性更强。扩增产物量分析结果显示,TD-PCR和普通PCR方法扩增的目的条带平均亮度值均随反应总循环数的增加而上升,但普通PCR方法扩增的产物目的条带平均亮度值始终高于TD-PCR,表明TD-PCR方法的扩增产物量低于普通PCR。以24株临床分离的鹅源大肠杆菌总DNA为模板,采用TD-PCR和普通PCR方法,分别对β-内酰胺酶、氨基糖苷类、酰胺醇类、喹诺酮类和黏菌素类共29种ARG进行检测。结果显示,TD-PCR方法对其中25种ARG的检测结果与普通PCR相同,二者符率为100%;而对另外4种ARG检测结果显示,与普通PCR相比,TD-PCR方法的非特异条带明显减少,且无假阳性。表明TD-PCR在检测ARG方面比普通PCR具有更强的特异性。本研究建立了一种特异性较强的检测大肠杆菌主要ARG的TD-PCR通用方法,为细菌耐药性的研究提供了便捷高效的检测技术手段。 展开更多

关键词 大肠杆菌 耐药基因 td-pcr 特异性

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地衣芽孢杆菌16S rRNA基因的TD-PCR扩增及系统发育分析 被引量：10

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作者 马凯 刘光全 程池 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期709-711,共3页

运用16SrRNA基因序列分析了中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）保存的30株地衣芽孢杆菌的系统发育关系,结果显示：24株菌株位于地衣芽孢杆菌系统发育分支;3株菌株位于蜡状芽孢杆菌-苏云金芽孢杆菌系统发育分支;1株菌株位于枯草芽... 运用16SrRNA基因序列分析了中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）保存的30株地衣芽孢杆菌的系统发育关系,结果显示：24株菌株位于地衣芽孢杆菌系统发育分支;3株菌株位于蜡状芽孢杆菌-苏云金芽孢杆菌系统发育分支;1株菌株位于枯草芽孢杆菌系统发育分支;2株菌株与其它地衣芽孢杆菌菌株间序列同源性为96.4%-97.4%,明显低于其它地衣芽孢杆菌菌株间同源性,分类地位不明确,有待进一步讨论。通过比较分析16SrRNA基因5′端500bp、3′端500bp以及其全基因的系统发育树,表明16SrRNA基因5′端500bp可以很好的代表全基因序列进行系统发育研究,可用于区分地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及蜡状芽孢杆菌分支。 展开更多

关键词 地衣芽孢杆菌 td-pcr 16S RRNA基因 系统发育

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利用SOE-PCR与TD-PCR技术对气肿疽梭菌FliA(C)-NanA融合基因扩增方法的构建 被引量：4

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作者 李香春 金鑫 +2 位作者 朴春宇 金成德 朴春实 《安徽农业科学》 CAS 2013年第24期9921-9923,共3页

[目的]构建联合表达气肿疽梭菌的鞭毛蛋白与分泌蛋白神经氨酸酶的方法,用以制备气肿疽生物工程亚单位疫苗。[方法]根据已公布的气肿疽梭菌FliA(C)和NanA序列设计引物,联合使用SOE-PCR与TD-PCR技术,建立融合基因FliA(C)-NanA的扩增方法。... [目的]构建联合表达气肿疽梭菌的鞭毛蛋白与分泌蛋白神经氨酸酶的方法,用以制备气肿疽生物工程亚单位疫苗。[方法]根据已公布的气肿疽梭菌FliA(C)和NanA序列设计引物,联合使用SOE-PCR与TD-PCR技术,建立融合基因FliA(C)-NanA的扩增方法。[结果]试验成功扩增出了融合基因FliA(C)-NanA。[结论]SOE-PCR方法无需在引物设计中加入酶切位点进行连接,降低了试验成本,且2个基因间未加入其他核酸序列,避免了表达出影响免疫效果的蛋白;TD-PCR的应用节省了试验时间,避免了筛选退火温度的繁琐步骤,解决了基因丢失的问题。 展开更多

关键词 气肿疽梭菌 融合基因 SOE-PCR td-pcr

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普通PCR与TD-PCR扩增叶尔羌高原鳅抗菌肽Hepcidin基因的比较 被引量：1

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作者 刘书东 王娟娟 +1 位作者 陈根元 李莲瑞 《塔里木大学学报》 2011年第4期40-45,共6页

