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贵州省2017年~2023年PEDV和PoRVA流行病学调查及PoRVA VP7、VP4基因的遗传演化分析
1
作者 田红利 柳佳佳 +6 位作者 梁海英 曾智勇 汤德元 王彬 边孟婷 黄书 潘向英 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期791-798,共8页
为了解贵州省猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪A群轮状病毒(PoRVA)的流行情况,本研究对2017年~2023年来自贵州省9个地区139个猪场的165份仔猪粪便样品进行Taq Man RT-qPCR检测,并对PoRVA阳性样品VP7、VP4基因进行RT-PCR扩增、测序,遗传进化... 为了解贵州省猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪A群轮状病毒(PoRVA)的流行情况,本研究对2017年~2023年来自贵州省9个地区139个猪场的165份仔猪粪便样品进行Taq Man RT-qPCR检测,并对PoRVA阳性样品VP7、VP4基因进行RT-PCR扩增、测序,遗传进化分析及其编码氨基酸序列的变异分析。结果显示,PEDV、PoRVA和PEDV+PoRVA的感染率分别为67.88%(112/165)、38.79%(64/165)和21.21%(35/165),且在不同年份、不同地区和不同季节均检出三者的感染。PCR结果显示,本实验扩增出27株PoRVA VP7基因和22株VP4基因;遗传进化分析结果显示共鉴定出6种G型和3种P型,其中G9(29.63%)和P[13](68.18%)为优势基因型,G3、G4、G5、G11、G26、P[6]和P[23]分别占7.41%、22.22%、22.22%、3.70%、14.81%、13.64%、18.18%。21份PoRVA样品鉴定出10种G/P组合基因型,G9P[13](19.05%)为优势组合基因型,G4P[13]、G5P[13]、G3P[13]、G4P[6]、G5P[23]、G9P[23]、G11P[13]、G26P[6]、G26P[13]分别占14.29%、14.29%、9.52%、9.52%、9.52%、9.52%、4.76%、4.76%及4.76%。同源性分析结果显示,27株VP7基因和22株VP4基因序列与NX疫苗株相应基因序列之间的同源性分别为75.5%~94.0%和68.5%~75.6%,氨基酸序列的同源性分别为78.3%~96.6%和72.0%~82.5%,部分PoRVA上述基因序列与国外、人源RVA的同源性最高。氨基酸位点变异分析结果显示,与NX疫苗株相比,所测PoRVA VP7和VP4氨基酸序列均存在特征性位点的变异,其中G型PoRVA VP7无氨基酸位点的缺失和插入,G9型PoRVA VP7存在3处(I^(208)T、K^(212)A/V/T、V^(271)I)变异,G3、G4、G5、G11和G26型PoRVA VP7存在17处(S^(28)R/K、A^(29)I/T/M/V、L^(40)I/V、V^(44)L、S^(71)T、Q^(73)G/N/S/E、S^(90)A/Q/K/R、G^(94)N/S/A/K、N^(100)D/E、T^(122)A/S、T^(147)A/G/N/D、Q^(189)S/T、I^(208)L/Q/T、K^(212)T/I/P/N、A^(213)N/T/D、E^(267)D/N、V^(271)I)变异;3株P[6]型PoRVA VP4在aa136缺失T,13株P[13]型PoRVA VP4在aa188~aa189插入E/D~Y/F,P[6]、P[13]和P[23]型PoRVA VP4存在26处(I^(92)V、Q^(94)E、Q^(113)T/P/N、T^(114)N/Q/S/R、T^(115)Q/E、N^(116)S/L/T、P^(148)A/Q/V/S/I、T^(180)E/N/D、P^(162)T、I^(174)V/L、C^(269)Y、R^(281)N、A^(286)L/S、T^(302)N、A^(340)S/V、T^(379)S、T^(403)A、S^(438)P、R^(553)K、A^(569)A、M^(570)L、A^(608)S、E^(660)D、I^(726)F、K^(733)N、S^(739)T)变异。上述结果表明,2017年~2023年贵州省PEDV和PoRVA感染率高且基因型复杂,其中PoRVA存在以G9型、P[13]型为主的流行,优势组合基因型为G9P[13]。本研究丰富了贵州省PEDV和PoRVA的流行病学资料,尤其为PoRVA感染的防控和候选疫苗株的筛选提供了参考数据。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪A群轮状病毒 分子流行病学 VP7和vp4基因 遗传演化分析
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猪轮状病毒vp4基因在大肠杆菌中的表达 被引量：2
2
作者 宋岩 李一经 +3 位作者 魏丽丽 于小龙 樊琛 师东方 《中国病毒学》 CSCD 2004年第5期462-466,共5页
