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GATA-3小干扰RNA载体对变应性鼻炎小鼠外周血单个核细胞中辅助性T细胞亚群功能的体内调节机制
1
作者 李玉晓 贺铭 +1 位作者 王天蓉 王雨 《中国耳鼻咽喉头颈外科》 CSCD 2023年第10期646-651,共6页
目的 研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)介导的GATA-3小干扰RNA载体(si-GATA-3)对变应性鼻炎(AR)小鼠外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中辅助性T细胞1(T-helper 1,Th1)和Th2功能的调节作用。方法 构建si-G... 目的 研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)介导的GATA-3小干扰RNA载体(si-GATA-3)对变应性鼻炎(AR)小鼠外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中辅助性T细胞1(T-helper 1,Th1)和Th2功能的调节作用。方法 构建si-GATA-3,用卵清蛋白构建BALB/c AR模型,si-GATA-3组、si-NC组(无目标基因小干扰RNA的空白对照组)分别用si-GATA-3和si-NC腹腔注射干预AR小鼠,AR组和正常对照组用等量的生理盐水干预。干预结束抽取其外周血,分离PBMCs和血浆。分别用荧光定量PCR和Western blot技术检测PBMCs中GATA-3和T-bet mRNA及其相应蛋白的表达量;用ELISA技术检测血浆中白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)的含量。结果 si-GATA-3滴度为5×10^(8)TU/ml。成功制备BALB/C小鼠AR模型。si-GATA-3能明显改善AR小鼠的症状。si-GATA-3组PBMCs中GATA-3 mRNA表达明显低于AR组和si-NC组(P<0.01),AR组和si-NC组明显高于正常对照组(P<0.01)。PBMCs中GATA-3蛋白和血浆中IL-4的表达量与GATA-3 mRNA表达相似。si-GATA-3组PBMCs中T-bet mRNA及其蛋白的相对表达均明显高于AR组和si-NC组(P<0.01),AR组和si-NC组二者均明显低于对照组(P<0.01)。si-GATA-3组血浆中IFN-γ的表达量高于正常对照组(P<0.05);AR组与si-NC组中IFN-γ的表达量均明显高于正常对照组和si-GATA-3组(P<0.01)。结论 si-GATA-3能有效改善AR小鼠症状,下调AR小鼠PBMCs中Th2细胞中GATA-3 mRNA、GATA-3蛋白和IL-4的表达,同时上调Th1细胞中T-bet mRNA和T-bet蛋白的表达,纠正Th2/Th1的免疫失衡。 展开更多
关键词 鼻炎 过敏 RNA干扰 模型 动物 小鼠 GATA-3 T-BET 慢病毒载体
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慢病毒靶向干扰Cx26抑制人高转移性肝癌HCCLM3细胞增殖及迁移 被引量：6
2
作者 阳洁 覃贵慧 陈军泽 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期937-941,共5页
目的探讨缝隙连接蛋白26(connexin 26,Cx26)对人高转移性肝癌HCCLM3细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响。方法构建Cx26干扰慢病毒载体感染HCCLM3细胞,用嘌呤霉素筛选稳定干扰Cx26表达的靶细胞,通过Realtime PCR和Western blot鉴定Cx26的mRN... 目的探讨缝隙连接蛋白26(connexin 26,Cx26)对人高转移性肝癌HCCLM3细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响。方法构建Cx26干扰慢病毒载体感染HCCLM3细胞,用嘌呤霉素筛选稳定干扰Cx26表达的靶细胞,通过Realtime PCR和Western blot鉴定Cx26的mRNA和蛋白表达情况;用"parachute"荧光示踪法检测细胞缝隙连接(gap junction,GJ)功能;用MTT法、流式细胞术、Transwell迁移实验分别检测干扰Cx26对HCCLM3细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响。结果 LV-Cx26组的Cx26 mRNA和蛋白表达明显低于LV-NC组和野生组细胞(P<0.01),并且LV-Cx26组的GJ功能也较LV-NC组和野生组明显减弱(P<0.01)。干扰Cx26可明显抑制HCCLM3细胞增殖(P<0.01),促进HCCLM3细胞凋亡(P<0.01),降低其体外迁移能力(P<0.01)。结论慢病毒靶向干扰Cx26表达可明显减弱其GJ功能,并抑制高转移性肝癌HCCLM3细胞增殖、迁移能力,促进凋亡,降低其恶性生物学特性。 展开更多