为了比较普通PCR和降落PCR(TD-PCR)扩增Hepcidin基因的效果,通过Trizol法提取叶尔羌高原鳅肝胰脏总RNA并合成cDNA,分别利用普通PCR和降落PCR扩增Hepcidin基因片段。结果显示,降落PCR能有效扩增叶尔羌高原鳅Hepci-din。测序结果显示:叶... 为了比较普通PCR和降落PCR(TD-PCR)扩增Hepcidin基因的效果,通过Trizol法提取叶尔羌高原鳅肝胰脏总RNA并合成cDNA,分别利用普通PCR和降落PCR扩增Hepcidin基因片段。结果显示,降落PCR能有效扩增叶尔羌高原鳅Hepci-din。测序结果显示:叶尔羌高原鳅抗菌肽Hepcidin基因与普通鱼类基因同源性达90%,而普通PCR则不能扩出明显目的条带。本研究结果表明在相同反应体系中,降落PCR在不影响PCR特异性的条件下,能提高扩增效率,可用于扩增普通PCR难以扩增的基因片段。 展开更多

关键词 降落PCR 叶尔羌高原鳅 HEPCIDIN基因

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应用TD-PCR技术和限制性内切酶技术鉴定猴B病毒

5

作者 刘忠华 黄韧 钟翎 《中山大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第A19期235-237,共3页

从DNA水平上鉴定猴B病毒,并区别人单纯疱疹病毒(HSV-1);用PCR技术对猴B病毒和HSV-1进行扩增,并用限制性内切酶技术对扩增产物进行酶切,对PCR扩增产物和酶切产物进行电泳;电泳结果显示猴B病毒和HSV-1的PCR扩增产物为128bp,酶切后,B病毒... 从DNA水平上鉴定猴B病毒,并区别人单纯疱疹病毒(HSV-1);用PCR技术对猴B病毒和HSV-1进行扩增,并用限制性内切酶技术对扩增产物进行酶切,对PCR扩增产物和酶切产物进行电泳;电泳结果显示猴B病毒和HSV-1的PCR扩增产物为128bp,酶切后,B病毒能产生72bp和56bp片段,而HSV-1不能产生酶切产物;该方法能较好地鉴定猴B病毒,同时也将有密切抗原关系的HSV-1区分开来。 展开更多

关键词 B病毒 单纯疱疹病毒 聚合酶链反应(PCR) 限制性内切酶技术 降落PCR

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55株芽孢杆菌16S rRNA基因序列测定与系统发育学分析 被引量：9

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作者 程池 刘光全 +1 位作者 李金霞 姚粟 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期20-24,共5页

采用16S rRNA基因序列分析法对中国工业微生物菌种保藏管理中心(CCIC)保藏的55株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行复核鉴定。菌株经纯化培养,以改良CTAB法提取总DNA,采用细菌16S rRNA通用引物、TD-PCR方法(touchdown-PCR)进行16S r... 采用16S rRNA基因序列分析法对中国工业微生物菌种保藏管理中心(CCIC)保藏的55株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行复核鉴定。菌株经纯化培养,以改良CTAB法提取总DNA,采用细菌16S rRNA通用引物、TD-PCR方法(touchdown-PCR)进行16S rRNA基因序列扩增,PCR产物纯化后直接进行序列测定,序列经人工校对后用Clustal X进行比对分析,最后用MEGA3.1软件构建系统发育树。系统发育分析结果表明:55株枯草芽孢杆菌中有52株菌种与原鉴定结果一致,有3株菌种与原鉴定结果存在差异,其中2株鉴定结果为巨大芽孢杆菌(B.megaterium),另1株鉴定结果为地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)。 展开更多

关键词 枯草芽孢杆菌 16S RRNA基因 td-pcr 序列分析 系统发育树

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降落PCR扩增单纯疱疹病毒Ⅱ型D蛋白基因的研究 被引量：2

7

作者 刘涛 黄志成 祝水芬 《中国卫生检验杂志》 CAS 2008年第9期1735-1736,共2页

目的:建立一种快速、准确检测单纯疱疹病毒Ⅱ型D蛋白基因的方法。方法:根据已发表的gD蛋白核苷酸序列设计引物,采取降落PCR对gD蛋白DNA进行扩增。结果:从2份病毒株中均扩增出与预期大小完全一致的目的片段,并且采用降落PCR能有效地降低... 目的:建立一种快速、准确检测单纯疱疹病毒Ⅱ型D蛋白基因的方法。方法:根据已发表的gD蛋白核苷酸序列设计引物,采取降落PCR对gD蛋白DNA进行扩增。结果:从2份病毒株中均扩增出与预期大小完全一致的目的片段,并且采用降落PCR能有效地降低或避免非特异性扩增。结论:TD-PCR能够用于快速,准确地检测gD蛋白,为生殖器疱疹的鉴别诊断在分子水平上提供了理想的新方法。 展开更多

