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检测PRRSV及鉴别HP-PRRSV毒株的二重PCR与二重TaqMan荧光定量PCR方法
1
作者 陈旭 汤德元 +6 位作者 曾智勇 王彬 袁盛林 廖正波 何松 周飘 毛茵茗 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期316-324,共9页
为了实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)早期检测及快速鉴别高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)变异株,利用HP-PRRSV Nsp2蛋白第481位和532~560位氨基酸缺失的特性设计2对引物,优化反应条件建立二重PCR检测方法,同时针对PRRSV M... 为了实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)早期检测及快速鉴别高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)变异株,利用HP-PRRSV Nsp2蛋白第481位和532~560位氨基酸缺失的特性设计2对引物,优化反应条件建立二重PCR检测方法,同时针对PRRSV M基因和HP-PRRSV Nsp2基因设计特异性引物和探针,优化反应条件建立二重TaqMan荧光定量PCR方法,并评估这2种方法的敏感性、特异性、重复性。敏感性试验结果显示:二重PCR方法的检测下限分别为0.058 ng/μL(PRRSV)和4.7 ng/μL(HP-PRRSV);二重TaqMan荧光PCR方法的检测下限分别为10 copies/μL(PRRSV)和100 copies/μL(HP-PRRSV)。这2种方法与其他猪病病原均不发生非特异性反应,重复性试验结果良好。经131份临床样品检测,可得到PRRSV的阳性率约12.2%(16/131)、HP-PRRSV的阳性率约17.6%(23/131)、二者的混合感染率约8.4%(11/131)。证实,本研究成功建立了二重PCR和二重TaqMan荧光定量PCR检测方法,可为临床上猪繁殖与呼吸综合征的防控提供技术支持。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 二重pcr 二重taqman荧光定量pcr 鉴别检测
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牛支原体和丝状支原体丝状亚种双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：3
2
作者 马芷忻 武琪 +2 位作者 刘桐 辛九庆 徐青元 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期262-268,共7页
牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病均为重要的牛传染病,两者均可致牛出现呼吸系统症状,临床上难以区分。为建立鉴别诊断牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病的双重Taq Man荧光定量PCR检测方法,本研究根据这两种病的病原丝状支原体丝状亚种和牛支... 牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病均为重要的牛传染病,两者均可致牛出现呼吸系统症状,临床上难以区分。为建立鉴别诊断牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病的双重Taq Man荧光定量PCR检测方法,本研究根据这两种病的病原丝状支原体丝状亚种和牛支原体的基因组保守区域(丝状支原体丝状亚种nt826-nt1742,牛支原体nt189-nt618)分别设计引物与探针,通过优化反应体系与反应条件,建立同时检测这两种病原的Taq Man荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法仅对丝状支原体丝状亚种模拟样品和牛支原体检测结果为阳性,而巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、关节炎支原体Leachii株检测结果均为阴性,特异性较强。分别以1.0×10~7拷贝/μL~1.0×10~1拷贝/μL的p EASY-Mmm和p EASY-Mb质粒标准品为模板,进行敏感性试验,结果显示,该方法对丝状支原体丝状亚种和牛支原体重组质粒标准品的检测限均为1.0×10~1拷贝/μL,敏感性较高。对不同浓度质粒标准品混合物的重复性试验结果显示,组内与组间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法对112份临床样品(104份鼻拭子、8份肺组织样品)检测,结果显示,丝状支原体丝状亚种检测结果和已发表PCR方法检测结果一致,均为阴性,而本实验建立的方法检测出4份牛支原体阳性样品,且经测序证实检出样品为真实阳性样品,而已发表的多重PCR方法检测该病原结果均为阴性。本研究建立了能够同时检测丝状支原体丝状亚种和牛支原体的双重Taq Man荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性好,可用于各种临床样品的检测,为这两种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。 展开更多
关键词 牛传染性胸膜肺炎 牛支原体 taqman荧光定量pcr
