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人胰岛素原突变体重组逆转录病毒及稳定包装细胞系的构建和鉴定 被引量：1
1
作者 兰丽珍 邓华聪 +2 位作者 孙辽 郑丹 弓军胜 《山西医科大学学报》 CAS 2004年第2期97-100,共4页
目的　构建携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法　采用PCR重叠延伸定点突变技术 ,将普通细胞内Furin蛋白酶的识别和切割位点Arg X Lys Arg 样序列 ,引入人胰岛素原C肽两端 ,同时加上信号肽、Kozak序列和酶切... 目的　构建携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体及稳定的包装细胞系。方法　采用PCR重叠延伸定点突变技术 ,将普通细胞内Furin蛋白酶的识别和切割位点Arg X Lys Arg 样序列 ,引入人胰岛素原C肽两端 ,同时加上信号肽、Kozak序列和酶切位点并克隆至逆转录病毒载体 pLXSN中 ,测序正确后转染包装细胞PA317,经G4 18筛选后挑选稳定生产病毒的细胞株 ,用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果　测序证明胰岛素原cDNA的 5个预定位点成功突变 ,其上游加上了信号肽和增强表达的Kozak序列 ;G4 18筛选重组pL mPIN SN转染PA317细胞抗性克隆 ,其病毒滴度为 2 .6× 10 5CFU/ml,而且基因组PCR和病毒液的RT PCR都显示有 2 86bp的条带 ,提示构建携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体以及稳定的包装细胞系成功。结论　成功构建了携带人胰岛素原突变体的逆转录病毒载体及包装细胞系 。 展开更多
关键词 人胰岛素原突变体 基因重组 逆转录病毒载体 包装细胞系 基因治疗 糖尿病
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钙调素-人胰岛素原融合体的酶切加工
2
作者 王学祥 井健 《北京师范大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期285-288,共4页
通过基因工程方法将人胰岛素原突变体偶联钙调素形成融合态重组蛋白质,在该重组蛋白质中设计具有PRESCI蛋白酶酶切位点.制备PRESCI蛋白酶并对钙调素-人胰岛素原突变体重组蛋白质进行酶切加工.研究表明,该重组融合蛋白质可被有效切割,通... 通过基因工程方法将人胰岛素原突变体偶联钙调素形成融合态重组蛋白质,在该重组蛋白质中设计具有PRESCI蛋白酶酶切位点.制备PRESCI蛋白酶并对钙调素-人胰岛素原突变体重组蛋白质进行酶切加工.研究表明,该重组融合蛋白质可被有效切割,通过蛋白质纯化手段能够有效地将切割后的钙调素与人胰岛素原突变体进行纯化. 展开更多
关键词 人胰岛素原突变体 PRESCI蛋白酶 酶切 纯化
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