关键词 td-pcr gD蛋白 单纯疱疹病毒Ⅱ型

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降落PCR扩增单纯疱疹病毒Ⅱ型G蛋白基因的研究

8

作者 刘涛 黄志成 祝水芬 《中国预防医学杂志》 CAS 2008年第11期963-965,共3页

目的建立一种快速,准确检测单纯疱疹病毒Ⅱ型G蛋白基因的方法。方法根据已发表的gG蛋白核苷酸序列设计引物,采取降落PCR对gG蛋白基因进行扩增。结果从2份病毒株中均扩增出与预期大小完全一致的目的片段,并且能有效地降低或避免非特异性... 目的建立一种快速,准确检测单纯疱疹病毒Ⅱ型G蛋白基因的方法。方法根据已发表的gG蛋白核苷酸序列设计引物,采取降落PCR对gG蛋白基因进行扩增。结果从2份病毒株中均扩增出与预期大小完全一致的目的片段,并且能有效地降低或避免非特异性扩增。结论TD-PCR能够用于快速,准确地检测gG蛋白基因,为生殖器疱疹的鉴别诊断在分子水平上提供了理想的新方法。 展开更多

关键词 td-pcr SG蛋白 单纯疱疹病毒Ⅱ型

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PCR法克隆卤虫（Artemia franciscana） Artemin基因上游调控序列

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作者 王蕾 张学文 陈韬 《中山大学研究生学刊（自然科学与医学版）》 2004年第1期57-67,共11页

利用限制性内切酶(Dra I和Hpa I)对卤虫(Artemia franciscana)基因组DNA进行酶切后，连上接头构建基因组“DNA文库”(即未克隆，带接头的DNA片段)，再以TD-PCR(Touch-down PCR)的方法扩增卤虫的Artemin．基因的上游调控序列，得到一段大... 利用限制性内切酶(Dra I和Hpa I)对卤虫(Artemia franciscana)基因组DNA进行酶切后，连上接头构建基因组“DNA文库”(即未克隆，带接头的DNA片段)，再以TD-PCR(Touch-down PCR)的方法扩增卤虫的Artemin．基因的上游调控序列，得到一段大为750bp的片段，将这一上游序列片段克隆到pMDl8-T载体中，以获得包括启动子、增强子等顺式作用元件在内的Artemin基因的上游调控序列，为进一步研究Artemin基因的表达模式及其功能提供依据。 展开更多

关键词 卤虫 Artemin基因 上游调控序列 td-pcr 基因表达 降落PCR 养殖 甲壳纲

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MLXIPL、PMVK、TRIB3基因启动子区甲基化检测方法的建立 被引量：1

10

作者 钱冉 郑芳 +1 位作者 郭书忍 杨娜 《中国实验诊断学》 北大核心 2010年第8期1166-1169,共4页

目的建立基因MLXIPL、PMVK、TRIB3启动子区DNA甲基化检测的方法。方法用亚硫酸氢钠和对苯二酚处理外周血细胞基因组DNA标本,以修饰后的DNA标本为模板,每个基因分别用内外侧两套不同的引物对启动子区进行巢式扩增。PCR产物进一步克隆、... 目的建立基因MLXIPL、PMVK、TRIB3启动子区DNA甲基化检测的方法。方法用亚硫酸氢钠和对苯二酚处理外周血细胞基因组DNA标本,以修饰后的DNA标本为模板,每个基因分别用内外侧两套不同的引物对启动子区进行巢式扩增。PCR产物进一步克隆、测序。结果测序结果表明,MLXIPL、PMVK、TRIB3启动子区基因中的非甲基化的C碱基转变为T碱基,而CpG岛被甲基化的C碱基则不改变。结论成功地建立了MLXIPL、PMVK、TRIB3基因甲基化检测的方法,为探索基因启动子区甲基化与疾病的关系做出了铺垫。 展开更多

