凝胶色谱柱复性在低分子量尿激酶原突变体(DscuPA-32K)中的应用 被引量：4

1

作者 焦建伟 俞梅敏 茹炳根 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期300-303,共4页

将构建的一种具溶栓和抗栓双重功能尿激酶原突变体 (DscuPA 32K)基因 ,在大肠杆菌中进行表达。由于DscuPA 32K分子较大并且表达量较高 ,目的蛋白质基本以包涵体的形式存在。包涵体中的蛋白质是无活性的蛋白质 ,为了获得有活性的蛋白质 ... 将构建的一种具溶栓和抗栓双重功能尿激酶原突变体 (DscuPA 32K)基因 ,在大肠杆菌中进行表达。由于DscuPA 32K分子较大并且表达量较高 ,目的蛋白质基本以包涵体的形式存在。包涵体中的蛋白质是无活性的蛋白质 ,为了获得有活性的蛋白质 ,就需要对包涵体进行变性及复性。尝试了一种新的凝胶色谱柱复性方法 ,并通过柱复性方法与常规的稀释复性方法进行了比较 ,发现柱复性方法明显优于稀释复性方法 ,具有成本低 ,效率高 ,并对目的蛋白质 (DscuPA 32K)进行了初步纯化等优点 ,尤其对酶这一类容易失活降解的蛋白质进行复性时 。 展开更多

关键词 低分子量尿激酶原 包涵体 复性 基因突变体 色谱柱洗脱 溶栓药物

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真核低分子量尿激酶原突变体基因在大肠杆菌中的高效表达 被引量：1

2

作者 焦建伟 俞梅敏 茹炳根 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期340-343,共4页

通过一种融合抗栓肽的低分子量尿激酶原的突变体 (DscuPA 32K)在大肠杆菌中表达的研究 ,进行了一系列不同条件下的实验 .DscuPA 32K在菌株BL2 1中的表达很低 ,表达量仅为 3% ;为提高其表达量 ,引进一种整合稀有tRNA基因的菌株BL2 1 Cod... 通过一种融合抗栓肽的低分子量尿激酶原的突变体 (DscuPA 32K)在大肠杆菌中表达的研究 ,进行了一系列不同条件下的实验 .DscuPA 32K在菌株BL2 1中的表达很低 ,表达量仅为 3% ;为提高其表达量 ,引进一种整合稀有tRNA基因的菌株BL2 1 CodonPlusTM RIL ,增加大肠杆菌中识别稀有密码子的tRNA的数量 ,DscuPA 32K的表达水平确实有了很大提高 ,最大表达量约占 2 0 % .结果表明 ,富含稀有密码子的DscuPA 32K在大肠杆菌中表达受限制的因素 ,完全可以由增加稀有tRNA的数量来克服 .免疫印迹分析DscuPA 32K具有良好的抗原性 .此表达菌株可能有利于含大肠杆菌稀有密码子的真核基因在大肠杆菌中的表达 . 展开更多

关键词 低分子量尿激酶原 突变体 表达 稀有密码子 大肠杆菌

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低分子量尿激酶与Annexin V的融合基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

3

作者 王丽鸳 金勇丰 +1 位作者 朱成钢 张耀洲 《蚕业科学》 CAS CSCD 2003年第3期246-250,共5页

将低分子量尿激酶与膜联蛋白 (AnnexinV)的融合基因重组到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK UKAV ,并与线性化的病毒Bm PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK UKAV。将重组病毒BacPAK UKAV感染家蚕培养细... 将低分子量尿激酶与膜联蛋白 (AnnexinV)的融合基因重组到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK UKAV ,并与线性化的病毒Bm PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK UKAV。将重组病毒BacPAK UKAV感染家蚕培养细胞 (MOI=10 )和 5龄幼虫 (10 5pfu/头 ) ,Western印迹方法表明表达产物大小约为 6 9kD。用纤维蛋白平板溶圈法测定表达产物的纤溶活性 ,其融合蛋白具有明显的纤溶活性 ,约为 5× 10 -5U/个细胞。用APTT法测定表达产物的抗凝活性 ,比野生病毒Bm PAK6感染表达产物的APTT时间延长了 1倍以上 ,表现出明显的抗凝活性。体外实验表明 ,家蚕培养细胞和幼虫表达的重组低分子量尿激酶与AnnexinV融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。研究结果为今后进一步探索具有溶栓抗栓功能的血栓药物提供了新的方向。 展开更多