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羊口疮、小反刍兽疫、羊痘病毒三重TaqMan荧光定量PCR方法的建立及应用
3
作者 朱成 田芯源 +4 位作者 陈易 余燕岐 王宪军 朱江江 向华 《四川畜牧兽医》 2024年第10期33-37,40,共6页
为建立一种羊口疮病毒(ORFV)、山羊痘病毒(GTPV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)三种病原的联合共检方法,以ORFV、GTPV和PPRV基因序列为模板,克隆得ORFV-B2L、GTPV-p32、PPRV-N基因序列,并构建三种病原核酸标准品,设计三对探针,建立ORFV、GTPV和... 为建立一种羊口疮病毒(ORFV)、山羊痘病毒(GTPV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)三种病原的联合共检方法,以ORFV、GTPV和PPRV基因序列为模板,克隆得ORFV-B2L、GTPV-p32、PPRV-N基因序列,并构建三种病原核酸标准品,设计三对探针,建立ORFV、GTPV和PPRV三重TaqMan荧光定量PCR方法,然后对方法的检测条件进行优化及质量评价,并作临床初步验证。结果显示:所建立的ORFV、GTPV和PPRV三重TaqMan荧光定量PCR方法的特异性好,ORFV、PPRV和GTPV最低检测限值分别为2.98×101、3.81×101、6.68×10^(1)copies/μL;稳定性好,与商品化检测试剂盒和OIE标准相比具有较高的检测符合率;对279份临床样本作检测,ORFV、PPRV和GTPV的阳性检出率分别为34%、4.3%、2.5%,ORFV和GTPV的混合感染率为2.5%。 展开更多
关键词 羊口疮病毒(ORFV) 小反刍兽疫病毒(PPRV) 羊痘病毒(GTPV) 多重taqman荧光定量pcr
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牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用
4
作者 蒲鹏 李晨露 +2 位作者 张琪 吴发兴 许信刚 《动物医学进展》 北大核心 2024年第2期7-10,共4页
为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan... 为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。 展开更多
关键词 牛冠状病毒 taqman荧光定量pcr 检测方法
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槟榔黄化植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：1
5
作者 林兆威 孟秀利 +2 位作者 唐庆华 牛晓庆 宋薇薇 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第6期1120-1126,共7页
槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并... 槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并合成特异性引物AMf/AMr和探针AM-Prode,使用该方法进行准确性、敏感性、特异性及重复性测试,并在其他植物的植原体病害进行检测。结果显示:本检测方法能够准确的检测出阳性样品,健康样品无扩增曲线;在敏感性测试中,该检测方法能检测到1.16×10^(1) copies/μL样本浓度水平,其标准曲线方程为y=-3.4185x+43.624,扩增效率为96.12%,相关系数R^(2)=0.9833;在特异性测试中,该检测方法对YLD的检测具有较好的特异性,槟榔、槟榔其他病害病原及其内生菌的基因组对本方法未造成干扰;在重复性测试中,该检测方法对槟榔黄化病的检测具有较好的重复性;并且该检测方法可对苦楝黄化病、细圆藤丛枝病及辣椒黄化病等8种植原体病害进行检测,对植原体的检测具有一定的通用性。本检测方法的建立,有利于为槟榔黄化病的精准诊断、病原监测及媒介昆虫的检测等研究提供可靠的技术手段。 展开更多
关键词 槟榔 槟榔黄化病 植原体 taqman实时荧光定量pcr 病害检测
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猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
6
作者 周颖 赵硕 +10 位作者 覃国喜 梁龙华 肖婷 陈忠伟 卢冰霞 秦毅斌 林昌华 张胜斌 段群棚 胡庭俊 何颖 《动物医学进展》 北大核心 2024年第2期11-16,共6页
为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感... 为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10^(3)~10^(4)倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 猪鼻支原体 taqman荧光定量pcr
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猪细小病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用
7