关键词 缝隙连接蛋白26 缝隙连接 肝癌 增殖 凋亡 迁移 慢病毒载体
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慢病毒介导的人PLK1RNA干扰对食管鳞癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用及机制 被引量：2
3
作者 刘晓影 陈丽梅 +5 位作者 张宝刚 冯卫国 王守训 杜长青 刘顺梅 赵春玲 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1528-1532,共5页
目的研究靶向人PLK1的RNA干扰对食管鳞癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响及其机制。方法介导PLK1 siRNA表达的重组慢病毒感染食管鳞癌细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测PLK1基因的干扰效率;应用裸鼠皮下移植瘤模型,进行慢病毒载体介导P... 目的研究靶向人PLK1的RNA干扰对食管鳞癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响及其机制。方法介导PLK1 siRNA表达的重组慢病毒感染食管鳞癌细胞,通过荧光定量PCR和Western blot检测PLK1基因的干扰效率;应用裸鼠皮下移植瘤模型,进行慢病毒载体介导PLK1基因的RNA干扰治疗,研究PLK1对体内食管鳞癌移植瘤生长的影响,并通过瘤组织免疫组化检测Caspase-3和CD31的表达及计算新生血管密度的方法,探讨PLK1影响移植瘤生长的相关机制。结果介导PLK1 siRNA表达的重组慢病毒能明显抑制食管鳞癌细胞中PLK1的表达及裸鼠体内移植瘤的生长。下调的PLK1可能通过调控Caspase-3的表达而诱导食管鳞癌细胞凋亡,通过抑制食管鳞癌的血管生成而抑制了食管鳞癌的恶性进展。结论 PLK1促进了食管鳞癌的恶性生长。PLK1有可能是治疗食管鳞癌的一个新靶点。 展开更多
关键词 PLK1基因 RNA干扰 慢病毒载体 食管鳞癌 Caspase-3 CD31 血管生成
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RANTES-K慢病毒载体的构建及其慢病毒的产生和鉴定 被引量：2
4
作者 孙利 张颖 +6 位作者 黄长形 张久聪 连建奇 张野 魏欣 孙永涛 白雪帆 《第四军医大学学报》 北大核心 2009年第3期247-250,共4页
目的:构建含CC细胞内趋化因子(CC-intrakine,RANTES-K)基因的慢病毒载体,为研究I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的基因治疗奠定基础.方法:应用PCR技术,扩增目的基因片段RANTES-K,纯化后的PCR产物定向连接入pLenti6/V5-D-TOPO(载体,构建慢... 目的:构建含CC细胞内趋化因子(CC-intrakine,RANTES-K)基因的慢病毒载体,为研究I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染的基因治疗奠定基础.方法:应用PCR技术,扩增目的基因片段RANTES-K,纯化后的PCR产物定向连接入pLenti6/V5-D-TOPO(载体,构建慢病毒载体pLenti6/V5-R-K,并在293FT细胞中建立慢病毒株,最后转染HeLa细胞观察RANTES蛋白的表达.结果:成功构建了慢病毒载体pLenti6/V5-R-K,并证实RANTES蛋白可在人宫颈癌HeLa细胞系内表达.结论:慢病毒载体可介导CC-intrakine(RANTES-K)基因高效稳定转染HeLa细胞,可用于抗HIV-1感染的基因治疗. 展开更多
关键词 HIV-1 趋化因子受体 细胞内趋化因子 慢病毒载体 基因治疗
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Generation of iPS cells using defined factors linked via the self-cleaving 2A sequences in a single open reading frame 被引量：12
5
作者 Lijian Shao Wei Feng +9 位作者 Yan Sun Hao Bai Jun Liu Caroline Currie Jaejung Kim Rafael Gama Zack Wang Zhijian Qian Lucy Liaw Wen-Shu Wu 《Cell Research》 SCIE CAS CSCD 2009年第3期296-306,共11页
