目的研究miR-145-3p能否调控人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)的自噬及其可能存在的作用机制。方法收集12~18岁因正畸需要减数而拔除的健康前磨牙,采集和培养HPDLFs,并进行鉴定。将miR-145-3p类似物(miR-145-3p-mimics组)、miR-145-3p抑制物(...目的研究miR-145-3p能否调控人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)的自噬及其可能存在的作用机制。方法收集12~18岁因正畸需要减数而拔除的健康前磨牙,采集和培养HPDLFs,并进行鉴定。将miR-145-3p类似物(miR-145-3p-mimics组)、miR-145-3p抑制物(miR-145-3p-inhibitor组)、阴性对照(miR-145-3p normal control,miR-145-3p-NC组)以及带有GFP-LC3的质粒转染至HPDLFs,24 h后荧光显微镜观察荧光发生情况。双荧光素酶报告实验验证miR-145-3p与HDAC4的靶向关系,Western Blot检测各转染组细胞内HDAC4、Beclin-1、P62和LC3的蛋白表达。结果免疫组化结果表明,波形蛋白为阳性染色而角蛋白呈阴性染色,证明其为无混杂细胞的HPDLFs。转染结果显示,miR-145-3p-mimics组的细胞内荧光强度最高,有大量自噬体形成,而miR-145-3p-inhibitor组荧光最弱。双荧光素酶报告实验证实miR-145-3p靶向抑制HPDLFs细胞中HDAC4的表达。4组细胞中miR-145-3p-inhibitor组P62蛋白表达最高(P<0.05),而其他3组差异无统计学意义(P>0.05);miR-145-3p-mimics组细胞内Beclin-1和LC3蛋白表达最高(P<0.05),其他3组差异无统计学意义(P>0.05)。结论miR-145-3p在HPDLFs中可调控自噬,这种作用可能是通过靶向抑制HDAC4表达实现的。展开更多
目的:本实验通过反转录聚合酶链反应,测定不同浓度的重组人骨形成蛋白2(rhBMP2)对人牙周膜成纤维细胞中cbfα1mRNA在不同作用时间点表达,了解rhBMP2对骨改建过程的调控。方法:原代培养人牙周膜成纤维细胞,取生长良好的第6代细胞,分别用2...目的:本实验通过反转录聚合酶链反应,测定不同浓度的重组人骨形成蛋白2(rhBMP2)对人牙周膜成纤维细胞中cbfα1mRNA在不同作用时间点表达,了解rhBMP2对骨改建过程的调控。方法:原代培养人牙周膜成纤维细胞,取生长良好的第6代细胞,分别用25ng/ml、50ng/ml及100ng/ml的rhBMP2作用于细胞,于作用1、3、5、7天后收集细胞。反转录聚合酶链反应检测各组细胞4个时间作用点cbfα1 mRNA含量,PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳后,采用Image Pro Plus5.0图像分析软件对电泳胶带亮度进行分析。结果:不同浓度rhBMP2对cbfα1mRNA的表达均表现为初期降低,而后明显增高,至峰值后回落。不同浓度对cbfα1 mRNA表达上调的峰值没有明显差异。100ng/ml和50ng/ml的rhBMP2浓度组能够较快地上调cbfα1mRNA表达至峰值,然后100ng/ml组表现为缓慢下降,50ng/ml组迅速回落;25ng/ml组较慢上调cbfα1mRNA的表达至峰值后,迅速回落。结论:①根据实验各组中cbfα1的表达变化,提示笔者BMP2可以上调HPDLfs中cbfα1的转录水平,并且对cbfα1的表达调控主要为启动作用,cbfα1的表达增高幅度似乎与rhBMP2浓度并不相关。②高浓度组对cbfα1的上调作用迅速而持久,低浓度组的作用则相对迟缓而短暂。提示笔者BMP2可能通过上调cbfα1的表达而促进HPDLfs向成骨细胞转化。展开更多
文摘目的研究miR-145-3p能否调控人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)的自噬及其可能存在的作用机制。方法收集12~18岁因正畸需要减数而拔除的健康前磨牙,采集和培养HPDLFs,并进行鉴定。将miR-145-3p类似物(miR-145-3p-mimics组)、miR-145-3p抑制物(miR-145-3p-inhibitor组)、阴性对照(miR-145-3p normal control,miR-145-3p-NC组)以及带有GFP-LC3的质粒转染至HPDLFs,24 h后荧光显微镜观察荧光发生情况。双荧光素酶报告实验验证miR-145-3p与HDAC4的靶向关系,Western Blot检测各转染组细胞内HDAC4、Beclin-1、P62和LC3的蛋白表达。结果免疫组化结果表明,波形蛋白为阳性染色而角蛋白呈阴性染色,证明其为无混杂细胞的HPDLFs。转染结果显示,miR-145-3p-mimics组的细胞内荧光强度最高,有大量自噬体形成,而miR-145-3p-inhibitor组荧光最弱。双荧光素酶报告实验证实miR-145-3p靶向抑制HPDLFs细胞中HDAC4的表达。4组细胞中miR-145-3p-inhibitor组P62蛋白表达最高(P<0.05),而其他3组差异无统计学意义(P>0.05);miR-145-3p-mimics组细胞内Beclin-1和LC3蛋白表达最高(P<0.05),其他3组差异无统计学意义(P>0.05)。结论miR-145-3p在HPDLFs中可调控自噬,这种作用可能是通过靶向抑制HDAC4表达实现的。
文摘目的:本实验通过反转录聚合酶链反应,测定不同浓度的重组人骨形成蛋白2(rhBMP2)对人牙周膜成纤维细胞中cbfα1mRNA在不同作用时间点表达,了解rhBMP2对骨改建过程的调控。方法:原代培养人牙周膜成纤维细胞,取生长良好的第6代细胞,分别用25ng/ml、50ng/ml及100ng/ml的rhBMP2作用于细胞,于作用1、3、5、7天后收集细胞。反转录聚合酶链反应检测各组细胞4个时间作用点cbfα1 mRNA含量,PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳后,采用Image Pro Plus5.0图像分析软件对电泳胶带亮度进行分析。结果:不同浓度rhBMP2对cbfα1mRNA的表达均表现为初期降低,而后明显增高,至峰值后回落。不同浓度对cbfα1 mRNA表达上调的峰值没有明显差异。100ng/ml和50ng/ml的rhBMP2浓度组能够较快地上调cbfα1mRNA表达至峰值,然后100ng/ml组表现为缓慢下降,50ng/ml组迅速回落;25ng/ml组较慢上调cbfα1mRNA的表达至峰值后,迅速回落。结论:①根据实验各组中cbfα1的表达变化,提示笔者BMP2可以上调HPDLfs中cbfα1的转录水平,并且对cbfα1的表达调控主要为启动作用,cbfα1的表达增高幅度似乎与rhBMP2浓度并不相关。②高浓度组对cbfα1的上调作用迅速而持久,低浓度组的作用则相对迟缓而短暂。提示笔者BMP2可能通过上调cbfα1的表达而促进HPDLfs向成骨细胞转化。