作者 杨奕 吴发兴 +4 位作者 康京丽 孙洪涛 王志亮 许信刚 张琪 《动物医学进展》 北大核心 2024年第2期75-79,共5页
旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的P... 旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的PPV VP2基因标准品;特异性试验结果显示,该方法检测猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均低于2%,重复性良好。用该方法检测102份临床样本,检出阳性样本16份,阳性检出率为15.69%,将检测出的阳性样本进行PCR扩增并测序,证实检测样品中确实存在PPV。该方法敏感性高、特异性强,适用于PPV的定量检测及猪细小病毒病的流行病学调查。 展开更多
关键词 猪细小病毒 VP2 taqman探针 荧光定量pcr
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PRRSV、CSFV、PRV和PCV2四重实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：1
8
作者 李欣 杨莉 +4 位作者 刘光亮 王文秀 刘海隆 曹宗喜 张艳 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期7-14,共8页
为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的四重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,针对PRRSV的ORF2基因、CSFV的5′UTR基因、PRV的gB基因、PCV2的ORF2基因设计了引物及Taq Ma... 为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的四重荧光定量PCR(qPCR)检测方法,针对PRRSV的ORF2基因、CSFV的5′UTR基因、PRV的gB基因、PCV2的ORF2基因设计了引物及Taq Man探针,并进行反应体系优化,敏感性、特异性验证,建立了同时检测上述4种病原的四重实时荧光定量PCR。结果显示,所建立的四重荧光PCR扩增效率(E)、相关系数(R^(2))及曲线斜率均在正常范围内,检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2 E值、R^(2)、斜率分别为92.9%、0.998、-3.504,90.7%、0.998、-3.566,94.3%、0.996、-3.466,94.2%、0.997及-3.470。PRRSV、CSFV、PRV、PCV2重组质粒最低检出限分别达到10^(2)、10^(2)、10^(2)、10^(3) copies/μL;四重qPCR反应体系中的多条引物间不发生交叉反应,经评价该方法特异性良好;批内和批间重复性试验结果显示,变异系数(CV)均在1%以下,具有良好的重复性。分别使用该方法和相应的国标荧光定量检测法对采集的298份临床样品进行检测对比,两种方法检测PRRSV、CSFV、PRV、PCV2阳性符合率分别为96.08%、96.38%、100%、94.95%,均在94%以上。结果表明,建立的检测方法方便、灵敏、高效、特异性强,适用于猪呼吸道疾病病原学、流行病学研究以及临床病例的诊断,并为猪呼吸道疾病的预防和控制提供技术支撑。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 猪瘟病毒 猪伪狂犬病病毒 猪圆环病毒2型 四重实时荧光定量pcr
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塔城病毒Ⅰ型TaqMan探针法荧光定量PCR检测方法的建立
9
作者 徐昭艳 姜峰 +3 位作者 陈瑶 金鑫 陈泽良 韩小虎 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第5期83-92,共10页
建立快速特异的蜱传塔城病毒Ⅰ型(TcTV-Ⅰ)荧光定量PCR检测方法,用于TcTV-Ⅰ的初步筛查。选用TcTV-Ⅰ糖蛋白G基因设计特异性引物以及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,与TcTV-... 建立快速特异的蜱传塔城病毒Ⅰ型(TcTV-Ⅰ)荧光定量PCR检测方法,用于TcTV-Ⅰ的初步筛查。选用TcTV-Ⅰ糖蛋白G基因设计特异性引物以及TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,与TcTV-Ⅱ、新布尼来病毒(Severe fever with thrombocytopenia virus,SFTSV)、森林脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV)、大别山病毒(Dabieshan orthohanta virus,DBSV)、阿龙山病毒(Alongshan virus,ALSV)等常见蜱传病毒均无交叉反应;标准曲线的循环阈值(Ct值)与模板拷贝数之间呈良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.9999;具有良好的敏感性,最低检测限为1.10×10^(1)copies/μL,灵敏度是常规PCR的10^(3)倍;具有较好的稳定性,组内和组间的变异系数均低于2%。采用本方法对辽宁、内蒙古及新疆地区的425份蜱样本就行检测,只有新疆地区的19份蜱样本呈阳性。结果表明本研究建立的实时荧光定量PCR方法具有较高的特异性、敏感性和稳定性,可用于TcTV-Ⅰ的快速检测、流行病学调查和疫情监测等。 展开更多
