产气荚膜梭菌α-毒素基因数字PCR方法的建立及其在标准物质研制方面的应用

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作者 张铭洋 张喜悦 +7 位作者 赵格 曲志娜 高宏伟 孙敏 程慧敏 徐佳微 王君玮 邹明 《山东农业科学》 北大核心 2024年第1期156-163,共8页

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人兽共患病原菌,α-毒素是其分子生物学检测的主要靶标。试验选取Clper引物及探针建立微滴式数字PCR(droplet digtial PCR,ddPCR)方法,最佳引物浓度0.85μmol/L,探针浓度为0.3μmol/L... 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人兽共患病原菌,α-毒素是其分子生物学检测的主要靶标。试验选取Clper引物及探针建立微滴式数字PCR(droplet digtial PCR,ddPCR)方法,最佳引物浓度0.85μmol/L,探针浓度为0.3μmol/L,退火温度为60℃。利用建立的ddPCR方法检测单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、肠球菌、金黄色葡萄球菌、弯曲杆菌的DNA,结果均为阴性,表明该方法具有较好的特异性。合成产气荚膜梭菌α-毒素基因,制成DNA标准品,选取3个稀释梯度的标准品进行重复试验,组内和组间变异系数均小于5%,证明该方法具有较好的重复性。采用7个稀释梯度的标准品进行重复检测,计算出该方法的检测限为12.39 copies/μL,定量限为33.97 copies/μL。通过对68份临床样品进行检测,证实该方法可用于临床,且用于检测质粒DNA时无明显的基质效应。应用ddPCR方法对标准品进行均匀性和稳定性检验,并联合9家实验室进行定值,最终获得了国家市场监督管理总局颁发的标准物质证书(GBW(E)091237)。α-毒素基因ddPCR方法的建立和DNA标准物的研制,为产气荚膜梭菌分子生物学检测试剂的标准化奠定了基础。 展开更多

关键词 产气荚膜梭菌 ddPCR α-毒素基因 标准物质 特异性 灵敏度 可重复性 定值

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魏氏梭菌α-毒素基因探针的制备及应用 被引量：1

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作者 王开功 周碧君 +3 位作者 王琛 方英 李海阔 文明 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期198-201,共4页

以A型魏氏梭菌贵州分离株为材料,提取染色体DNA,经PCR扩增和酚:氯仿抽提回收得到242bp的α 毒素基因部分片段,用地高辛标记制备了α 毒素基因探针。该探针不与埃希氏大肠杆菌、都柏林沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪丹毒杆菌、蜡样芽胞杆... 以A型魏氏梭菌贵州分离株为材料,提取染色体DNA,经PCR扩增和酚:氯仿抽提回收得到242bp的α 毒素基因部分片段,用地高辛标记制备了α 毒素基因探针。该探针不与埃希氏大肠杆菌、都柏林沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪丹毒杆菌、蜡样芽胞杆菌及多杀性巴氏杆菌等细菌的DNA样品发生反应,只与魏氏梭菌DNA样品呈阳性反应,能检出300pg的DNA样品;应用探针对40株魏氏梭菌进行了Dot Blotting检测,结果与生化试验鉴定的符合率达到90%,表明该探针具有较高的特异性和灵敏度,可应用于临床上魏氏梭菌的检测。 展开更多

关键词 魏氏梭菌 α-毒素基因探针 制备技术 染色体DNA PCR扩增

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抗A型产气荚膜梭菌α毒素mAb V_H和V_L基因的克隆与序列测定 被引量：6

3

作者 许崇波 赵宝华 +1 位作者 马从林 朱平 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 1999年第4期296-299,共4页