导致的 pluripotent 的产生从体的细胞的茎(iPS ) 细胞被定义 reprogramming 抄写因素(TF ) 的同时的病毒的 transduction 成功地完成了。然而，这个过程为基因交货要求多重病毒的向量。作为结果，产生了 iPS 房间港口在他们的染色体的... 导致的 pluripotent 的产生从体的细胞的茎(iPS ) 细胞被定义 reprogramming 抄写因素(TF ) 的同时的病毒的 transduction 成功地完成了。然而，这个过程为基因交货要求多重病毒的向量。作为结果，产生了 iPS 房间港口在他们的染色体的众多的病毒的集成地点。这能增加基因 mutagenesis 和 genomic 不稳定性的概率，并且介绍重要障碍给研究和 iPS 房间的临床的申请研究。在这篇论文，我们在场定义因素是的一个简单 lentivirus reprogramming 在系统经由自我劈开的 2A 序列熔化了在里面框架进一个单个开的读物框架(ORF ) 。一个 GFP 标记下游地被放 transgene 启用 transgene 表示追踪。我们证明这个 polycistronic 表示系统高效地产生 iPS 房间。产生 iPS 房间有正常 karyotypes 并且类似于鼠标在形态学和基因表示的胚胎的干细胞。而且，他们能在 vitro 并且在 vivo 试金在两个区分进三胚胎的细菌层的房间类型。显著地，大多数这些 iPS 房间仅仅怀有病毒的向量的一个单个拷贝。这个系统提供一个珍贵工具因为 iPS 房间的产生，和我们的数据建议在每个房间的 transduced reprogramming TF 的表示的平衡为 reprogramming 进程是必要的。更重要地，当由非集成的基因交货系统交付了时，这重新设计的单个 ORF 将没有基因修正便于人的 iPS 房间的有效产生。 展开更多
关键词 开放阅读框 体细胞 IPS 序列 A型 裂解 界定 基因组不稳定性
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EEA1慢病毒表达载体的构建及其对查菲埃立克体感染细胞的影响
6
作者 程琰 毛旭虎 +5 位作者 宋阳 贺政新 陈晶 曾倩 高杰英 王缚鲲 《国际检验医学杂志》 CAS 2019年第15期1793-1797,1801,共6页
目的 利用分子生物学方法构建早期内吞体相关蛋白1(EEA1)慢病毒载体,并感染犬的巨噬细胞DH82,建立稳定表达EEA1的DH82细胞系。方法 将聚合酶链反应(PCR)扩增得到的EEA1和慢病毒载体GV287双酶切后连接,构建慢病毒表达载体GV287-EEA1,经... 目的 利用分子生物学方法构建早期内吞体相关蛋白1(EEA1)慢病毒载体,并感染犬的巨噬细胞DH82,建立稳定表达EEA1的DH82细胞系。方法 将聚合酶链反应(PCR)扩增得到的EEA1和慢病毒载体GV287双酶切后连接,构建慢病毒表达载体GV287-EEA1,经酶切、测序鉴定重组质粒。将重组载体与包装系统pHelper1.0、pHelper2.0质粒共转染293T细胞,包装慢病毒并测定滴度。将构建好的慢病毒表达载体感染DH82细胞,通过实时荧光定量PCR(qPCR)和Westernblot检测DH82细胞中EEA1的过表达情况。进一步利用查菲埃立克体感染稳定表达EEA1的DH82细胞。结果 GV287-EEA1经双酶切分析和测序,证实插入序列正确,成功构建慢病毒表达质粒,并成功包装成慢病毒,病毒滴度为1×10^9TU/mL;病毒液有效感染DH82细胞,依据GFP绿色荧光可检测感染率达80%以上;qPCR和Westernblot的结果证实EEA1在mRNA和蛋白水平都成功过表达。用查菲埃立克体感染稳定表达EEA1的DH82细胞36h后,细胞感染率降低,查菲埃立克体在细胞内的增殖被抑制。结论 成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带EEA1基因的慢病毒载体GV287-EEA1,建立稳定高表达EEA1的犬巨噬细胞系DH82-EEA1,EEA1过表达后,查菲埃立克体的繁殖受到抑制。 展开更多
关键词 查菲埃立克体 早期内吞体相关蛋白1 慢病毒载体
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C4orf7在牙周膜细胞成骨分化中的作用及机制
7
作者 伍云 赵艳 +3 位作者 季耀庭 夏海滨 张壁 王贻宁 《口腔医学研究》 CAS 北大核心 2018年第2期125-129,共5页
目的:探讨C4orf7在牙周膜细胞成骨分化中的作用及机制。方法:首先采用免疫组织化学法(IHC)检测C4orf7在几种牙周组织内的表达情况。人牙周膜细胞(PDLCs)体外培养,利用慢病毒载体技术,构建C4orf7过表达细胞(LV-c4orf7)及空载体对照细胞(L... 目的:探讨C4orf7在牙周膜细胞成骨分化中的作用及机制。方法:首先采用免疫组织化学法(IHC)检测C4orf7在几种牙周组织内的表达情况。人牙周膜细胞(PDLCs)体外培养,利用慢病毒载体技术,构建C4orf7过表达细胞(LV-c4orf7)及空载体对照细胞(LV-con)。对两组细胞矿化诱导4d、7d、18d,检测成骨指标碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原(COL1)、Runt相关转录因子2(RUNX2)及骨钙素(OCN)的表达变化,ALP活性及矿化结节形成情况;最后,利用免疫共沉淀技术检测C4orf7与骨形成蛋白2(BMP2),Ⅰ型胶原(COLⅠ),Ⅲ型胶原(COLⅢ)蛋白间的互作情况。结果:IHC结果显示,C4orf7仅在牙周韧带部位明显表达。成骨诱导后,与对照组相比,过表达组细胞的ALP活性及矿化结节形成明显减弱,成骨指标ALP,COL1,RUNX2,OCN的表达也均受到抑制(P<0.05)。免疫共沉淀表明,C4orf7可与BMP2分子结合,但与COLⅠ和COLⅢ无作用。结论:C4orf7负向调控PDLCs的成骨分化,并可能通过抑制BMP2功能来实现。 展开更多