关键词 甲基化 MLXIPL PMVK TRIB3 巢式联合td-pcr

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微卫星DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染法的改良 被引量：37

11

作者 张志峰 史洪才 +1 位作者 武坚 简子健 《生物技术》 CAS CSCD 2005年第3期51-53,共3页

为了筛选和检测绵羊种群中具有较好表现的微卫星多态性,采用Touch-downPCR方法扩增绵羊基因组上的微卫星DNA序列后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,采用改良的银染法对微卫星位点进行多态性检测,染色结果与常规银染法相比,该方法具有灵敏度... 为了筛选和检测绵羊种群中具有较好表现的微卫星多态性,采用Touch-downPCR方法扩增绵羊基因组上的微卫星DNA序列后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,采用改良的银染法对微卫星位点进行多态性检测,染色结果与常规银染法相比,该方法具有灵敏度高、背景浅、污染小、条带清晰等突出特点,能有效地控制染色背景,显著提高检测分辨率,整个染色过程所需时间短,具有广泛的推广价值。 展开更多

关键词 银染 微卫星 聚丙烯酰胺凝胶电泳 降落聚合酶链反应

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大豆DNA提取方法及降落PCR检测转基因成分的研究 被引量：7

12

作者 陈彦 潘见 +2 位作者 王亚 惠爱玲 杨毅 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2009年第24期355-358,共4页

采用改良的CTAB法,植物基因组DNA小量制备试剂盒,SDS法和高盐低pH值法4种方法提取安徽市场上8种大豆种子的基因组DNA,首次用降落PCR(TD-PCR)检测转基因成分,并对阳性产物进行酶切验证。结果表明改良的CTAB法是一种简单、高效的大豆DNA... 采用改良的CTAB法,植物基因组DNA小量制备试剂盒,SDS法和高盐低pH值法4种方法提取安徽市场上8种大豆种子的基因组DNA,首次用降落PCR(TD-PCR)检测转基因成分,并对阳性产物进行酶切验证。结果表明改良的CTAB法是一种简单、高效的大豆DNA提取方法,能够满足各种分子生物学分析;TD-PCR显著提高了PCR扩增的特异性和效率,可有效检测大豆转基因成分,具有良好的应用前景。 展开更多

关键词 大豆 转基因成分 改良的CTAB法 降落PCR

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丹参铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因的克隆与生物信息学分析 被引量：15

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作者 纪砚耘 化文平 王喆之 《陕西师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期56-61,共6页

依据已构建的丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)cDNA文库和降落PCR的方法获得丹参胞质铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因,并用生物信息学方法对该基因编码产物从氨基酸组成、理化性质、亲水性/疏水性、二级结构以及功能等方面进行了预... 依据已构建的丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)cDNA文库和降落PCR的方法获得丹参胞质铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)基因,并用生物信息学方法对该基因编码产物从氨基酸组成、理化性质、亲水性/疏水性、二级结构以及功能等方面进行了预测和分析.结果表明,克隆得到的丹参Cu/Zn-SOD位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白,主要由无规则卷曲和延伸链等蛋白质二级结构元件构成,与其他植物的胞质Cu/Zn-SOD在序列组成、结构及活性位点等方面均有高度的相似性. 展开更多

关键词 Cu/Zn-SOD 降落PCR 丹参 生物信息学

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一种高特异性的改良降落PCR(英文) 被引量：4

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作者 张贵星 袁保梅 +2 位作者 许培荣 王建民 薛乐勋 《生命科学研究》 CAS CSCD 2002年第4期314-317,共4页

为提高基因组DNA中的基因PCR检出的特异性,设计了一种改良的降落PCR程序,并分别用TaqDNA聚合酶及高保真PfuDNA聚合酶进行实验.自盐藻Dunaliellabardawil中提取基因组DNA作为PCR模板,使用TaqDNA聚合酶及PfuDNA聚合酶,运用普通PCR和降落PC... 为提高基因组DNA中的基因PCR检出的特异性,设计了一种改良的降落PCR程序,并分别用TaqDNA聚合酶及高保真PfuDNA聚合酶进行实验.自盐藻Dunaliellabardawil中提取基因组DNA作为PCR模板,使用TaqDNA聚合酶及PfuDNA聚合酶,运用普通PCR和降落PCR程序,扩增胡萝卜素生物合成相关基因(cbr)上游启动子序列,并电泳比较PCR扩增产物的特异性.结果显示,使用普通Taq酶PCR,普通PCR程序产生200bp,500bp和1272bp长的三条带,而TD PCR程序仅克隆出1272bp的特异带;利用高保真的PfuDNA聚合酶作PCR,在TD PCR泳道中仅有1272bp一条带,而普通PCR除了1272bp的特异带外,还出现一条500bp的非特异带.无论使用普通Taq酶或高保真酶Pfu,改良的降落PCR程序均明显提高PCR的特异性,类似的降落PCR程序可望用于克隆用普通PCR难以克隆的基因片段,或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性. 展开更多