用提取的Ａ 型产气荚膜梭菌α毒素包涵体为免疫原， 制备了１ 株ｍＡｂ ２Ｅ３ 。其Ｉｇ 亚类为ＩｇＧ３， 细胞培养上清和腹水的ｍＡｂ 效价分别为１∶１０２４ 和１∶１０８ 。该ｍＡｂ ２Ｅ３ 可中和α毒素的磷脂酶Ｃ 活性和溶血活性... 用提取的Ａ 型产气荚膜梭菌α毒素包涵体为免疫原， 制备了１ 株ｍＡｂ ２Ｅ３ 。其Ｉｇ 亚类为ＩｇＧ３， 细胞培养上清和腹水的ｍＡｂ 效价分别为１∶１０２４ 和１∶１０８ 。该ｍＡｂ ２Ｅ３ 可中和α毒素的磷脂酶Ｃ 活性和溶血活性， 对α毒素致死性腹腔攻击的小鼠具有良好的被动保护作用。另外， 应用ＲＴＰＣＲ 技术， 从杂交瘤细胞株２Ｅ３ 中， 扩增出ｍＡｂ ＶＨ 和ＶＬ基因， 分别克隆至载体ｐＧＥＭＴ中。序列分析证实， ＶＨ 基因为３５７ ｂｐ， 编码１１９ 个氨基酸；ＶＬ 基因为３２４ ｂｐ， 编码１０８ 个氨基酸。计算机分析表明，ＶＨ 和ＶＬ基因均为新发现的基因序列， 符合功能性重排的鼠抗体可变区基因的特征。ＶＨ 和ＶＬ 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（ Ｂ） 和轻链κⅢ家族。 展开更多

关键词 Α毒素 单克隆抗体 基因克隆 序列分析

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A型产气荚膜梭菌中国标准株α毒素基因的克隆与序列分析 被引量：3

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作者 陈小云 张存帅 关孚时 《中国兽药杂志》 2004年第12期5-8,共4页

应用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,从A型产气荚膜梭菌中国标准株C5 7 1中 ,扩增出大小约 1.2kb的A型产气荚膜梭菌α毒素全基因 (cpa12 5 4基因 ) ,并将其克隆入pMD18 T载体中。转化至受体菌DH5α后 ,经Amp/IPTG/X Gal选择培养 ,提取质粒 ,... 应用聚合酶链式反应 (PCR)技术 ,从A型产气荚膜梭菌中国标准株C5 7 1中 ,扩增出大小约 1.2kb的A型产气荚膜梭菌α毒素全基因 (cpa12 5 4基因 ) ,并将其克隆入pMD18 T载体中。转化至受体菌DH5α后 ,经Amp/IPTG/X Gal选择培养 ,提取质粒 ,PCR和EcoRⅠ /PstⅠ双酶切鉴定 ,筛选阳性重组克隆。核苷酸序列分析证实 ,cpa12 5 4基因阅读开放框架由 1194bp组成 ,编码398个氨基酸残基。经GenBank数据库的BLAST检索比对分析 ,cpa12 5 4基因序列与国外文献报道者同源性达 99% ,表明本实验所克隆的cpa12 5 展开更多

关键词 基因 克隆 Α毒素 DH5Α 阳性 聚合酶链式反应 扩增 A型产气荚膜梭菌 序列分析 酶切

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产气荚膜梭菌α-β融合基因的构建与表达研究 被引量：1

5

作者 马同锁 李翠莲 +2 位作者 赵士豪 张红兵 赵宝华 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2006年第19期4854-4856,共3页

应用PCR技术,首先从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增出α-毒素保护性抗原基因片段,然后从C型产气荚膜梭菌C58-1染色体基因组中扩增了930 bp的β-毒素基因,并将α-毒素基因和β-毒素基因插入融合表达载体pBV221中,获得了重组质粒pMCP... 应用PCR技术,首先从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增出α-毒素保护性抗原基因片段,然后从C型产气荚膜梭菌C58-1染色体基因组中扩增了930 bp的β-毒素基因,并将α-毒素基因和β-毒素基因插入融合表达载体pBV221中,获得了重组质粒pMCPAB,转化受体菌BL21(DE3),得到重组菌株BL21(DE3)(pMCPAB)。对重组菌株诱导的表达产物进行ELISA检测和SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达α-β融合蛋白。免疫实验表明,表达产物免疫的小鼠可抵抗α-毒素和β-毒素的攻击。 展开更多

