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低温β-1,4-内切葡聚糖酶的基因挖掘、异源表达及其酶学性质表征
1
作者 圣弟青 钮成拓 +4 位作者 闫亚楠 郑飞云 刘春凤 王金晶 李崎 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期17-24,共8页
β-1,4-内切葡聚糖酶在洗涤行业有着广泛的应用价值,其中具有较好的低温和碱性耐受能力是其实现工业应用的重要前提。该论文通过基因挖掘获得一株具有低温耐受能力的Deinococcus cellulosilyticus来源新型β-1,4-内切葡聚糖酶基因EgDC,... β-1,4-内切葡聚糖酶在洗涤行业有着广泛的应用价值,其中具有较好的低温和碱性耐受能力是其实现工业应用的重要前提。该论文通过基因挖掘获得一株具有低温耐受能力的Deinococcus cellulosilyticus来源新型β-1,4-内切葡聚糖酶基因EgDC,并将其在大肠杆菌中实现了可溶性表达,其中大部分存在于周质空间,少部分分泌至胞外。对EgDC酶的酶学性质进行了表征,发现该酶的最适温度和最适pH值分别为40℃和pH 6.5,其在20℃能保持70%以上活力,且在pH 8.0和pH 9.0的半衰期分别达到83.43 min和53.79 min。EgDC酶具有较好的催化性质,其比酶活力k_(cat)/K_(m)值分别为(26.38±1.43)U/mg和(520.03±17.07)s^(-1)/mg,且对于金属离子以及表面活性剂均具有较强耐受能力。由此可见,新型β-1,4-内切葡聚糖酶EgDC具有较好的催化能力,且在低温、碱性以及存在表面活性剂环境下较为稳定,因此具有潜在的工业应用价值。 展开更多
关键词 基因挖掘 β-1 4-内切葡聚糖酶 异源表达 酶学性质 低温 耐碱性
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生孢噬纤维菌内切葡聚糖酶的异源表达及CBM6对其酶学性质的影响
2
作者 盛钧美 荆晓凤 +2 位作者 王继伟 陈晓艺 李宪臻 《大连工业大学学报》 CAS 2024年第1期8-15,共8页
内切葡聚糖酶是纤维素酶系的重要组分之一,但大部分内切葡聚糖酶酸碱耐受性较差。为挖掘新型内切葡聚糖酶,本研究从生孢噬纤维菌CX11基因组中克隆了一个内切葡聚糖酶基因Sm_1350。该基因大小为2 196 bp,编码732个氨基酸,编码蛋白包含一... 内切葡聚糖酶是纤维素酶系的重要组分之一,但大部分内切葡聚糖酶酸碱耐受性较差。为挖掘新型内切葡聚糖酶,本研究从生孢噬纤维菌CX11基因组中克隆了一个内切葡聚糖酶基因Sm_1350。该基因大小为2 196 bp,编码732个氨基酸,编码蛋白包含一个分泌信号肽、GH5催化结构域、6家族碳水化合物结合模块(CBM6)和一个C末端结构域(CTD)。利用实时荧光定量PCR技术对Sm_1350在不同碳源条件下的相对表达水平进行了分析,结果表明,Sm_1350在纤维二糖和滤纸培养基中的表达水平均显著高于在葡萄糖培养基中的表达水平,推测其在CX11降解纤维素过程中发挥一定作用。本研究构建了Sm_1350及其3种截短突变体,分别为Sm_1350、Sm_1350-GH5-CBM6、Sm_1350-GH5和Sm_1350-CBM6,并在大肠杆菌中进行异源表达。结果表明,去除CTD结构域明显提高了目的蛋白的可溶性表达水平。以CMC为底物时,Sm_1350-GH5-CBM6与Sm_1350-GH5酶活力分别为(7 000.00±50.00)U/g和(2 542.73±35.03)U/g,表明去除CBM6降低了Sm_1350-GH5对可溶性多糖的水解能力。酶学性质分析结果显示,Sm_1350-GH5-CBM6与Sm_1350-GH5均有较好的pH稳定性,去除CBM6结构域只改变了Sm_1350-GH5的最适温度,对最适pH以及温度稳定性没有产生影响。此外,Sm_1350-CBM6具有较强的几丁质结合能力,在蛋白纯化方面具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 内切葡聚糖酶 生孢噬纤维菌 CBM6结构域 酶学性质
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一株内切葡聚糖酶产生菌株的分离鉴定及其产酶条件优化
3
作者 赵思卡 许倍滔 +3 位作者 冯喆 王力 张建国 李晓华 《中南民族大学学报（自然科学版）》 CAS 2024年第1期24-31,共8页