关键词 蜱 实时荧光定量pcr 塔城病毒 taqman探针
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鸭坦布苏病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立
10
作者 陈平平 嵇辛勤 +5 位作者 阮涌 王晗晗 罗晓宇 安而立 龙丹丹 段志强 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第10期75-80,共6页
为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性... 为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性、敏感性和重复性,并使用该方法对临床样本进行检测。结果显示,所建立的标准曲线相关系数为0.999 5,有良好的线性关系;该方法可特异检测DTMUV;对标准质粒的最低检测限为2.72×10^(2) copies/μL,是普通PCR的100倍;CT值组内变异系数为0.97%~1.32%,组间变异系数为1.24%~1.79%;人工感染DTMUV的20份鸭胚成纤维细胞样本以及12份人工攻毒2 d的雏鸭脾脏组织样本和12份泄殖腔棉拭子样本阳性率为100%(44/44);疑似感染的12份活鸭泄殖腔棉拭子阳性率为25.00%(3/12),14份病死鸭脾脏组织样本阳性率为28.57%(4/14)。结果表明,本试验建立的TaqMan探针qPCR方法有良好的敏感性、准确性和重复性,能特异检测DTMUV,适用于临床快速检测,为DTMUV的分子流行病学调查和临床疾病诊断提供了技术支撑。 展开更多
关键词 鸭坦布苏病毒(DTMUV) taqman探针 实时荧光定量pcr(qpcr)
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尼帕病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法建立
11
作者 孙彤 孙竹筠 +3 位作者 刘静宜 王培培 苏苌 陈鸿军 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第1期122-128,共7页
尼帕病毒病是一种人畜共患烈性传染病,为能够快速特异检测该病毒,本研究根据尼帕病毒(NiV)N基因序列保守区设计特异性引物和探针,建立一种针对NiV的TaqMan探针荧光定量PCR(qPCR)检测方法,该方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可鉴别NiV... 尼帕病毒病是一种人畜共患烈性传染病,为能够快速特异检测该病毒,本研究根据尼帕病毒(NiV)N基因序列保守区设计特异性引物和探针,建立一种针对NiV的TaqMan探针荧光定量PCR(qPCR)检测方法,该方法特异性好、敏感性高、稳定性强,可鉴别NiV与其他猪病病毒,扩增效率为102%,最低检测限14.8 copies/μL,敏感性高于常规PCR 10倍,该检测方法的建立可为NiV的快速检测提供技术手段,对促进猪类养殖业的健康发展具有重要意义。 展开更多
关键词 尼帕病毒 N基因 taqman探针 实时荧光定量pcr
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诺如病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的设计与优化 被引量：1
12
作者 陈波 李家奇 +1 位作者 付立申 吴文明 《五邑大学学报（自然科学版）》 CAS 2024年第3期1-6,共6页
为设计一种快速、高灵敏度检测诺如病毒(Norovirus,NV)的方法.本文通过检索参考NCBI数据库中收录的国内典型流行的NV毒株BJSMQ的基因序列NC_039476.1,合成了NV的标准重组质粒,根据NV的ORF1基因保守序列设计一组特异性引物和荧光探针;通... 为设计一种快速、高灵敏度检测诺如病毒(Norovirus,NV)的方法.本文通过检索参考NCBI数据库中收录的国内典型流行的NV毒株BJSMQ的基因序列NC_039476.1,合成了NV的标准重组质粒,根据NV的ORF1基因保守序列设计一组特异性引物和荧光探针;通过正交试验进行程序及试剂反应体系的优化,设计TaqMan荧光定量PCR检测方法.结果表明该检测方法具有高灵敏度,最低检测限可达1.2 copies/μL,且在标准重组质粒浓度1.2×10^(5)~1.2×10^(0) copies/μL范围内具有较好的线性关系,其R^(2)=0.9907;该方法特异性强,在病毒的混合重组质粒样液中仅与NV病毒反应;组内和组间的重复性良好,变异系数(CV)值均小于2%;在数字PCR试验中进一步验证了该方法的可行性.本文设计的TaqMan荧光定量PCR检测方法可用于NV毒株的快速准确检测,有望成为NV诊断的有效工具. 展开更多
关键词 诺如病毒 taqman荧光定量pcr 荧光探针 扩增试验 正交试验
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TaqMan实时荧光定量PCR法检测对虾肝肠胞虫(EHP)步骤优化
13
作者 李慰欣 陈政思 黄瑜 《安徽农学通报》 2024年第21期32-36,共5页