关键词 高特异性 改良降落PCR PfuDNA聚合酶

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应用降落PCR和正交设计优化AtSUC9 PCR反应体系 被引量：4

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作者 季策 张立军 +2 位作者 阮燕晔 吴晓丹 白雪梅 《生物技术》 CAS CSCD 2007年第3期40-42,共3页

目的:建立最适的AtSUC9 PCR反应体系。方法:应用降落PCR和正交设计,从Mg2+、dNTPs、引物、甘油4种因素3个水平,对拟南芥AtSUC99 PCR反应体系进行优化。结果:确立了适合拟南芥AtSUC99 PCR反应体系:在20μl反应体系中,含模板1μg,引物(20... 目的:建立最适的AtSUC9 PCR反应体系。方法:应用降落PCR和正交设计,从Mg2+、dNTPs、引物、甘油4种因素3个水平,对拟南芥AtSUC99 PCR反应体系进行优化。结果:确立了适合拟南芥AtSUC99 PCR反应体系:在20μl反应体系中,含模板1μg,引物(20μmol/L)0.5μl,dNTPs(10mmol/L)0.3μl,10×PCRbuffer2μl,Mg2+(25mmol/L)1.2μl,TaqDNAPolymerase1U,甘油10μl。结论:降落PCR和正交设计是一种有效的植物基因PCR体系优化方法。 展开更多

关键词 拟南芥 AtSUC99 TD PCR 正交设计

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谷子类胡萝卜素生物合成途径中番茄红素β-环化酶基因的克隆 被引量：2

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作者 赵倩 赖凡 +2 位作者 于静娟 朱登云 敖光明 《中国农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期1-6,共6页

利用降落PCR的方法 ,从谷子基因组中获得lcy b基因。全序列分析表明 ,其开放阅读框为 1782bp ,编码的蛋白由 5 94个氨基酸组成 ,分子质量为 6 772 4u。将获得的谷子lcy b基因序列与已发表的其他植物lcy b基因序列比较 ,发现所得到的基... 利用降落PCR的方法 ,从谷子基因组中获得lcy b基因。全序列分析表明 ,其开放阅读框为 1782bp ,编码的蛋白由 5 94个氨基酸组成 ,分子质量为 6 772 4u。将获得的谷子lcy b基因序列与已发表的其他植物lcy b基因序列比较 ,发现所得到的基因序列与单子叶植物黄水仙的同源性明显高于与双子叶植物的同源性。蛋白质序列比较发现中部和尾部的部分区段内氨基酸同源性较高 ,且都存在FLYAMP序列和FAD/NAD(P)结合区等植物LCY B的特征序列。Southern杂交结果表明 ,lcy b在基因组中以单拷贝存在。 展开更多

关键词 谷子 类胡萝卜素 生物合成 番茄红素Β-环化酶 基因克隆 降落PCR

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应用降落PCR检测减蛋综合征病毒的研究 被引量：2

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作者 张春杰 李银聚 +2 位作者 程相朝 吴庭才 郑祥海 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2003年第7期11-13,共3页

根据已发表的减蛋综合征病毒 (EDSV)核苷酸序列设计了 1对扩增长度为 1 .1kb左右的引物 ,采取降落PCR对EDSV gDNA进行扩增。结果 ,从 2份EDSV鸭胚尿囊液、3份人工感染鸡输卵管组织液的核酸抽提物中 ,均扩增出与设计大小完全一致的目的片... 根据已发表的减蛋综合征病毒 (EDSV)核苷酸序列设计了 1对扩增长度为 1 .1kb左右的引物 ,采取降落PCR对EDSV gDNA进行扩增。结果 ,从 2份EDSV鸭胚尿囊液、3份人工感染鸡输卵管组织液的核酸抽提物中 ,均扩增出与设计大小完全一致的目的片段 ,而对照样品的扩增均为阴性 ,该方法最低可检测到 32pg的EDSV gDNA。表明该降落PCR用于检测EDSV特异性和敏感性均较强 。 展开更多