关键词 低分子量尿激酶 ANNEXINV 膜联蛋白V 融合基因 家蚕杆状病毒表达系统 基因表达 溶栓药物

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用弱化dhfr双顺反子载体在CHO细胞中高效表达低分子量尿激酶突变体 被引量：1

4

作者 潘淑媛 高丽华 +6 位作者 胡显文 杨波 殷亮 胥照平 张正光 郗永义 陈惠鹏 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期834-840,共7页

将二氢叶酸还原酶基因（dhfr）克隆至pIRES载体中弱化的脑心肌炎病毒（ECMV）内部核糖体进入位点（IRES）的下游，构建了含有弱化dhfr筛选标记和可用氨甲蝶呤（MTX）加压提高表达水平的双顺反子真核表达载体pIRES—dhfr。利用该表达载... 将二氢叶酸还原酶基因（dhfr）克隆至pIRES载体中弱化的脑心肌炎病毒（ECMV）内部核糖体进入位点（IRES）的下游，构建了含有弱化dhfr筛选标记和可用氨甲蝶呤（MTX）加压提高表达水平的双顺反子真核表达载体pIRES—dhfr。利用该表达载体表达了一种无糖基化和具有凝血酶抗性的低分子量尿激酶型纤溶酶原激活剂（LMW—uPA）突变体（缺失尿激酶原的1—143位氨基酸，Arg156→Lys，Asn302→Ala），用脂质体转染方法将表达载体pIRES—dhfr／LMW—UK转染CHO—dhfr-细胞后经过一轮MTX筛选，几乎所有获得的单克隆细胞株都表达LMW—UK，其中约50％为表达水平较接近（500—5000IU／10^6cells／d）的高表达阳性克隆。用转瓶无血清培养表达水平约为17．5pg／cell／d的rCHO细胞系LB2-UK，收集的上清经过阳离子交换柱和凝胶过滤层析两步纯化后，获得的重组蛋白的纯度可以达到99％。用S-2444发色底物法检测，所获得的突变体双链UK比例大于98％。 展开更多

关键词 低分子量尿激酶 突变体 内部核糖体进入位点 二氢叶酸还原酶基因 重组CHO细胞

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纤维蛋白肽与低分子量尿激酶原融合蛋白的构建及性质 被引量：1

5

作者 焦建伟 刘宁 +1 位作者 俞梅敏 茹炳根 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2001年第6期862-865,共4页

将人工合成的寡核苷酸片段进行定向连接后 ,得到编码纤维蛋白 β链N端 (β 15～ 42 )多肽的基因片段及连接区片段 (linker) ,再与低分子量尿激酶原 (scuPA 32k)cDNA分子进一步连接后 ,得到了Fβ (15～ 42 ) /scuPA 32k的融合基因 .在大... 将人工合成的寡核苷酸片段进行定向连接后 ,得到编码纤维蛋白 β链N端 (β 15～ 42 )多肽的基因片段及连接区片段 (linker) ,再与低分子量尿激酶原 (scuPA 32k)cDNA分子进一步连接后 ,得到了Fβ (15～ 42 ) /scuPA 32k的融合基因 .在大肠杆菌中经过IPTG诱导表达 ,经过变性及复性 ,Zn2 + 螯合层析及SephacrylS2 0 0凝胶层析后 ,目的蛋白被纯化 .SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)显示为一条蛋白质纯化条带 ,分子质量为35ku .经纤维蛋白平板法测定比活为 870 0 0U/mg.经纤溶酶活化后的融合蛋白与低分子量尿激酶相比 ,对显色底物S2 44 4酶促动力学性质相似 .同时Fβ (15～ 42 ) /scuPA 展开更多