关键词 产气荚膜梭菌 α-毒素 β-毒素 融合基因 基因表达

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携带非典型cpb2基因牛源A型产气荚膜梭菌重组α毒素的免疫保护性研究 被引量：4

6

作者 德艳艳 姜志刚 +2 位作者 牛思博 孙刚 于力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期563-567,共5页

为验证重组α毒素对携带非典型cpb2基因的A型产气荚膜梭菌的免疫保护性,本研究应用PCR技术,从某牛场牛源A型产气荚膜梭菌G1分离株中扩增出1 194 bp的α毒素编码基因(cpa)和795 bp的β2毒素编码基因(cpb2)。经BLAST分析显示,G1分离株携带... 为验证重组α毒素对携带非典型cpb2基因的A型产气荚膜梭菌的免疫保护性,本研究应用PCR技术,从某牛场牛源A型产气荚膜梭菌G1分离株中扩增出1 194 bp的α毒素编码基因(cpa)和795 bp的β2毒素编码基因(cpb2)。经BLAST分析显示,G1分离株携带的cpb2基因与14个菌株的非典型cpb2基因的氨基酸序列同源性为95.1%～98.9%,与典型cpb2基因(L77695)的氨基酸序列同源性为61.7%。这表明,G1的cpb2基因为非典型cpb2基因。同时分别将cpa和cpb2基因扩增产物克隆于原核表达载体中,构建重组表达质粒pET-a和pET-b2,重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白,将其纯化后单独及联合免疫小鼠进行免疫保护试验。结果显示,单独免疫重组α毒素蛋白组以及联合免疫重组β2毒素蛋白组的小鼠,均可以抵抗至少6倍最小致死量(MLD)的G1外毒素(包含α毒素和非典型β2毒素)的攻击,也可以完全抵抗至少6 MLD的G2外毒素(不包含β2毒素)的攻击。表明,重组α毒素蛋白对含有及不含有非典型β2毒素的A型产气荚膜梭菌均具有良好的免疫保护作用。 展开更多

关键词 非典型cpb2基因 A型产气荚膜梭菌 重组α毒素 重组非典型β2毒素

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魏氏梭菌贵州分离株α-毒素基因的克隆与表达

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作者 王开功 周碧君 +1 位作者 李海阔 文明 《山地农业生物学报》 2003年第6期499-504,共6页

提取已鉴定的A型魏氏梭菌Clostridiumwelchii贵州分离株的染色体DNA,经酶切回收分子长2～4kb的DNA片段混合物,将其插入质粒载体pUC19中,并转化至E.coliJM109,通过Amp抗药性和显色反应的选择,再提取阳性重组细菌质粒进行探针检测、酶切... 提取已鉴定的A型魏氏梭菌Clostridiumwelchii贵州分离株的染色体DNA,经酶切回收分子长2～4kb的DNA片段混合物,将其插入质粒载体pUC19中,并转化至E.coliJM109,通过Amp抗药性和显色反应的选择,再提取阳性重组细菌质粒进行探针检测、酶切分析和PCR鉴定,筛选出含魏氏梭菌α-毒素基因的重组大肠杆菌;经溶血与溶血抑制试验及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实,重组E.coli的表达产物符合α-毒素的生物学特性。 展开更多

关键词 克隆 基因表达 重组 魏氏梭菌 α-毒素基因 肠毒血症 坏死性肠炎

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植物外源抗虫基因及其应用 被引量：5

8

作者 程茂高 乔卿梅 原国辉 《生物技术通报》 CAS CSCD 2004年第5期18-20,共3页

目前植物外源抗虫基因在植物基因工程中得到了广泛的应用。本文概述了植物外源抗虫基因的种类、作用机理及其应用概况 ,并对今后外源抗虫基因的主要研究方向作了探讨。

关键词 外源 抗虫基因 植物基因工程 作用机理 种类 应用概况 研究方向

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A型产气荚膜梭菌α毒素全基因的分子克隆与核苷酸序列分析 被引量：2