从湖南省长沙县养殖场牛胃秸秆发酵物中分离获得了一株高产内切葡聚糖酶的菌株,命名为SCUEC7.通过菌落形态、生理生化特性及16S rDNA序列分析,鉴定SCUEC7菌株为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis).当培养时间为12 h、pH值为6.0、培养温度... 从湖南省长沙县养殖场牛胃秸秆发酵物中分离获得了一株高产内切葡聚糖酶的菌株,命名为SCUEC7.通过菌落形态、生理生化特性及16S rDNA序列分析,鉴定SCUEC7菌株为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis).当培养时间为12 h、pH值为6.0、培养温度为37°C、碳源为20.0 g·L^(-1)麦芽糖、氮源为15.0 g·L^(-1)胰蛋白胨、金属离子为1.5 g·L^(-1)的Mn^(2+)的条件下,枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株菌体生长量和内切葡聚糖酶活性均较高.在单因素实验的基础上,响应面法分析显示:培养11.9 h,初始pH值为5.9,麦芽糖含量为19.8 g·L^(-1)时,预测最高酶活力为409.0 U·mL^(-1),内切葡聚糖酶的酶活力实测值与预测值之间有较高的拟合度.SCUEC7菌株产生内切葡聚糖酶活性较高,为其秸秆饲料中的应用奠定基础. 展开更多
关键词 枯草芽胞杆菌SCUEC7菌株 内切葡聚糖酶 产酶条件优化 响应面法优化
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牛瘤胃内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达
4
作者 马春娟 杨宇泽 +4 位作者 邹爱爱 孙康永杰 万雪瑞 王川 魏亚琴 《草业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1039-1047,共9页
为提高纤维素的降解效率、构建高效表达的纤维素酶基因工程菌,本研究以牛瘤胃液微生物全基因组为模板,首先通过PCR扩增内切葡聚糖酶eg基因,然后与pET-28a连接获得表达载体pET-28a::eg并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)中... 为提高纤维素的降解效率、构建高效表达的纤维素酶基因工程菌,本研究以牛瘤胃液微生物全基因组为模板,首先通过PCR扩增内切葡聚糖酶eg基因,然后与pET-28a连接获得表达载体pET-28a::eg并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达EG蛋白,最后用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定重组内切酶的酶活力,分析其酶学性质。结果表明:成功构建表达载体pET-28a::eg,重组菌株E.coli BL21/pET-28a::eg在28℃用IPTG诱导14 h后纯化得到重组的EG蛋白,EG蛋白大小约为50 kDa,刚果红染色有明显水解圈。用DNS法测得EG的酶活为12.60 U·mL^(−1),滤纸总酶活为3.53 U·mL^(−1)。重组酶在不同底物的反应中,羧甲基纤维素钠为底物的酶活力最高,脱脂棉最低。重组酶的最适温度为40℃,最适pH为7.0。在此条件下,Ca^(2+)、Mg^(2+)、Fe^(2+)、K^(+)、Mn^(2+)等离子均可对重组蛋白EG的酶活力具有促进作用,Zn^(2+)可促进但差异不显著,而Hg^(2+)、Cu^(2+)对EG的酶活力具有抑制作用。本研究构建的重组内切酶菌株可以高效水解纤维素,为内切酶的工业应用奠定了基础。 展开更多
关键词 内切葡聚糖酶 eg基因 大肠杆菌 克隆 蛋白表达 酶活 酶学性质
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1株耐酸秸秆纤维素降解菌株的筛选、鉴定及其内切葡聚糖酶的异源表达研究
5
作者 张超 李晓意 +5 位作者 杨吉 武晓乐 张洋 李孟欣 刘宇欣 李凯悦 《饲料研究》 CAS 北大核心 2023年第2期89-93,共5页