关键词 低分子量单链尿激酶原 纤维蛋白肽 融合蛋白 表达 性质

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低分子量尿激酶突变体及其表达载体

6

《药物生物技术》 CAS CSCD 2007年第6期400-400,共1页

本发明中低子量尿激酶突变体，具有序列表SEQ ID No．1所示的氨基酸序列。本发明的优点是：与天然HMW-uPA相比：（1）可提高产品的稳定性，使产品更均一，有利于产品的质量控制；（2）可避免体内凝血酶对pro-UK的灭活作用，提高血药浓... 本发明中低子量尿激酶突变体，具有序列表SEQ ID No．1所示的氨基酸序列。本发明的优点是：与天然HMW-uPA相比：（1）可提高产品的稳定性，使产品更均一，有利于产品的质量控制；（2）可避免体内凝血酶对pro-UK的灭活作用，提高血药浓度以提高溶栓效率；可延长药物的体内半衰期；（3）可提高蛋白质的比活性，减少用药量。分子量较小的LMW-UK不仅容易表达，而且临床剂量还可减少，非常有利于哺乳动物细胞表达的生物技术药物的产业化。 展开更多

关键词 低分子量尿激酶 突变体 表达载体 生物技术药物 氨基酸序列 体内半衰期 动物细胞表达 质量控制

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水蛭素12肽与低分子量尿激酶融合基因的构建和表达 被引量：1

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作者 刘凤云 李秀珍 +1 位作者 李风知 程度胜 《军事医学科学院院刊》 CSCD 北大核心 1998年第1期16-19,共4页

目的：旨在获得既能抗栓又能溶栓的双功能蛋白，并在大肠杆菌中表达。方法：化学合成水蛭素１２肽基因编码序列。通过ＤＮＡ重组技术将水蛭素１２肽基因片段连接到低分子量尿激酶ｃＤＮＡ片段５′端，构建成融合基因。结果：构建了水蛭... 目的：旨在获得既能抗栓又能溶栓的双功能蛋白，并在大肠杆菌中表达。方法：化学合成水蛭素１２肽基因编码序列。通过ＤＮＡ重组技术将水蛭素１２肽基因片段连接到低分子量尿激酶ｃＤＮＡ片段５′端，构建成融合基因。结果：构建了水蛭素１２肽与低分子量尿激酶的融合基因，在大肠杆菌中获得表达。重组融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。结论：运用ＤＮＡ重组技术可将两种不同功能的蛋白合理地融合在一起，使其具有溶纤活性和抗凝活性。 展开更多

关键词 水蛭素12肽 低分子量尿激酶 抗凝血酶 融合基因

原文传递

镧、铈对低分子量单链尿激酶基因在酵母中表达的影响

8

作者 任育红 刘晖 +2 位作者 刘玉鹏 王兰仙 徐长法 《中国稀土学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期284-286,共3页

LaCl3能提高rscu PA 3 2k在酵母中的表达效率 ,2和 5mmol·L- 1 LaCl3可以使表达产物活力提高 13 %和 2 0 % ,从 14 6U/ml分别增加到 16 5和 17 5U/ml;而CeCl3则使表达产物的活力降低 ,2和 5mmol·L- 1 CeCl3分别使产物活力下... LaCl3能提高rscu PA 3 2k在酵母中的表达效率 ,2和 5mmol·L- 1 LaCl3可以使表达产物活力提高 13 %和 2 0 % ,从 14 6U/ml分别增加到 16 5和 17 5U/ml;而CeCl3则使表达产物的活力降低 ,2和 5mmol·L- 1 CeCl3分别使产物活力下降了 2 1%和 3 3 % ,从 14 6U/ml分别下降到 11 5和 9 展开更多

关键词 稀土 氯化镧 氯化铈 低分子量单链尿激酶 酵母 基因表达 血栓 治疗 溶栓剂

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水蛭素12肽与低分子量单链尿激酶融合基因的构建、表达及产物特性分析