以猪轮状病毒JL94株核酸为模板扩增该病毒vp4全基因,对扩增产物进行测序及序列比较;根据VP4的5’端(1bp～750bp)特异片段主要决定其活性的观点,再设计一对引物扩增该主要抗原位点基因,将此主要抗原位点基因同pGEX-6P-1载体连接并转化入E... 以猪轮状病毒JL94株核酸为模板扩增该病毒vp4全基因,对扩增产物进行测序及序列比较;根据VP4的5’端(1bp～750bp)特异片段主要决定其活性的观点,再设计一对引物扩增该主要抗原位点基因,将此主要抗原位点基因同pGEX-6P-1载体连接并转化入E.coli.BL21(DE3)plays,经IPTG诱导表达出蛋白质;对表达的蛋白进行Westernblot分析、纯化和血清中和抗体试验。结果表明:JL94株与国外分离株CRW-8株、BEN-307株vp4全基因片段氨基酸同源性分别为96.98%和98.05%,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型;经IPTG诱导VP4主要抗原位点基因获得了高效表达,表达量占菌体蛋白的26%;Westernblot结果和所表达的融合蛋白免疫小鼠产生的中和抗体能阻断JL94在MA104细胞上引起的细胞病变,说明所表达蛋白有良好的生物学活性。 展开更多
关键词 猪轮状病毒 vp4基因 vp4主要抗原位点基因 原核表达
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猪A组轮状病毒Vp4全基因在MA-104细胞中的表达与DNA疫苗的研究
3
作者 张二芹 王会岩 +1 位作者 宫宇宏 王春凤 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期306-311,共6页
本研究采用LipofectamineTM2000将真核重组表达质粒pVAXI-Vp4转染至MA-104细胞中,得到了表达。以荧光抗体检测法和RT-PCR法双重检测了真核重组表达质粒pVAXI-Vp4在MA-104细胞中的表达情况。并将pVAXI-Vp4免疫BALB/c鼠,检测其血清抗体和... 本研究采用LipofectamineTM2000将真核重组表达质粒pVAXI-Vp4转染至MA-104细胞中,得到了表达。以荧光抗体检测法和RT-PCR法双重检测了真核重组表达质粒pVAXI-Vp4在MA-104细胞中的表达情况。并将pVAXI-Vp4免疫BALB/c鼠,检测其血清抗体和脾脏中的淋巴细胞增殖情况及CD4+,CD8+T细胞的数量变化情况。结果表明,猪A组轮状病毒Vp4全基因不但在哺乳动物细胞中获得了表达,而且将真核重组表达质粒pVAX-I-Vp4给动物免疫后,获得了免疫效果。这为pVAXI-Vp4DNA核酸疫苗的进一步推广应用提供了科学依据。 展开更多
关键词 轮状病毒vp4 MA-104细胞 表达 pVAXI-vp4 免疫活性
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G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6和NSP4编码基因的分子特征 被引量：9
4
作者 李丹地 段招军 +10 位作者 章青 刘娜 谢华萍 崔淑贤 靳淼 杨学梅 郑丽舒 黄灿平 匡治州 王忠山 方肇寅 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期195-201,共7页
最近在亚洲首次发现并报道了感染人的G5型人A组轮状病毒LL36755株,为进一步探讨其进化来源,克隆了G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6、NSP4编码基因,并分析其基因序列的分子特征。结果发现卢龙株LL36755为罕见的G5P[6]型,其VP6的亚... 最近在亚洲首次发现并报道了感染人的G5型人A组轮状病毒LL36755株,为进一步探讨其进化来源,克隆了G5型人A组轮状病毒LL36755株的VP4、VP6、NSP4编码基因,并分析其基因序列的分子特征。结果发现卢龙株LL36755为罕见的G5P[6]型,其VP6的亚群为SGⅡ型,NSP4的基因型为B型。系统进化树分析表明,卢龙株LL36755的VP7、VP4编码基因与猪来源的毒株关系密切,而VP6、NSP4编码基因与人来源的毒株紧密相联系。可以推断新的人腹泻A组轮状病毒LL36755株是猪的VP7,VP4编码基因与人的VP6,NSP4编码基因的自然重组;而且该毒株不是G5的原型,很可能是人类轮状病毒与猪轮状病毒毒株的自然重组后逐步进化而来。 展开更多
关键词 人类轮状病毒 vp4 型 VP6 NSP4 重组
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草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：11
5
作者 曾伟伟 王庆 +2 位作者 王英英 石存斌 吴淑勤 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期450-456,共7页