试验旨在解决农作物秸秆饲料化过程中,秸秆纤维素难降解、适口性差和营养价值低等问题。试验以玉米秸秆粉为唯一碳源,从堆砌秸秆的土壤中分离筛选出1株耐酸且具有高纤维素酶活性的菌株HSU-20SJ。经3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活性,... 试验旨在解决农作物秸秆饲料化过程中,秸秆纤维素难降解、适口性差和营养价值低等问题。试验以玉米秸秆粉为唯一碳源,从堆砌秸秆的土壤中分离筛选出1株耐酸且具有高纤维素酶活性的菌株HSU-20SJ。经3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活性,利用形态学、生理生化和16S rDNA进行种属鉴定,通过分子克隆技术,构建内切葡聚糖酶的大肠杆菌异源表达系统。结果显示,菌株HSU-20SJ粗酶液酶活为3.23 U/mL,最适反应pH值为5.0。该菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),从菌株HSU-20SJ基因组中获得内切葡聚糖酶基因eg20SJ,异源表达后获得重组酶,分子量约为55 kDa,粗酶液酶活为6.28 U/mL。研究表明,试验在获得耐酸、高纤维素酶活菌株基础上,实现了内切葡聚糖酶基因的异源表达,可为纤维素酶的规模化生产和应用提供参考。 展开更多
关键词 秸秆 纤维素 降解 内切葡聚糖酶 异源表达
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瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅲ基因的克隆及在酿酒酵母中的表达 被引量：29
6
作者 肖志壮 王婷 +2 位作者 汪天虹 曲音波 高培基 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期391-396,共6页
采用刚果红染色法从瑞氏木霉cDNA文库中分离到一株具有CMCase活性的阳性克隆 ,测序结果显示该基因所编码的蛋白质为瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅲ (EGⅢ )。对重组酿酒酵母所产生的EGⅢ进行了酶学性质分析 ,其最适pH为 5 0 ,最适温度为 60℃... 采用刚果红染色法从瑞氏木霉cDNA文库中分离到一株具有CMCase活性的阳性克隆 ,测序结果显示该基因所编码的蛋白质为瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅲ (EGⅢ )。对重组酿酒酵母所产生的EGⅢ进行了酶学性质分析 ,其最适pH为 5 0 ,最适温度为 60℃。检测了酿酒酵母蛋白质分泌系统组分SSO2和SEB1对EGⅢ分泌的影响。结果表明 ,在可过量表达蛋白质分泌系统组分SSO2的酿酒酵母H837中 ,EGⅢ的分泌量最高。由此分析 ,酿酒酵母SSO2蛋白可能在EGⅢ的分泌中 ,是一个限速步骤。通过PCR方法删除EGⅢ基因 5′端非翻译区的 98bp核苷酸序列使EGⅢ表达量提高了 5 3倍。这提示我们 ,瑞氏木霉的EGⅢ基因在酿酒酵母细胞中表达时 ,其mRNA 5′端先导序列中可能存在影响该基因表达水平的调控序列。 展开更多
关键词 内切葡聚糖酶Ⅲ 瑞氏木霉 酿酒酵母 基因表达 蛋白质分泌
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内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达及其酶学性质研究 被引量：17
7
作者 陈惠 胥兵 +2 位作者 廖俊华 官兴颖 吴琦 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期649-654,共6页
通过PCR方法将已克隆的内切葡聚糖酶基因(GenBank No.DQ782954)信号肽编码序列去除,然后与表达载体pHIS1525连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性转化子DH5α-pHIS1525-G7并提取质粒进一步转化巨大芽孢杆菌WH320原生质体,获得基因工程菌W... 通过PCR方法将已克隆的内切葡聚糖酶基因(GenBank No.DQ782954)信号肽编码序列去除,然后与表达载体pHIS1525连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出阳性转化子DH5α-pHIS1525-G7并提取质粒进一步转化巨大芽孢杆菌WH320原生质体,获得基因工程菌WH320-pHIS1525-G7。刚果红染色和SDS-PAGE分析表明该基因在巨大芽孢杆菌中得到了有效表达。基因工程菌经优化培养后,胞外上清液中的酶活力可达889U,是出发菌株(即枯草芽孢杆菌C-36)的11.22倍。酶学性质研究表明:该酶的最适反应温度与pH值分别为65℃与pH6.0,在pH4.5～10.0范围内50℃保温30min可保持在最高酶活的80%以上。 展开更多
关键词 巨大芽孢杆菌 内切葡聚糖酶 基因表达 酶学性质