优化虾肝肠胞虫(EHP)的TaqMan实时荧光定量PCR检测流程,目的是更准确、快速地检测出虾苗,饵料,亲虾体内携带的EHP。本研究采用酚/氯仿抽提法与水生动物病原体核酸提取试剂盒两种DNA提取方法,对等量的病原组织样本进行了对比提取。此外,... 优化虾肝肠胞虫(EHP)的TaqMan实时荧光定量PCR检测流程,目的是更准确、快速地检测出虾苗,饵料,亲虾体内携带的EHP。本研究采用酚/氯仿抽提法与水生动物病原体核酸提取试剂盒两种DNA提取方法,对等量的病原组织样本进行了对比提取。此外,还设置不同浓度的裂解液以探究其对病原组织裂解效果的影响,并设定不同裂解时间以优化裂解步骤。最后,通过调整qPCR反应的循环数,确定最佳的检测条件。结果显示,水生动物病原体试剂盒提取的DNA检出率高于酚/氯仿抽提法提取,裂解液浓度90%时检测出的EHP含量最高;裂解时间30 min时检测出的EHP含量较高;循环数在40次时足以检测出EHP。综上,优化后的检测流程为用水生动物病原体核酸提取试剂盒提取病原组织DNA,裂解液浓度90%,裂解时间30 min及qPCR检测条件的循环数控制在40次。 展开更多
关键词 虾肝肠胞虫 DNA提取 条件优化 taqman实时荧光定量pcr
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布鲁氏菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步评价
14
作者 常秀琴 郝梦 +4 位作者 雷振华 杨丹 海晓梅 李静 徐珂 《国际检验医学杂志》 CAS 2024年第11期1399-1403,共5页
目的建立快速、准确检测布鲁氏菌感染的TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。方法利用布鲁氏菌IS711基因序列设计特异性引物和探针,并对该方法的特异性、灵敏度及重复性进行评价。结果所建立的检测方法可对布鲁氏菌基因组进行特异性检... 目的建立快速、准确检测布鲁氏菌感染的TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。方法利用布鲁氏菌IS711基因序列设计特异性引物和探针,并对该方法的特异性、灵敏度及重复性进行评价。结果所建立的检测方法可对布鲁氏菌基因组进行特异性检测,对其他细菌无特异性扩增曲线。该检测方法基因拷贝数的检出限为3.8 copy/μL。批内变异系数在0.20%~2.01%,批间变异系数在0.71%~2.57%,具有较高的可重复性。采用qPCR检测临床标本,其灵敏度明显高于血培养检测,可对患者做出准确、及时的诊断。结论该实验建立的TaqMan qPCR检测方法能有效、快速准确地检测布鲁氏菌感染。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 taqman探针 实时荧光定量pcr IS711
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鉴别猪伪狂犬病病毒gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立
15
作者 李倩倩 黄英 +7 位作者 陈翔鸿 宋文博 杨柳 龙云志 余道兵 梁巩 黄超 汤细彪 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第10期68-74,共7页
为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性... 为建立一种鉴别猪伪狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,本试验依据PRV HB-98株和HB2000株的gE和gI基因缺失片段设计特异性引物和探针,优化反应体系,绘制标准曲线,进行特异性试验和敏感性试验,对临床样本和疫苗样本进行检测,并与商品化试剂盒的检测结果进行对比。结果显示,本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线R^(2)为0.9971;该方法特异性强,能区分PRV与其他常见的猪病原体;敏感性高,最低检测限为10 copies/μL;对临床样本的检测结果与商品化试剂盒的检测结果一致;能够区分PRV gI/gE基因部分缺失的疫苗株和野毒株。结果表明,本试验建立了一种特异性强、灵敏度高、适用范围广的鉴别诊断PRV gI/gE基因部分缺失疫苗株和野毒株的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒(PRV) gI/gE基因部分缺失疫苗株 鉴别诊断 taqman实时荧光定量pcr
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猪圆环病毒3型和4型TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法的建立
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作者 殷冬冬 王洁茹 +7 位作者 尹磊 沈学怀 戴银 赵瑞宏 侯宏艳 胡晓苗 王桂军 潘孝成 《安徽农业大学学报》 CAS CSCD 2023年第6期979-984,共6页