为了建立针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)流行株的血清学检测方法,实验构建了能高效表达GCRV HZ08株主要衣壳蛋白VP4的重组表达载体pET32a-S6,利用纯化的VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经过克隆和筛选,获得3... 为了建立针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)流行株的血清学检测方法,实验构建了能高效表达GCRV HZ08株主要衣壳蛋白VP4的重组表达载体pET32a-S6,利用纯化的VP4重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,经过克隆和筛选,获得3株能稳定分泌抗VP4重组蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)的杂交瘤细胞,分别命名为2C2、2F3和5E5。抗体经亚型鉴定均为IgG1,轻链为κ链;间接ELISA试验证明,3株杂交瘤细胞分泌的MAb可特异性识别GCRV-HZ08,与GSRV,ISKNV,IHNV均无交叉反应。选择2C2作为腹水生产细胞株,免疫小鼠后腹水ELISA效价为1∶720 000;IFA和Western-blotting结果显示,这株杂交瘤细胞分泌的MAb能够特异性识别GCRV-HZ08病毒粒子。本实验制备的MAb具有良好的生物学特性,为GCRV流行株血清学检测方法的建立及VP4蛋白相关功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 草鱼呼肠孤病毒 vp4蛋白 单克隆抗体
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表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒对新生小鼠的被动免疫保护作用 被引量：8
6
作者 刘馨 张光明 +2 位作者 李鸿钊 谢天宏 孙茂盛 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2007年第1期33-36,共4页
目的探讨表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒(Ad5/VP4)对新生小鼠的被动免疫保护作用。方法在293细胞上扩增表达猴轮状病毒SA11株VP4抗原的重组腺病毒并纯化。将轮状病毒抗体阴性的小鼠交配后的雌性小鼠,分别通过肌肉注射、滴鼻和口服免... 目的探讨表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒(Ad5/VP4)对新生小鼠的被动免疫保护作用。方法在293细胞上扩增表达猴轮状病毒SA11株VP4抗原的重组腺病毒并纯化。将轮状病毒抗体阴性的小鼠交配后的雌性小鼠,分别通过肌肉注射、滴鼻和口服免疫纯化后的重组腺病毒,生产后第7天和第8天,用轮状病毒SA11(1·0×106PFU)口服攻击乳鼠2次,观察出现腹泻症状的乳鼠的比例,并用ELISA检测母鼠的血清以及乳鼠胃囊乳块中的轮状病毒特异性抗体。同时以含有部分E1区基因的腺病毒5型载体(Ad5)作为对照。结果经3种不同途径免疫母鼠后,在血清和乳汁中均能检测到轮状病毒VP4特异性抗体。经滴鼻免疫的母鼠喂养的乳鼠,经攻击后保护率为100%(11/11);经肌肉注射免疫的母鼠喂养的乳鼠,经攻击后保护率为30%(3/10);经口服免疫的母鼠喂养的乳鼠,经轮状病毒攻击后保护率为80%(8/10)。对照组的小鼠全部出现了腹泻症状。结论表达轮状病毒VP4抗原的重组腺病毒经滴鼻免疫母鼠后,能在乳汁中产生特异性的IgA和IgG抗体,并能保护新生小鼠对抗轮状病毒的攻击,保护率达100%。 展开更多
关键词 轮状病毒 vp4抗原 重组腺病毒 被动免疫保护
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重叠PCR法合成轮状病毒抗原基因VP4 被引量：8
7
作者 冉丹霞 王荣荣 +2 位作者 郝亚宁 宋方洲 马永平 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期118-119,124,共3页
用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得轮状病毒VP4基因。根据Genbank中鼠VP4基因的序列设计34对引物,用overlap PCR法合成VP4全基因的两个片段A、B,将A、B分别连入pMD19-T simple载体,测序结果显示,成功合成了VP4全基因。证明了... 用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得轮状病毒VP4基因。根据Genbank中鼠VP4基因的序列设计34对引物,用overlap PCR法合成VP4全基因的两个片段A、B,将A、B分别连入pMD19-T simple载体,测序结果显示,成功合成了VP4全基因。证明了重叠延伸PCR法是获得目的基因的有效方法。 展开更多
关键词 轮状病毒 vp4基因 合成 重叠延伸PCR
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轮状病毒VP4、VP7基因的克隆与核苷酸序列分析 被引量：9
8