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色氨酸残基在内切葡聚糖酶分子中的作用 被引量：22
8
作者 阎伯旭 曲音波 +1 位作者 高培基 孙迎庆 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第2期181-185,共5页
内切葡聚糖酶的化学修饰研究表明：色氨酸残基可能位于活性位点，与底物结合有关．荧光光谱测定指出该酶的荧光几乎都来自色氨酸残基，酶分子中色氨酸微环境对ｐＨ变化非常敏感，降低ｐＨ导致了酶分子构象发生了较大变化，配基结合使酶... 内切葡聚糖酶的化学修饰研究表明：色氨酸残基可能位于活性位点，与底物结合有关．荧光光谱测定指出该酶的荧光几乎都来自色氨酸残基，酶分子中色氨酸微环境对ｐＨ变化非常敏感，降低ｐＨ导致了酶分子构象发生了较大变化，配基结合使酶分子色氨酸微环境产生了改变，引发了与ｐＨ诱导不同的构象变化． 展开更多
关键词 纤维素酶 内切葡聚糖酶 色氨酸 荧光
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枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因的克隆及其在大肠杆菌中融合表达 被引量：10
9
作者 官兴颖 吴振芳 +2 位作者 吴琦 胥兵 陈惠 《生物加工过程》 CAS CSCD 2009年第3期68-72,共5页
以自行分离筛选出的天然枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）C-36的染色体DNA为模板，PCR扩增得到含有内切葡聚糖酶基因的DNA片段，将其克隆到pMD-18T载体中，序列分析表明，克隆得到的DNA片段全长1602bp，编码一个含有499个氨基酸的多... 以自行分离筛选出的天然枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）C-36的染色体DNA为模板，PCR扩增得到含有内切葡聚糖酶基因的DNA片段，将其克隆到pMD-18T载体中，序列分析表明，克隆得到的DNA片段全长1602bp，编码一个含有499个氨基酸的多肽。与其他芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因序列比对，其核苷酸同源率为90％～93％，其编码的氨基酸序列的同源性在90％～98％，已将此基因注册GenBank（DQ782954）。将含内切葡聚糖酶基因的重组克隆质粒进行亚克隆，用Kpn I和EcoR I双酶切后，与相同酶切的表达载体pET-32a相连接，并导入大肠杆菌BL21中表达。蛋白质电泳实验结果表明在6．47×10^4处有表达蛋白带。经测定表达蛋白比酶活力达99．02U／mL，为出发菌C-36（63．78U／mL）的1．55倍。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 克隆 内切葡聚糖酶基因 表达 序列
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爪哇根结线虫-β1,4-内切葡聚糖酶基因cDNA全长克隆和序列分析 被引量：8
10
作者 张志荣 廖金铃 +5 位作者 崔汝强 卓侃 李迅东 郑静君 陈海燕 王鲜 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期517-522,共6页
以爪哇根结线虫为材料,根据同源序列法分别进行3′末端和5′末端的RACE,获得-β1,4-内切葡聚糖酶基因cDNA全长。此cDNA全长序列为1 675 bp,包括1 521 bp的完整ORF,编码一含506 aa的多肽。该基因命名为M j-eng3-,其推导蛋白的编码氨基酸... 以爪哇根结线虫为材料,根据同源序列法分别进行3′末端和5′末端的RACE,获得-β1,4-内切葡聚糖酶基因cDNA全长。此cDNA全长序列为1 675 bp,包括1 521 bp的完整ORF,编码一含506 aa的多肽。该基因命名为M j-eng3-,其推导蛋白的编码氨基酸与南方根结线虫的-β1,4-内切葡聚糖酶基因M I-ENG-1、M I-ENG-3和M I-ENG-4的同源性为95.3%、95.8%和85.3%,与另外5个植物寄生线虫β-1,4-内切葡聚糖酶基因推导蛋白PP-ENG-1、GR-ENG-1、GT-ENG-1、HG-ENG-1、HS-ENG-1编码氨基酸的同源性分别为51.2%、43.7%、43.7%、46.8%和45.3%。 展开更多
关键词 爪哇根结线虫 Β-1 4-内切葡聚糖酶 RT—PCR RACE