9

作者 刘凤云 李秀珍 +1 位作者 李风知 程度胜 《生物技术通讯》 CAS 1996年第3期114-117,共4页

用化学合成的方法合成了水蛭素12肽基因的编码序列,通过DNA重组技术将水蛭素12肽基因片段与低分子量单链尿激酶cDNA片段连接构建了融合基因。融合基因在大肠杆菌中获得表达。体外实验结果表明,表达的融合蛋白具有溶纤活性和抗凝活性。

关键词 水蛭素12肽 低分子量单链尿激酶 溶纤活性 抗凝活性

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血纤蛋白粘附肽与低分子量单链尿激酶融合基因在大肠杆菌中的表达

10

作者 张用书 李秀珍 +1 位作者 程度胜 刘凤云 《生物技术通讯》 CAS 1996年第3期110-113,共4页

人工合成了血纤蛋白粘附肽基因,构建了粘附肽与低分子量单链尿激酶cDNA的融合基因,在大肠杆菌中表达了融合基因。融合基因表达产物的抗原性和天然尿激酶相同,并具有尿激酶的溶纤活性和粘附肽的抗纤维蛋白单体聚合的功能。

关键词 低分子量单链尿激酶 血纤蛋白粘附肽 融合基因

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鼠抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶杂合基因的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

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作者 舒东 俞炜源 +2 位作者 赵志玲 徐兵 罗深秋 《生物技术通讯》 CAS 1999年第2期109-113,共5页

采用 DNA重组技术构建了表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶融合基因的真核表达载体。通过磷酸钙共沉淀法 ,将该表达载体转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株 ( CHO- dhfr-)中 ,利用选择培养基筛选出稳定表达的细... 采用 DNA重组技术构建了表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶融合基因的真核表达载体。通过磷酸钙共沉淀法 ,将该表达载体转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株 ( CHO- dhfr-)中 ,利用选择培养基筛选出稳定表达的细胞株 ,溶解圈法测定融合蛋白的表达水平为每 1 0 6细胞每天 5 8IU。该融合蛋白保留了与纤维蛋白的结合活性和溶解纤维蛋白的溶纤活性。SDS- PAGE,Western印迹法分析证明融合蛋白的相对分子质量约为 70× 1 0 展开更多

关键词 单链抗体 低分子量尿激酶 融合蛋白 CHO-dhfr-细胞

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溶栓与抗栓双功能尿激酶原突变体的模拟、构建与表达 被引量：3

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作者 张磊亮 焦建伟 +2 位作者 邵开峰 俞梅敏 茹炳根 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2004年第6期1046-1050,共5页

将抗栓肽 ( Decorsin)嫁接到低分子量尿激酶原 ( scu PA-3 2 k)上 ,可以期望获得既具有抗血小板聚集活性 ,又具有溶栓活性的新型基因工程蛋白质分子 .利用计算机辅助分子设计手段模拟了该融合蛋白的分子结构 ,证明其活性区可以正常发挥... 将抗栓肽 ( Decorsin)嫁接到低分子量尿激酶原 ( scu PA-3 2 k)上 ,可以期望获得既具有抗血小板聚集活性 ,又具有溶栓活性的新型基因工程蛋白质分子 .利用计算机辅助分子设计手段模拟了该融合蛋白的分子结构 ,证明其活性区可以正常发挥功能 .根据大肠杆菌偏好密码子合成 Decorsin的基因 ,与 scu PA-3 2 k基因融合在一起 ,构建新的嵌合体基因 dscu PA,并在大肠杆菌中通过 IPTG进行诱导表达 ,该重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式存在 .对包涵体进行变性和复性并通过层析纯化得到目的蛋白质 .用纤维蛋白平板法测得重组蛋白的比活为 92 0 0 0 IU/mg.激活纤溶酶原的酶促动力学性质与天然低分子量尿激酶相似 ,且有较强的抑制血小板聚集的功能 .重组蛋白 dscu PA不但具有较强的溶栓功能 ,而且具有抗栓功能 . 展开更多