作者 王鹏雁 陈创夫 +3 位作者 余兴龙 徐兴然 涂长春 张高轩 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期99-103,共5页
用反转录聚合酶链式反应 (RT_PCR)技术 ,从轮状病毒感染的细胞中扩增 816bp、916bp的VP4、VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM_T上 ,转化至受体菌DH5α中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定 ,证明重组质粒... 用反转录聚合酶链式反应 (RT_PCR)技术 ,从轮状病毒感染的细胞中扩增 816bp、916bp的VP4、VP7片段中抗原表位区。通过T4DNA连接酶将其直接连接于克隆载体质粒pGEM_T上 ,转化至受体菌DH5α中。提取质粒经PCR扩增、酶切鉴定 ,证明重组质粒pT_V4、PT_V7中含有轮状病毒的VP4、VP7基因片段。经核苷酸序列分析 ,表明克隆了轮状病毒主要保护性抗原VP4。 展开更多
关键词 核苷酸序列分析 轮状病毒 基因克隆 vp4 VP7
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柯萨奇病毒A16型VP1-VP4基因克隆及其表达产物的抗原相关性分析 被引量：4
9
作者 宋远斌 何思杰 +4 位作者 余楠 陈欣欣 王斌 车小燕 曾其毅 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第12期1713-1717,共5页
目的克隆并表达柯萨奇病毒A16型VP1-VP4蛋白基因,初步分析其抗原相关性。方法抽提病毒RNA,经RT-PCR方法分别扩增出VP1-VP4蛋白基因片段,经克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物经8 mol/L尿素洗涤及镍柱亲和层析纯化后,用柯萨奇病毒A16... 目的克隆并表达柯萨奇病毒A16型VP1-VP4蛋白基因,初步分析其抗原相关性。方法抽提病毒RNA,经RT-PCR方法分别扩增出VP1-VP4蛋白基因片段,经克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物经8 mol/L尿素洗涤及镍柱亲和层析纯化后,用柯萨奇病毒A16型病毒免疫兔血清及肠道病毒71型病毒免疫兔血清对重组蛋白进行Western blotting及ELISA分析其抗原相关性及交叉反应性。结果成功构建的重组质粒pQE30a/VP1-VP4并经IPTG诱导,重组蛋白VP1-VP4高效表达并纯化成功,经Western blotting及ELISA证实重组蛋白VP1-VP4可以被CVA16免疫兔血清特异识别,部分与肠道病毒71型免疫血清存在交叉反应。结论在大肠杆菌M15中高效表达出柯萨奇病毒A16型VP1-VP4蛋白,经纯化产物具有较强的抗原反应性。 展开更多
关键词 柯萨奇病毒A16型 VP1蛋白 VP2蛋白 VP3蛋白 vp4蛋白 克隆 原核表达 抗原反应性
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轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达 被引量：7
10
作者 王鹏雁 陈创夫 +3 位作者 余兴龙 徐兴然 涂长春 张高轩 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2003年第1期5-10,共6页
经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒 pT VP4和 pT VP7中扩增VP4、VP7基因 ,连接至 pGEM 5zf(+ )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒 pET 2 8a(+ ) ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析证明 ,连接向位和阅读... 经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒 pT VP4和 pT VP7中扩增VP4、VP7基因 ,连接至 pGEM 5zf(+ )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒 pET 2 8a(+ ) ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析证明 ,连接向位和阅读框架是正确的 ,从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体 pET2 8a VP4、pET2 8a VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明 ,表达的目的蛋白以包涵体的形式存在 ,蛋白的分子量分别为 37.6 9和 36 .2 0ku ,表达量占菌体总蛋白的比例分别为 17.1%和 14 .4 %。 展开更多
关键词 轮状病毒 vp4基因 VP7基因 原核表达载体 载体构建