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易错PCR技术提高中性内切葡聚糖酶活性 被引量：6
11
作者 唐自钟 刘姗 +6 位作者 韩学易 姚友旭 刘默洋 陈惠 晋海军 吴琦 单志 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期754-761,共8页
近年来随着纤维素酶在食品加工工业中具有广阔应用前景,而纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制。为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,作者利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）C-36的内切葡聚糖酶基因进行... 近年来随着纤维素酶在食品加工工业中具有广阔应用前景,而纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制。为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,作者利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究,构建了在大肠杆菌中的突变体库。通过刚果红平板筛选,获得了酶活性提高的突变株F-10,活力比亲本酶提高4.2倍。序列分析表明：F-10有5个碱基发生突变,两个氨基酸突变：D212V和T307S。SDSPAGE条带,表明基因表达正确,而表达量较原始菌株显著增加。酶学性质分析,表明该酶的最适反应pH为5.6,最适反应温度为45℃,在pH 4.5~10.0范围内50℃保温30 min可保持80%的剩余酶活,在60~75℃酶活力相对稳定,可保持在最高酶活的80%以上,当温度高于75℃时,酶开始变性失活,酶活力迅速下降。研究获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料。 展开更多
关键词 枯草芽胞杆菌 内切葡聚糖酶 易错PCR 酶学性质
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内切葡聚糖酶基因在黑曲霉中的同源表达 被引量：5
12
作者 李杰 高博 +4 位作者 江连洲 刘君 邓晨旭 陈璐璐 张会 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期56-61,共6页
内切葡聚糖酶作用于纤维素的非结晶区,随机水解β-1,4-糖苷键,将长链的纤维素截断,对纤维素的整体降解起重要作用。研究从黑曲霉CICC2462中扩增得到内切葡聚糖酶基因Eng1,并针对黑曲霉中高表达的糖化酶基因glaA位点,构建Eng1基因表达载... 内切葡聚糖酶作用于纤维素的非结晶区,随机水解β-1,4-糖苷键,将长链的纤维素截断,对纤维素的整体降解起重要作用。研究从黑曲霉CICC2462中扩增得到内切葡聚糖酶基因Eng1,并针对黑曲霉中高表达的糖化酶基因glaA位点,构建Eng1基因表达载体pSZHG-Eng1,进一步通过农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得2株在glaA基因位点发生基因置换的同源重组转化子。在摇瓶发酵条件下,发酵液上清中的内切葡聚糖酶活力最高可达到272 U·mL-1,是出发菌株5.2倍。SDS-PAGE分析显示,两株重组菌株都有约36 ku目的蛋白条带,表达量为165~193μg·mL-1。结果表明,研究实现内切葡聚糖酶在黑曲霉中的同源表达,可为食品级内切葡聚糖酶的大规模工业化生产奠定基础。 展开更多
关键词 内切葡聚糖酶 黑曲霉 同源重组 表达
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康氏木霉内切葡聚糖酶(EGⅠ)基因的克隆及表达 被引量：10
13
作者 黄艳 凌敏 +1 位作者 覃拥灵 梁智群 《生物技术》 CAS CSCD 2008年第2期10-13,共4页