为了建立一种快速检测猪圆环病毒3型(PCV3)和4型(PCV4)的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法,根据Gen Bank已登录的PCV3和PCV4基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,经优化各反应条件,构建标准曲线,分析其敏感性、特异性和重复性,并... 为了建立一种快速检测猪圆环病毒3型(PCV3)和4型(PCV4)的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法,根据Gen Bank已登录的PCV3和PCV4基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,经优化各反应条件,构建标准曲线,分析其敏感性、特异性和重复性,并利用建立的荧光定量PCR方法对采自安徽省的临床样品进行检测,与普通PCR方法进行一致性评价。结果显示,PCV3的标准曲线为Y=–3.534 6 logX+41.11(R^(2)=1.00),PCV4的标准曲线为Y=–3.382 5 logX+40.67(R^(2)=1.00)。PCV3和PCV4的检测限分别为49.5和27.1 copies·μL^(-1)。对猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)无特异性扩增,组内和组间变异系数均<1%。临床样品检测结果显示,PCV3阳性检出率为40.8%,PCV4阳性检出率为20.4%,混合感染率为19.0%。建立了灵敏、特异,可同时快速、准确鉴别PCV3和PCV4的TaqMan双重实时荧光定量PCR检测方法,为PCV3和PCV4的检测和监测提供技术支撑。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 猪圆环病毒4型 taqman 实时荧光定量pcr
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犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：6
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作者 赵雪丽 刘毅 +5 位作者 班付国 闫若潜 王华俊 王淑娟 马震原 王东方 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第8期2086-2094,共9页
为建立一种特异、高通量检测犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,本研究选取高度保守且具有型特异性的CDV H基因和CPVVP2基因序列,设计CDV和CPV特异... 为建立一种特异、高通量检测犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)和犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,本研究选取高度保守且具有型特异性的CDV H基因和CPVVP2基因序列,设计CDV和CPV特异性引物对及TaqMan MGB探针;经反应条件优化,建立了检测CDV和CPV的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,该方法检测CDV、CPV的标准曲线线性相关系数(R^2)分别为0.997和0.993,最低检出限均为10拷贝/μL,具有较高的灵敏性;对犬副流感病毒等4种病原对照和阴性对照均未出现扩增,特异性良好;CDV、CPV标准品批间试验结果显示,该方法具有很好的重复性;对48份临床疑似CDV或CPV感染样品检测结果显示,14份为CDV阳性,19份为CPV阳性,4份为CDV/CPV双阳性,与CDV H基因、CPVVP2基因测序结果符合率为100%。本研究建立的二重TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、高通量和可准确定量等优点,可用于临床CDV/CPV病毒感染各个时期的快速鉴别检测。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒(CDV) H基因 犬细小病毒(CPV) VP2基因 二重taqman MGB探针实时荧光定量pcr
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猫疱疹病毒Ⅰ型、猫杯状病毒、支气管败血波氏杆菌多重荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：6
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作者 周红蕾 程淑琴 +3 位作者 李佳鹏 刘涵 姚志兰 张蕾 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第3期130-138,共9页
旨在建立检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus 1,FHV-1)、猫杯状病毒(Feline calicivirus, FCV)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)多重TaqMan荧光定量PCR方法。基于FHV-1的胸苷激酶(TK)基因、FCV的衣壳蛋白VP1基因... 旨在建立检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus 1,FHV-1)、猫杯状病毒(Feline calicivirus, FCV)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)多重TaqMan荧光定量PCR方法。基于FHV-1的胸苷激酶(TK)基因、FCV的衣壳蛋白VP1基因、Bb的皮肤坏死毒素基因(DNT1)序列保守区域设计并合成TaqMan荧光定量PCR引物和探针,以FHV-1、FCV、Bb、猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌为模板验证引物和探针的特异性。