目的将GPR109A基因插入pEGFP-N3载体中构建重组质粒pEGFP-GPR109A,并建立稳定表达烟酸受体GPR109A的中国仓鼠卵巢(Ch inese ham ster ovary,CHO)细胞株。方法构建重组质粒pEGFP-GPR109A,重组质粒转化大肠杆菌DH5 a,重组质粒经PCR、酶切...目的将GPR109A基因插入pEGFP-N3载体中构建重组质粒pEGFP-GPR109A,并建立稳定表达烟酸受体GPR109A的中国仓鼠卵巢(Ch inese ham ster ovary,CHO)细胞株。方法构建重组质粒pEGFP-GPR109A,重组质粒转化大肠杆菌DH5 a,重组质粒经PCR、酶切、测序验证正确后,应用脂质体转染技术将该质粒导入CHO细胞,用抗生素G418筛选稳定表达的细胞。倒置荧光显微镜观察克隆细胞株荧光信号,RT-PCR检测GPR109A基因mRNA表达,W estern B lotting检测绿色荧光蛋白与烟酸受体GPR109A的融合蛋白(GFP-GPR109A)的表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位。结果 pEGFP-GPR109A真核表达质粒构建正确,融合蛋白GFP-GPR109A在CHO细胞中稳定表达,表达的融合蛋白主要定位于细胞膜。结论成功构建pEGFP-GPR109A真核表达载体并建立其稳定表达的CHO细胞株;该细胞株的建立有助于GPR109A的更多生理病理功能研究,也为下一步抗动脉粥样硬化的药物筛选奠定了基础。展开更多
文摘目的将GPR109A基因插入pEGFP-N3载体中构建重组质粒pEGFP-GPR109A,并建立稳定表达烟酸受体GPR109A的中国仓鼠卵巢(Ch inese ham ster ovary,CHO)细胞株。方法构建重组质粒pEGFP-GPR109A,重组质粒转化大肠杆菌DH5 a,重组质粒经PCR、酶切、测序验证正确后,应用脂质体转染技术将该质粒导入CHO细胞,用抗生素G418筛选稳定表达的细胞。倒置荧光显微镜观察克隆细胞株荧光信号,RT-PCR检测GPR109A基因mRNA表达,W estern B lotting检测绿色荧光蛋白与烟酸受体GPR109A的融合蛋白(GFP-GPR109A)的表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位。结果 pEGFP-GPR109A真核表达质粒构建正确,融合蛋白GFP-GPR109A在CHO细胞中稳定表达,表达的融合蛋白主要定位于细胞膜。结论成功构建pEGFP-GPR109A真核表达载体并建立其稳定表达的CHO细胞株;该细胞株的建立有助于GPR109A的更多生理病理功能研究,也为下一步抗动脉粥样硬化的药物筛选奠定了基础。