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1994～1997年广州地区轮状病毒VP7、VP4型感染的流行病学与临床特征 被引量：14
11
作者 潘瑞芳 区文玑 +5 位作者 何婉儿 梁文青 何娟 常汝虚 钱渊 张又 《实用儿科临床杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期178-179,共2页
目的　了解我国南方婴幼儿轮状病毒VP7、VP4型感染性腹泻的流行及临床特征。方法　对 1994年 11月～ 1997年 10月连续 3 6个月收集 10 99例病毒性腹泻患儿粪便标本行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)检测 ,阳性者行VP7、VP4型别鉴定、临床分... 目的　了解我国南方婴幼儿轮状病毒VP7、VP4型感染性腹泻的流行及临床特征。方法　对 1994年 11月～ 1997年 10月连续 3 6个月收集 10 99例病毒性腹泻患儿粪便标本行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)检测 ,阳性者行VP7、VP4型别鉴定、临床分析。结果　 10 99例粪便标本进行PAGE检测 ,检出轮状病毒 50 1例 ,阳性率45.6%。定型为VP7型 2 71例 ,VP7G1型 2 3 3例 ,占总数 86% ;其次为G2、G3型 ,未发现G4型。定型为VP4193例 ,VP41A型 160例 ,占总数 83 % ;其次为 1B及 2型 ,未发现 3型。高发季节为 11月至次年 2月 ,1岁内VP41A型的发病率比VP7G1型多 ,前者为 73 % ,后者为 57%。 2岁时发病率相似 ,分别为 93 .1%和 90 .1%。VP7G1型高热较其他型高 2 7% ,而VP41A型低热比例最高 (占 91% ) ,VP41A、1B绝大部分 (98%、96% ) ,伴轻度脱水。而VP7G1型中度脱水多见。VP41A型大便在 10次 /d以上。电解质紊乱情况VP7较VP4型较重。结论　1994～ 1997年广州地区轮状病毒型别集中在VP7G1及VP4A1型 ,流行季节为 11月至次年 2月 ,但病例终年不断。临床表现方面VP7G1型比VP41A型感染重 ,治疗效果理想 。 展开更多
关键词 轮状病毒 VP7型 vp4型 感染性腹泻 流行病学调查 临床特征 电泳检测 婴幼儿 1994~1997年 广州地区
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猪轮状病毒VP4蛋白基因在大肠杆菌中的表达 被引量：6
12
作者 肖长峰 刘成倩 +4 位作者 卢永红 陈斌 吴双林 张天庆 易建中 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第22期10431-10432,10448,共3页
[目的]研究猪的轮状病毒VP4蛋白基因在BL21大肠杆菌中的表达。[方法]以猪肺脏组织中分离的总RNA为模板,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增VP4蛋白的部分基因,将PCR产物克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒PGEX-4T-1-VP... [目的]研究猪的轮状病毒VP4蛋白基因在BL21大肠杆菌中的表达。[方法]以猪肺脏组织中分离的总RNA为模板,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增VP4蛋白的部分基因,将PCR产物克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒PGEX-4T-1-VP4并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。将重组载体PGEX-4T-1-VP4转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达和SDS-PAGE分析,并对重组大肠杆菌进行可溶性分析。[结果]对猪肺脏组织中分离的总RNA进行RT-PCR扩增,获得875 bp的VP4部分基因,重组质粒PGEX-4T-1-VP4经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切和测序鉴定后,插入的猪轮状病毒VP4的cDNA编码区序列与已公布的猪GenBank核酸序列比对结果为99.5%;将重组质粒pGEX-4T-1-VP4-转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约58 kDa融合蛋白带。[结论]该研究为进一步研究轮状病毒的疫苗研制奠定了基础。 展开更多
关键词 轮状病毒 vp4基因 克隆 原核表达
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人A组轮状病毒北京地方株VP4血清型特异片段编码基因的序列分析 被引量：20
13
作者 肖玮 钱渊 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第3期197-203,共7页