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作者 林明辉 荫俊 +3 位作者 王慧 宋伟 邢洪光 侯晓军 《生物技术通讯》 CAS 2003年第3期180-181,共2页

应用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增出A型产气荚膜梭菌α毒素全基因(cpa1229基因)并将其克隆至pMD18-T载体中。经转化、IPTG/X-gal选择培养,提取质粒,PCR和EcoRI/PstI双酶切鉴定,筛选阳性重组克隆。经核苷酸序列分析证实... 应用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增出A型产气荚膜梭菌α毒素全基因(cpa1229基因)并将其克隆至pMD18-T载体中。经转化、IPTG/X-gal选择培养,提取质粒,PCR和EcoRI/PstI双酶切鉴定,筛选阳性重组克隆。经核苷酸序列分析证实,cpa1229基因阅读开放框架由1194bp组成。经GenBank检索对照分析,cpa1229基因序列与国外文献报道者同源性达98.3%,表明本实验所克隆的cpa1229基因即为A型产气荚膜梭菌α毒素基因。 展开更多

关键词 A型产气荚膜梭菌 Α毒素 基因 分子克隆 核苷酸序列

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产气荚膜梭菌贵州分离株α-毒素基因的克隆与鉴定

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作者 虞天德 王开功 +2 位作者 王松林 孟燕 方国升 《中国兽医科技》 CSCD 北大核心 2004年第4期14-17,共4页

提取了A型产气荚膜梭菌贵州分离株的染色体DNA,经聚合酶链反应(PCR)扩增并回收获得了1条242bp的特异性片段,将该基因片段克隆到质粒载体pUC19中,并转化至大肠埃希氏菌JM109中;经氨苄青霉素(Amp)抗药性和显色反应筛选及重组质粒酶切分析... 提取了A型产气荚膜梭菌贵州分离株的染色体DNA,经聚合酶链反应(PCR)扩增并回收获得了1条242bp的特异性片段,将该基因片段克隆到质粒载体pUC19中,并转化至大肠埃希氏菌JM109中;经氨苄青霉素(Amp)抗药性和显色反应筛选及重组质粒酶切分析、PCR鉴定和Southern blotting检测,表明该重组质粒是产气荚膜梭菌α 毒素基因的克隆。 展开更多

关键词 产气荚膜梭菌 贵州 α-毒素基因 克隆 鉴定 PCR 抗药性 显色反应

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牛产气荚膜梭菌α-ε毒素基因的融合表达及其纯化 被引量：3

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作者 尹辉 赵达 +8 位作者 陈为宏 高佳滨 乔波 陈楠楠 胡旭 梁鸿儒 姜东君 王鹤 朱战波 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2015年第3期261-265,共5页

目的融合表达产气荚膜梭菌α毒素基因和ε毒素基因的融合基因α-ε,并进行纯化。方法利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌C57-8株基因组DNA中扩增出α毒素基因的部分基因片段,插入到质粒p ET28a-ε上,构建含α-ε融合毒素基因的表达质粒p ET2... 目的融合表达产气荚膜梭菌α毒素基因和ε毒素基因的融合基因α-ε,并进行纯化。方法利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌C57-8株基因组DNA中扩增出α毒素基因的部分基因片段,插入到质粒p ET28a-ε上,构建含α-ε融合毒素基因的表达质粒p ET28a-α-ε,转化至E.coli BL21(DE3)plys S感受态细胞中,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组质粒p ET28a-α-ε经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,与预期的基因序列重合率为99%。表达的重组蛋白相对分子质量约78 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的22.7%,纯度为91.2%,可与小鼠产气荚膜梭菌多抗血清特异性结合,具有良好的反应原性。结论成功构建了重组质粒p ET28a-α-ε,并在E.coli BL21(DE3)plys S中表达了重组α-ε融合蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防牛肠毒血症基因工程亚单位疫苗的候选抗原。 展开更多

关键词 产气荚膜梭菌 Α毒素基因 ε毒素基因 融合表达 纯化

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A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65的原核表达及其纯化