关键词 低分子量尿激酶原 抗栓肽 血小板聚集

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离子交换层析结合分子排阻色谱法测定注射用尿激酶中分子组分比 被引量：1

13

作者 严翠霞 尹红锐 +3 位作者 史芳亮 陈钢 郑璐侠 邵泓 《药物分析杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期1-11,共11页

目的:建立测定注射用尿激酶分子组分比的离子交换层析样品前处理方法结合分子排阻色谱法的分析方法,以解决长期以来制剂标准中无法控制分子组分比的难题,并对国内6家企业的产品质量进行了考察。方法:根据尿激酶与人血白蛋白等电点的差异... 目的:建立测定注射用尿激酶分子组分比的离子交换层析样品前处理方法结合分子排阻色谱法的分析方法,以解决长期以来制剂标准中无法控制分子组分比的难题,并对国内6家企业的产品质量进行了考察。方法:根据尿激酶与人血白蛋白等电点的差异,通过离子交换层析去除样品中人血白蛋白辅料的干扰,采用分子排阻色谱法测定。采用TSKgel G2000SWXL色谱柱(300 mm×7.8 mm, 5μm),流动相为0.1 mol·L^(-1)磷酸二氢钠缓冲液(pH 3.0),流速为0.5 mL·min^(-1),柱温为35℃,检测波长为280 nm,进样量为50μL。结果:尿激酶质量浓度在0.05~5.1 mg·mL^(-1)范围内,高分子量尿激酶与低分子量尿激酶线性关系均良好(r≥0.998 0);检测限分别为1.5μg·mL^(-1)与5.1μg·mL^(-1),定量限分别为5.1μg·mL^(-1)与16.9μg·mL^(-1);精密度、重复性、24 h稳定性试验的RSD均<4.0%;方法的回收率为92.5%~97.0%;18批样品中高分子量尿激酶与低分子量尿激酶的相对含量范围分别为82.8%~96.5%与3.5%~17.2%。结论:建立的离子交换层析结合分子排阻色谱法可用于注射用尿激酶中分子组分比的测定,弥补了注射用尿激酶现行国家标准中分子组分比测定的空白。 展开更多

关键词 注射用尿激酶 高分子量尿激酶 低分子量尿激酶 分子组分比 离子交换层析 分子排阻色谱

原文传递

共表达TrxA和DsbC对富含二硫键的异源蛋白在大肠杆菌中表达的影响 被引量：4

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作者 刘志刚 林建波 +1 位作者 康铁军 俞炜源 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期486-489,共4页

以复制子为p15A的质粒pACU184为基础 ,构建了 3种表达硫氧还蛋白 (TrxA)或 和二硫键异构酶 (DsbC)的表达质粒 .经IPTG诱导 ,克隆的DsbC和TrxA都以可溶的形式高表达 .分别将构建的 3种表达质粒与复制子为colE1并克隆有人源化鼠抗人纤维... 以复制子为p15A的质粒pACU184为基础 ,构建了 3种表达硫氧还蛋白 (TrxA)或 和二硫键异构酶 (DsbC)的表达质粒 .经IPTG诱导 ,克隆的DsbC和TrxA都以可溶的形式高表达 .分别将构建的 3种表达质粒与复制子为colE1并克隆有人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体 低分子量尿激酶融合基因 (C6 UK)的表达质粒共转化大肠杆菌XL1 blue ,在 30℃用IPTG诱导表达 .SDS PAGE显示 ,共表达TrxA或DsbC都能导致C6 UK融合蛋白的部分可溶性表达 ,而且同时共表达TrxA和DsbC 2种分子时 ,C6 UK完全以可溶形式表达 ,但表达量降低 .分别用溶圈法和ELISA检测了各种共表达时可溶表达产物的生物活性 .结果显示 ,只有共表达DsbC时才能检测到明显的C6 展开更多

关键词 共表达 TrxA DSBC 异源蛋白 大肠杆菌 硫氧还蛋白 二硫键异构酶 低分子量尿激酶

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