轮状病毒是引起婴幼儿严重腹泻的重要病原，其第四基因编码主要中和抗原VP4，而VP4可裂解为VP8和VP5两个片段。VP8为抗原型特异性片段。克隆并测定了具有代表性的三个轮状病毒北京株VP4编码基因5′端（VPS＋VPS一部分）887个核苷酸序列... 轮状病毒是引起婴幼儿严重腹泻的重要病原，其第四基因编码主要中和抗原VP4，而VP4可裂解为VP8和VP5两个片段。VP8为抗原型特异性片段。克隆并测定了具有代表性的三个轮状病毒北京株VP4编码基因5′端（VPS＋VPS一部分）887个核苷酸序列并据此推导出其氨基酸序列。结果表明，相同血清型的地方株和标准株之间具有高度同源性（92％～966％），不同血清型间则变异较大（70．5％～71％）。氨基酸最大变异处位于aa84～172，并对胰酶作用位点在致病性中的可能性进行了讨论。 展开更多
关键词 轮状病毒 vp4 序列分析
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猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌的制备及其免疫原性分析 被引量：4
14
作者 叶丽萍 郝凤奇 +1 位作者 杨桂连 王春凤 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期790-793,共4页
为了解猪轮状病毒(RV)Vp4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠是否能产生有效的免疫保护作用,本研究应用电转化技术将猪源A组RV重组质粒pW425et-Vp4转化至嗜酸乳杆菌中,重组菌经SDS-PAGE分析可见约87ku的重组蛋白。Western blot分析表明该蛋白... 为了解猪轮状病毒(RV)Vp4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠是否能产生有效的免疫保护作用,本研究应用电转化技术将猪源A组RV重组质粒pW425et-Vp4转化至嗜酸乳杆菌中,重组菌经SDS-PAGE分析可见约87ku的重组蛋白。Western blot分析表明该蛋白能与猪RV多克隆抗体反应。大量培养pW425et-Vp4乳酸菌,经离心加入灭菌脱脂乳液给BALB/c小鼠灌服;应用ELISA方法检测血清抗体水平,试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,最后进行小鼠免疫保护性试验。结果表明pW425et-Vp4乳酸菌能增强小鼠的黏膜免疫反应,对猪PV强毒株的攻击具有一定的保护作用,为下一步在猪体内进行试验奠定基础。 展开更多
关键词 轮状病毒vp4基因 乳酸菌 制备 免疫原性
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农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化花生的研究 被引量：3
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作者 刘峰 万书波 +4 位作者 毕玉平 闫彩霞 李春娟 赵晋平 单世华 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期1285-1289,共5页
选用鲁花14与花育23花生品种,通过农杆菌介导开展了轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化研究,从转化植株中随机选取26株表现Kan抗性植株进行nptII基因的PCR检测,结果有22株能扩增出620bp左右的nptII基因条带,阳性率约为84.62%。提取nptII... 选用鲁花14与花育23花生品种,通过农杆菌介导开展了轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化研究,从转化植株中随机选取26株表现Kan抗性植株进行nptII基因的PCR检测,结果有22株能扩增出620bp左右的nptII基因条带,阳性率约为84.62%。提取nptII基因显示为阳性的植株叶片DNA作模板,用VP4基因特异引物进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳分析,所有nptII基因阳性的植株均扩增出了约2350bp的特异性条带,而野生型没有。对部分转基因植株进一步进行PCR-Southern杂交和Southern杂交分析,发现转基因植株中出现了阳性杂交信号,表明VP4基因的确已经整合到花生的基因组中,并且是1-2个拷贝。用RT-PCR分析了11株转G1VP4基因的植株,证明插入鲁花14中的VP4基因已经正常转录,利用Westernblot方法检测筛选到的4株转基因花生,分别提取其蛋白,在30kD处出现特异性蛋白条带,这为获得转基因创新种质材料奠定了基础。 展开更多
关键词 花生 子叶 遗传转化 vp4基因
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2007—2008年肠道病毒71型北京地区分离株的VP4基因序列分析 被引量：13