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作者 王冬冬 张国利 +8 位作者 岳玉环 吴广谋 田园 吉元刚 徐艳玲 张培培 侯天全 赵鑫 付玉和 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2016年第12期1267-1270,共4页

目的原核表达A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,并进行纯化。方法以CPA全基因为模板,PCR扩增rCPA基因,插入表达质粒p ET-28a(+)-HSP65,构建重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12%... 目的原核表达A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,并进行纯化。方法以CPA全基因为模板,PCR扩增rCPA基因,插入表达质粒p ET-28a(+)-HSP65,构建重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12%SDS-PAGE分析;优化表达工艺进行高密度发酵,发酵产物经DEAE阴离子柱上复性后,再经金属螯合层析纯化。结果重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约90 000,主要以可溶性形式为主,表达量占菌体总蛋白的30.17%。利用TB培养基,IPTG 34℃诱导5 h的表达产物经纯化后,纯度约达95%,蛋白收率为4.5 mg/g湿菌。结论已成功表达并纯化了A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,为后期疫苗生物学活性的研究奠定了基础。 展开更多

关键词 A型产气荚膜梭菌α毒素 rCPA-HSP65 原核细胞 基因表达 高密度发酵 蛋白纯化

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A型魏氏梭菌α毒素氨基端plc基因的生物学活性探究 被引量：1

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作者 许崇利 许崇波 宫语晨 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期4184-4187,共4页

为了探究α毒素氨基端及其生物学功能的关系,本研究利用PCR技术克隆了魏氏梭菌α毒素氨基端基因PLC1-250,构建了含PLC1-250基因重组质粒的BL21(DE3)(p N-PLC1-250)重组表达菌株。根据序列分析和酶切鉴定的结果,证实了重组质粒p N-PLC1-... 为了探究α毒素氨基端及其生物学功能的关系,本研究利用PCR技术克隆了魏氏梭菌α毒素氨基端基因PLC1-250,构建了含PLC1-250基因重组质粒的BL21(DE3)(p N-PLC1-250)重组表达菌株。根据序列分析和酶切鉴定的结果,证实了重组质粒p N-PLC1-250含有PLC1-250基因,且其开放阅读框架和基因序列均正确。经过SDS-PAGE分析,结果表明PLC1-250蛋白表达量约占菌体总蛋白相对含量的18.76%。对其生物学活性的研究表明,PLC1-250蛋白与α毒素一样具有磷脂酶C活性。研究为进一步揭示α毒素的分子作用机制提供了有力的支持。 展开更多

关键词 A型魏氏梭菌 α毒素plc基因 生物学活性

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鹅膏环肽毒素生源合成的研究进展 被引量：2

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作者 罗宏 《菌物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1651-1660,共10页

在蘑菇目Agaricales中,已知鹅膏属Amanita、环柄菇属Lepiota和盔孢伞属Galerina 3个属的部分物种能产生剧毒的鹅膏环肽毒素。全球90%以上的致死性蘑菇中毒事件是由含鹅膏环肽蘑菇导致。上述3个属的剧毒蘑菇虽然亲缘关系较远,但却可以合... 在蘑菇目Agaricales中,已知鹅膏属Amanita、环柄菇属Lepiota和盔孢伞属Galerina 3个属的部分物种能产生剧毒的鹅膏环肽毒素。全球90%以上的致死性蘑菇中毒事件是由含鹅膏环肽蘑菇导致。上述3个属的剧毒蘑菇虽然亲缘关系较远,但却可以合成同一种鹅膏环肽毒素,且使用了大致相同的生源合成代谢途径,涉及多个毒素合成基因,采用了特殊的组合式合成机制。本文总结了鹅膏环肽毒素合成途径研究的最新进展,指出了当前工作中遇到的一些难题,对未来研究的趋势进行了展望。 展开更多

关键词 剧毒蘑菇 含鹅膏毒肽蘑菇 α-鹅膏毒肽 毒素合成机制 基因功能

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