制备重组质粒pMD18T-FHV-TK、pMD18T-FCV-VP1、pMD18T-Bb-DNT1作为标准品,经矩阵法确定最佳反应体系。以10倍梯度稀释的标准品为模板检测方法的灵敏性。应用建立的方法对32份临床具有上呼吸道感染症状的猫眼、口、鼻拭子检测,以评估该方法的可行性。结果显示:该方法可特异性检出FHV-1、FCV、Bb,且与猫细小病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌无交叉反应;灵敏度试验表明该方法对FHV-1、FCV、Bb的最低检出限分别为10、10和100拷贝/μL;应用该方法从32份猫临床样品中检测出FHV-1阳性11份、FCV阳性21份、Bb阳性4份,并经PCR测序验证。本研究初步建立了FHV-1、FCV、Bb多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,具有特异性强、敏感性高的特点,为临床猫上呼吸道疾病病原的分子检测提供参考。 展开更多
关键词 猫疱疹病毒Ⅰ型 猫杯状病毒 支气管败血波氏杆菌 taqman荧光定量pcr
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诺如病毒和轮状病毒多重荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用 被引量：2
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作者 蒋立立 吴永彬 +5 位作者 刘志冰 何黎莹 黄杨 林晓燕 杨海英 王兴叶 《动物医学进展》 北大核心 2023年第3期43-48,共6页
诺如病毒和轮状病毒感染可引起临床高发且症状相似的胃肠炎,急需能够快速准确鉴定两种病毒的方法。用基因保守区域设计特异性引物和探针,通过引物优化、温度调整、性能评估等建立从粪便中特异性检出诺如病毒(GⅠ、GⅡ型)和A组轮状病毒... 诺如病毒和轮状病毒感染可引起临床高发且症状相似的胃肠炎,急需能够快速准确鉴定两种病毒的方法。用基因保守区域设计特异性引物和探针,通过引物优化、温度调整、性能评估等建立从粪便中特异性检出诺如病毒(GⅠ、GⅡ型)和A组轮状病毒试剂盒。结果显示,最低检测下限为1.0×10^(3)copies/mL,与当前交叉流行的其他16种病原均不发生特异性反应;组内及组间重复性良好,预混液在不同储存条件下,其检测能力与未处理组无差异。临床收集的276份腹泻样品,共检出诺如病毒GⅠ型15份,GⅡ型74份,A组轮状病毒45份,其检测结果与单一PCR检测结果一致。以上结果表明建立的三重荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、性能稳定等特点,将为2种3个型病毒的特异性检测和疫情防控提供技术支持。 展开更多
关键词 诺如病毒 轮状病毒 三重荧光定量pcr
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猪细小病毒7型荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：1
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作者 吕紫欣 张鑫杰 +2 位作者 薛少华 陈瑶 戴爱玲 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期49-54,共6页
猪细小病毒7型(PPV7)是近年来新发现的一种新型PPV。目前,缺乏更为高效的针对PPV7的检测方法,为了建立能够快速检测PPV7的方法,本研究根据PPV7 NS1基因的保守区序列,设计1对特异性引物及TaqMan探针。经过各反应条件的优化,初步建立了一... 猪细小病毒7型(PPV7)是近年来新发现的一种新型PPV。目前,缺乏更为高效的针对PPV7的检测方法,为了建立能够快速检测PPV7的方法,本研究根据PPV7 NS1基因的保守区序列,设计1对特异性引物及TaqMan探针。经过各反应条件的优化,初步建立了一种便捷、灵敏、能够快速准确检测PPV7的荧光定量PCR(qPCR)方法,并对其特异性、敏感性、稳定性以及与SYBR GreenⅠqPCR检测方法的符合率进行检测与对比。结果显示,该方法除对PPV7的基因组DNA有特异性扩增,对猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、日本乙型脑炎病毒及PPV1核酸均无交叉反应,特异性较强。该方法对重组质粒标准品检测限为1.76拷贝/μL,而常规PCR方法检测限为1.76×10^(2)拷贝/μL,表明本研究建立的方法敏感性较高。该方法对不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验变异系数均小于1.7%,重复性较好。利用本研究建立的qPCR方法和SYBR GreenⅠqPCR方法对采自福建地区的150份样品进行检测,结果显示,两种检测方法的阳性率分别为24.67%(37/150)和6.67%(10/150),二者的总符合率为80.67%(121/150)。表明本研究建立的qPCR方法可以用于临床样品的检测。本研究建立的qPCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性稳定性好,为PPV7的流行病学调查及检测提供了新的技术支撑。 展开更多
关键词 猪细小病毒7型 taqman探针 荧光定量pcr
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