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作者 李玉运 朱汝南 +4 位作者 钱渊 邓洁 孙宇 王芳 赵林清 《微生物与感染》 2009年第1期16-21,共6页
为了解2007-2008年北京地区流行的肠道病毒71型(EV71)是否存在基因序列变异及其与病毒毒力的关系,我们选择2007年分离的3株EV71(其中1株分离自重症手足口病患儿的咽拭子标本,其余2株分离自普通手足口病患儿咽拭子标本)和2008年分离的5株... 为了解2007-2008年北京地区流行的肠道病毒71型(EV71)是否存在基因序列变异及其与病毒毒力的关系,我们选择2007年分离的3株EV71(其中1株分离自重症手足口病患儿的咽拭子标本,其余2株分离自普通手足口病患儿咽拭子标本)和2008年分离的5株EV71(其中3株分离自重症手足口病患儿的咽拭子或鼻拭子标本,2株分离自普通手足口病患儿的疱疹液标本),提取基因组RNA,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增得到VP4基因片段,并进行核苷酸序列测定,使用生物信息软件与GenBank中的EV71 VP4基因进行序列及病毒型别分析。结果表明,所测得的8株EV71 VP4基因全长均为207bp,编码69个氨基酸,理论相对分子质量(Mr)为7×103。8株EV71病毒VP4基因的核苷酸同源性在94%～100%,与GenBank中其他EV71病毒株VP4的核苷酸同源性为82%～100%,与阜阳、深圳和台湾等地区流行的EV71 VP4的核苷酸同源性比其他地区高。除了与印度报道的VP4编码的氨基酸在第7和54位不同外(印度株:7位蛋氨酸,54位苏氨酸;其余株7位苏氨酸,54位丙氨酸),这8株EV71VP4编码的氨基酸序列之间以及与其他EV71 VP4编码的氨基酸同源性均为100%。8株EV71病毒VP4与文献报道的3株重症感染病毒株VP4(BrCr、MS和NCKU9822)核苷酸有较大差别,而8株病毒株中从重症感染(BJ97、BJ110B、BJ110Y和BJ4243)与轻症感染(BJ25、BJ47、BJ65和BJ67)分离到的毒株之间VP4基因序列未见明显改变,只有几个核苷酸存在差别。VP4核苷酸序列的进化树分析表明,这8株EV71均属于C4亚型,显示2007-2008年北京地区流行的EV71的VP4基因相当保守,分离自伴有神经系统感染的重症手足口病和普通手足口病患儿的EV71的VP4基因之间在核苷酸水平未出现同样的变异。结果提示,近2年来北京地区所流行的EV71属C4亚型。 展开更多
关键词 肠道病毒71型 vp4基因 手足口病 北京
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Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VP4、VP35蛋白多克隆抗体制备及其免疫原性分析 被引量：5
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作者 宗乾坤 张也 吕利群 《水产学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期355-362,共8页
为建立针对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的血清学检测方法,分别构建了GCRV JX02株外衣壳蛋白VP4、VP35的原核重组表达质粒PGEX-4T-3-S6、PGEX-4T-3-S11,用纯化的重组蛋白r VP4、r VP35分别免疫小鼠制得相应的多克隆抗体,用间接ELISA方法测... 为建立针对Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的血清学检测方法,分别构建了GCRV JX02株外衣壳蛋白VP4、VP35的原核重组表达质粒PGEX-4T-3-S6、PGEX-4T-3-S11,用纯化的重组蛋白r VP4、r VP35分别免疫小鼠制得相应的多克隆抗体,用间接ELISA方法测定2种抗体的效价,用Western Blot鉴定抗体的特异性。SDS-PAGE分析细菌表达的r VP4、r VP35大小分别约为98ku和61ku,且都主要以包涵体的形式存在;间接ELISA方法测定制备的抗体效价分别约为1:4×105和1:106;Western Blot结果显示,制备的2种多克隆抗体都既能够识别原核表达的重组蛋白,又能够识别JX02毒株上的对应蛋白,并且发现感染JX02的草鱼血清中存在结合VP4、VP35的相应抗体。本研究制备的2种多克隆抗体都具有良好的生物学特性,并且这2种重组蛋白作为相应抗体捕获原可以用于通过检测抗病毒抗体来确诊草鱼是否感染Ⅱ型GCRV。本研究将为GCRV主要流行株血清学检测方法的建立以及VP4、VP35蛋白相关功能研究奠定基础。 展开更多
关键词 Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒 原核表达 vp4蛋白 VP35蛋白 多克隆抗体
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农杆菌介导鼠源轮状病毒vp4基因转化马铃薯条件优化研究 被引量：4