关键词 牙周膜细胞 C4orf7 慢病毒载体成骨分化
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大鼠叉头蛋白转录因子O1基因的shRNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定
8
作者 刘飞 王庆祝 +2 位作者 秦贵军 杨慧霞 马晓君 《中国糖尿病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期740-745,共6页
目的构建针对大鼠叉头蛋白转录因子O1(FoxO1)基因的shRNA慢病毒载体,并在大鼠系膜细胞(RMCs)上鉴定其沉默效率。方法利用四质粒合成法合成慢病毒载体。分别用阴性对照慢病毒载体(LV-shNC-GFP组)、shRNA慢病毒载体(LV-shRNA-FoxO1组)和... 目的构建针对大鼠叉头蛋白转录因子O1(FoxO1)基因的shRNA慢病毒载体,并在大鼠系膜细胞(RMCs)上鉴定其沉默效率。方法利用四质粒合成法合成慢病毒载体。分别用阴性对照慢病毒载体(LV-shNC-GFP组)、shRNA慢病毒载体(LV-shRNA-FoxO1组)和感染增强剂(NC组)处理RMCs。72h后,采用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(GFP)阳性表达率。采用荧光定量PCR检测FoxO1mRNA表达情况。15d后,采用蛋白免疫印迹法检测FoxO1蛋白的表达情况。结果 LV-shNC-GFP、LV-shRNA-FoxO1组GFP阳性表达率分别为87.4%、95.8%;LV-shRNA-FoxO1组FoxO1的mRNA与蛋白表达量较NC、LV-shNC-GFP组均降低(P<0.05)。其mRNA及蛋白抑制率分别达到86.2%和77.3%,而LV-shNC-GFP、LV-shRNA-FoxO1组FoxO1的mRNA及蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建大鼠FoxO1基因的shRNA慢病毒载体能高效、稳定地抑制FoxO1的表达,为进一步研究FoxO1的功能和作用机制奠定研究基础。 展开更多
关键词 叉头蛋白转录因子O1 短发夹样核糖核酸 慢病毒载体 系膜细胞 大鼠
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慢病毒介导的稳定表达let-7a的睾丸卵黄囊瘤细胞株的建立
9
作者 吴大洲 周欢栋 +4 位作者 沈德雷 郑娜 李仲荣 陈肖鸣 张浩川 《中华小儿外科杂志》 CSCD 北大核心 2018年第11期867-871,共5页
目的构建microRNAlet-7a重组慢病毒表达载体,建立稳定表达let-7a的睾丸卵黄囊瘤细胞株(TYST-1),并探索let-7a过表达后对睾丸卵黄囊瘤(TYST)细胞增殖的影响。方法根据miRBase数据库let-7a的序列,设计合适的引物序列,利用聚合酶链反应(PCR... 目的构建microRNAlet-7a重组慢病毒表达载体,建立稳定表达let-7a的睾丸卵黄囊瘤细胞株(TYST-1),并探索let-7a过表达后对睾丸卵黄囊瘤(TYST)细胞增殖的影响。方法根据miRBase数据库let-7a的序列,设计合适的引物序列,利用聚合酶链反应(PCR)钓取目的基因片段,经过扩增、酶切后,与慢病毒载体GV309连接。转化DH5α感受态细胞,阳性克隆进行PCR及测序鉴定。293T细胞中包装慢病毒,利用荧光法测定病毒滴度。将构建好的let-7a慢病毒载体感染睾丸卵黄囊瘤(TYST)细胞,经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到稳定克隆株,建立稳定表达let-7a的TYST-1。用Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)检测let-7a表达水平,用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测let-7a过表达后对TYST细胞增殖的影响。结果构建的let-7a慢病毒载体经质粒酶切和测序鉴定正确;let-7a慢病毒感染组细胞内let-7a水平比阴性病毒对照组和空白对照组分别提高3.O倍和3.8倍(P<O.05)。CCK-8法细胞增殖试验结果显示,较空白组和阴性病毒组,let-7a慢病毒感染组细胞的增殖能力明显受到抑制(P<O.05)。结论成功构建let-7a慢病毒载体并感染TYST细胞,获得稳定过表达let-7a的TYST-1;并证实let-7a过表达后抑制了TYST细胞的增殖。 展开更多
关键词 微RNAS 内胚层窦瘤 慢病毒载体 细胞增殖
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