关键词 减蛋综合征病毒 降落PCR 检测 特异性 敏感性 诊断 蛋鸡

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北方黑土土壤细菌16S rDNA扩增体系的优化 被引量：4

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作者 李秋红 吴凤芝 《土壤学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期341-347,共7页

采用降落PCR方法扩增目的基因，设计两次正交试验对PCR反应体系中的各组分浓度进行筛选，同时对退火时间、延伸时间及循环次数进行摸索。结果表明，适合北方黑钙土土壤细菌16SrDNA扩增体系为：在25μl体系中，10×buffer2．5μl，DN... 采用降落PCR方法扩增目的基因，设计两次正交试验对PCR反应体系中的各组分浓度进行筛选，同时对退火时间、延伸时间及循环次数进行摸索。结果表明，适合北方黑钙土土壤细菌16SrDNA扩增体系为：在25μl体系中，10×buffer2．5μl，DNA模板20ng，Mg^2＋ 2．5mmol L^-1,dNTPs0．25mmol L^-1，引物0．3μmol L^-1，TaqDNA聚合酶1．5U。降落PCR扩增程序为：95℃，5min；95℃，45s；65～56℃，60s；72℃，90s；每两个循环降低1℃。95℃，45s；55℃，60S；72℃，90s；10个循环。最后72℃，10min。 展开更多

关键词 土壤细菌16S RDNA 降落PCR 优化

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气肿疽梭菌鞭毛基因克隆载体的构建 被引量：8

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作者 张皓 田金华 +4 位作者 朴明淑 齐强 刘昕昕 李扬 金鑫 《延边大学农学学报》 2015年第2期91-95,共5页

根据GenBank中发表的气肿疽鞭毛蛋白的结构基因FliA(C)的序列,从中截取抗原表位部分基因序列,设计合成1对引物,引物的5`和3`端分别加入了BamHⅠ和XhoⅠ2个酶切位点。通过降落PCR法扩增合成长度为429bp的目的基因片段。将PCR产物克隆于pM... 根据GenBank中发表的气肿疽鞭毛蛋白的结构基因FliA(C)的序列,从中截取抗原表位部分基因序列,设计合成1对引物,引物的5`和3`端分别加入了BamHⅠ和XhoⅠ2个酶切位点。通过降落PCR法扩增合成长度为429bp的目的基因片段。将PCR产物克隆于pMD18-T simple载体,之后将其转入大肠杆菌DH 5α感受态细胞筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD18-T-FliA(C)并进行PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定。结果表明:扩增的目的基因与GenBank登录的ATCC10092菌株序列同源性为99%,4个碱基不同,仅有1个氨基酸不同。测出的基因序列发表于GenBank,登录号为KF712490。试验证明用降落PCR方法能方便、快速、准确的获得目的基因片段。本试验成功构建了重组克隆载体pMD18-T-FliA(C),为气肿疽鞭毛蛋白的表达载体构建及鞭毛蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 气肿疽鞭毛蛋白基因 降落PCR 重组质粒 基因克隆

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一种优化的PCR方法——降落PCR扩增目的基因 被引量：21

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作者 万兵 闫杰 +3 位作者 季明春 张利宁 申厚凤 陈志琳 《江苏临床医学杂志》 2002年第2期127-129,共3页

目的 :尝试用一种新的PCR方法———降落PCR扩增目的基因。方法 :在构建人CD137-hIgG1Fc - pCDNA3融合蛋白真核表达载体以及在检测HBV多聚酶YMDD变异的过程中运用降落PCR扩增目的基因。结果 :扩增出的特异性条带与目的基因大小一致。结... 目的 :尝试用一种新的PCR方法———降落PCR扩增目的基因。方法 :在构建人CD137-hIgG1Fc - pCDNA3融合蛋白真核表达载体以及在检测HBV多聚酶YMDD变异的过程中运用降落PCR扩增目的基因。结果 :扩增出的特异性条带与目的基因大小一致。结论 :降落PCR省却了常规PCR中摸索最适退火温度的过程 ,对一些Tm值相近的PCR反应可应用一套温度程序扩增 。 展开更多

关键词 优化 降落PCR 退火温度 基因扩增 乙型肝炎病毒 HBV

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