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作者 李晋涛 吴玉章 +1 位作者 费蕾 牟芝蓉 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第10期1149-1152,共4页
目的　获得马铃薯再生和农杆菌介导的遗传转化体系。方法　以马铃薯品种“台湾红”为受体材料 ,对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了研究。结果　诱愈培养基为MS + 0 1mg L 2 ,4-D + 1mg LBA ,出芽培养基为MS + 1mg LZT +5 0mg ... 目的　获得马铃薯再生和农杆菌介导的遗传转化体系。方法　以马铃薯品种“台湾红”为受体材料 ,对其再生和农杆菌介导的遗传转化体系进行了研究。结果　诱愈培养基为MS + 0 1mg L 2 ,4-D + 1mg LBA ,出芽培养基为MS + 1mg LZT +5 0mg LGA3 ,卡那霉素浓度为 5 0mg L ,农杆菌液浓度为A6 0 0 =0 5。通过该体系将一鼠源轮状病毒外壳蛋白基因vp4导入马铃薯中 ,获得了具卡那霉素抗性的转化植株。经PCR验证 ,外源基因已导入马铃薯基因组中。结论　获得相对高效的马铃薯遗传转化体系 ,并成功地将外源基因转入马铃薯中。 展开更多
关键词 鼠源轮状病毒 vp4基因 基因转化 农杆菌 马铃薯 转基因植物
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表达猪轮状病毒VP4基因重组乳酸球菌表达载体构建及免疫原性分析 被引量：2
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作者 李桂伟 乔薪瑗 +4 位作者 刘伯臣 马广鹏 刘敏 刘力威 李一经 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期3672-3678,共7页
【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建... 【目的】构建猪轮状病毒主要保护性抗原VP4基因的重组乳酸乳球菌口服疫苗,为猪轮状病毒的防治提供有效方法。【方法】将猪轮状病毒免疫保护性抗原基因VP4主要结构功能区定向插入乳酸菌表面表达载体pNZ8112,电转化乳酸乳球菌NZ9000,构建了pNZ8112/NZ9000乳酸乳球菌表面表达系统。通过SDS-PAGE、Western-blot和免疫荧光方法鉴定,以此活菌系统口服免疫6～8周龄Balb/c小鼠,测定了免疫动物的局部体液免疫和系统免疫应答。【结果】证明插入的外源基因在菌体表面得到了正确表达,表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌免疫动物后,分别在粪便、泪液和阴道洗液中检测到了特异性分泌型IgA抗体和在血液中检测到了IgG抗体的存在;体外细胞中和试验结果表明,血清抗体对猪轮状病毒的中和效价为1﹕40。【结论】表达猪轮状病毒免疫保护性抗原的重组乳酸乳球菌口服免疫动物能够产生良好的局部和系统体液免疫应答而且具有免疫中和效力。 展开更多
关键词 猪轮状病毒vp4蛋白 乳酸乳球菌 表面表达 免疫原性分析
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轮状病毒VP4蛋白与肠产毒性大肠杆菌热稳定肠毒素蛋白的融合表达 被引量：3
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作者 王鹏雁 陈创夫 +3 位作者 余兴龙 徐兴然 涂长春 张高轩 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2003年第1期76-77,81,共3页
利用DNA重组技术将轮状病毒 (RotavirusRV)VP4蛋白主要抗原编码区基因与产肠毒素大肠杆菌 (Enteotoxi genicEscherichiacoliETEC)热稳定肠毒素 (Heat -stableenterotoxinEscherichiacoliST)基因融合 ,插入原核表达质粒 pET -2 8a(+)中 ,... 利用DNA重组技术将轮状病毒 (RotavirusRV)VP4蛋白主要抗原编码区基因与产肠毒素大肠杆菌 (Enteotoxi genicEscherichiacoliETEC)热稳定肠毒素 (Heat -stableenterotoxinEscherichiacoliST)基因融合 ,插入原核表达质粒 pET -2 8a(+)中 ,经PCR、酶切、测序分析表明已将vp4 -st片段克隆入PET - 2 8a(+) ,而且具有正确的读码框和方向性 ,正确构建了VP4 -ST的融合表达载体 pET2 8a -VP4 -ST。表达质粒转化受体菌BL2 1(DE3 ) plysS ,取经IPTG诱导后表达的目的蛋白进行SDS -PAGE、凝胶薄层扫描分析。结果表明 :表达的目的蛋白以包涵体的形式存在 ,大小约 4 0 2kDa,表达的蛋白量占菌体总蛋白的 13 0 4 8%。 展开更多
关键词 轮状病毒vp4 大肠杆菌肠毒素 融合表达载体
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