从6月龄流产的胎儿肝脏中提取总RNA,利用反转录-PCR(RT-PCR)技术扩增出人肝细胞再生增强因子hALR(Human augmenter of liver regeneration)基因片段,克隆于PET28a(+)载体,经进一步PCR及酶切鉴定,确定为此目的片段后进行序列分析,再将目...从6月龄流产的胎儿肝脏中提取总RNA,利用反转录-PCR(RT-PCR)技术扩增出人肝细胞再生增强因子hALR(Human augmenter of liver regeneration)基因片段,克隆于PET28a(+)载体,经进一步PCR及酶切鉴定,确定为此目的片段后进行序列分析,再将目的片段亚克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+),用酶切方法鉴定重组子。采用RT-PCR技术成功地获得了hALR基因片段。序列分析表明,克隆的hALR基因与Genbank报道的人ALR核苷酸序列基本一致。完成了真核表达载体的构建,为hALR基因的真核表达奠定了基础。展开更多
PCR扩增人肝细胞再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration,ALR)基因,将其插入质粒pIRES2-EGFP多克隆位点中,构建成新霉素(Neo)、增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)双标记基因且EGFP和ALR基因为...PCR扩增人肝细胞再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration,ALR)基因,将其插入质粒pIRES2-EGFP多克隆位点中,构建成新霉素(Neo)、增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)双标记基因且EGFP和ALR基因为双顺反子的真核表达载体pAIE.另外体外培养绵羊胎儿成纤维细胞(Sheep fetal fibroblast cells,sFFCs),脂质体lipofectAMINETM介导pAIE转染sFFCs,经过筛选后形成单克隆细胞,RT-PCR和免疫组化方法进一步检测ALR基因的表达.进一步将转基因细胞饥饿培养,体外成熟培养绵羊卵母细胞146个,进行体细胞核移植,经融合、激活后,在培养液中进行发育培养,对发育到8细胞胚胎在激光共聚焦显微镜下观察;同时利用免疫组化检测ALR基因在胚胎中的表达.结果表明:由IRES连接的EGFP和ALR基因在sFFCs内同时存在并表达;得到45个8细胞体细胞克隆胚胎,其中14个发育形成囊胚,EGFP和ALR基因在体细胞克隆胚胎中同时存在并表达.因此由IRES连接标记基因和目的基因,以标记基因指示目的基因的表达,可减少检测目的基因的繁琐手段,可得到高纯度表达ALR基因的转基因细胞和胚胎,为生产药用蛋白治疗肝脏疾病奠定实验基础.展开更多
从人血液中提取总DNA,利用PCR技术扩增人肝细胞再生增生因子基因,将其插入表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中,构建增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein gene,EGFP)和人肝细胞再生增强因子(human augmenter of liver reg...从人血液中提取总DNA,利用PCR技术扩增人肝细胞再生增生因子基因,将其插入表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中,构建增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein gene,EGFP)和人肝细胞再生增强因子(human augmenter of liver regeneration gene,ALR)融合基因表达载体pEGFP/ALR,并将其转染Hela细胞系,用含G 418的DMEM/F12培养液筛选转基因细胞,然后利用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测转基因细胞中ALR基因的存在及其表达,用荧光显微镜检测EGFP基因的表达.结果显示:得到了构建正确的EGFP和ALR融合基因表达载体;在转基因细胞中,PCR扩增得到1.7 Kb的ALR条带,蛋白电泳得到57 KD大小条带,与ALR和EGFP融合蛋白大小相符;荧光显微镜下观察到发绿色荧光的Hela细胞.在转基因细胞中,EGFP和ALR同时存在并表达,绿色荧光蛋白可作为报告基因指示目的基因的表达,从而简化了目的基因繁琐的检测手段.展开更多
文摘从6月龄流产的胎儿肝脏中提取总RNA,利用反转录-PCR(RT-PCR)技术扩增出人肝细胞再生增强因子hALR(Human augmenter of liver regeneration)基因片段,克隆于PET28a(+)载体,经进一步PCR及酶切鉴定,确定为此目的片段后进行序列分析,再将目的片段亚克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+),用酶切方法鉴定重组子。采用RT-PCR技术成功地获得了hALR基因片段。序列分析表明,克隆的hALR基因与Genbank报道的人ALR核苷酸序列基本一致。完成了真核表达载体的构建,为hALR基因的真核表达奠定了基础。
文摘从人血液中提取总DNA,利用PCR技术扩增人肝细胞再生增生因子基因,将其插入表达载体pEGFP-C1的多克隆位点中,构建增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein gene,EGFP)和人肝细胞再生增强因子(human augmenter of liver regeneration gene,ALR)融合基因表达载体pEGFP/ALR,并将其转染Hela细胞系,用含G 418的DMEM/F12培养液筛选转基因细胞,然后利用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测转基因细胞中ALR基因的存在及其表达,用荧光显微镜检测EGFP基因的表达.结果显示:得到了构建正确的EGFP和ALR融合基因表达载体;在转基因细胞中,PCR扩增得到1.7 Kb的ALR条带,蛋白电泳得到57 KD大小条带,与ALR和EGFP融合蛋白大小相符;荧光显微镜下观察到发绿色荧光的Hela细胞.在转基因细胞中,EGFP和ALR同时存在并表达,绿色荧光蛋白可作为报告基因指示目的基因的表达,从而简化了目的基因繁琐的检测手段.