目的:构建纤维素酶EGⅠ原核表达载体,并对表达产物进行初步酶学性质研究。方法:以康氏木霉的总RNA为模板,利用RT-PCR扩增内切葡聚糖酶EGⅠ,重组到T7启动子控制下的质粒pET.His中,构建重组质粒pET.His-EGⅠ,并将其转化至E.coli BL21(DE3)... 目的:构建纤维素酶EGⅠ原核表达载体,并对表达产物进行初步酶学性质研究。方法:以康氏木霉的总RNA为模板,利用RT-PCR扩增内切葡聚糖酶EGⅠ,重组到T7启动子控制下的质粒pET.His中,构建重组质粒pET.His-EGⅠ,并将其转化至E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞中,经0.4mmol/L的IPTG诱导表达后对其表达产物进行13%SDS-PAGE分析。结果:SDS-PAGE电泳显示EGⅠ在大肠杆菌中得到了与预期目的蛋白相一致的外源蛋白带,分子量约45kDa。初步研究表明:重组蛋白具有内切葡聚糖酶活性,最适pH为6.0,温度在30℃～40℃时酶活稳定,金属离子Mn2+对酶活力有明显的促进作用。结论:纤维素酶EGⅠ在大肠杆菌中成功表达,具有一定活性。 展开更多
关键词 康氏木霉 内切葡聚糖酶 RT-PCR 克隆 原核表达
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定点突变技术提高内切葡聚糖酶基因F-10酶活性 被引量：4
14
作者 唐自钟 刘默洋 +4 位作者 李雨霏 孙蓉 刘姗 陈惠 韩学易 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第8期870-876,共7页
利用高酶活F-10突变株内切葡聚糖酶基因进行定点突变,对91位(K91E)和369位(K369R)氨基酸进行突变,构建突变质粒(K91E);(K369R)和(K91E/K369R),转化大肠杆菌BL21,经筛选获得突变内切葡聚糖酶基因工程菌株K91E,K369R和K91E/K369R。经IPTG... 利用高酶活F-10突变株内切葡聚糖酶基因进行定点突变,对91位(K91E)和369位(K369R)氨基酸进行突变,构建突变质粒(K91E);(K369R)和(K91E/K369R),转化大肠杆菌BL21,经筛选获得突变内切葡聚糖酶基因工程菌株K91E,K369R和K91E/K369R。经IPTG诱导后,分离纯化酶学性质分析。结果表明:蛋白质相对分子质量为53 000;突变前后最适pH值未发生变化,为pH 6.8;突变体K369R和K91E/K369R的最适温度为50℃,而突变体K91E最适温度发生了很大的变化,为40℃;酶的比活力分别为202、162.8、77.9 U/mg,分别是原始酶(66U/mg)的3.0倍,2.4倍和1.2倍;三个突变酶的热稳定性有较大提高,70℃处理1 h后,原始酶的活性急剧下降,剩余活力为12%,而K91E的剩余活力为36%,K369R剩余活力为30%,K91E/K369R剩余活力为41%。当经80℃处理1 h后,K91E残余活力仍有22%。本研究获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能及应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料。 展开更多
关键词 内切葡聚糖酶 定点突变 分离纯化 热稳定性 酶学性质 结构分析
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匍枝根霉TP-02内切葡聚糖酶基因eg2的克隆表达及功能分析 被引量：8
15
作者 汤斌 张莹莹 杨亚平 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期13-17,共5页
从匍枝根霉TP-02的cDNA文库中克隆得到内切葡聚糖酶基因eg2,在大肠杆菌BL21中成功表达,通过对其结构功能进行初步分析,并对EGⅡ的纤维素结合模块CBM1及催化结构域GH45区进行突变研究。结构分析表明:N39S可影响CBM1亲水平面的形成,V136D... 从匍枝根霉TP-02的cDNA文库中克隆得到内切葡聚糖酶基因eg2,在大肠杆菌BL21中成功表达,通过对其结构功能进行初步分析,并对EGⅡ的纤维素结合模块CBM1及催化结构域GH45区进行突变研究。结构分析表明:N39S可影响CBM1亲水平面的形成,V136D及E260D对GH45活性中心的改变较大。突变株的发酵特性显示,N39S可缩短达到峰值的时间,V136D及E260D可显著提高酶活。其中,突变株EGⅡ-F在发酵21 h后,酶活达到最高为1.321 IU/mL,比突变前提高了82.7%。 展开更多
关键词 匍枝根霉 内切葡聚糖酶 突变 功能分析
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海栖热袍菌内切葡聚糖酶Cel12B与木聚糖酶XynA CBD结构域融合基因的构建、表达及融合酶性质分析 被引量：20
16
作者 李相前 邵蔚蓝 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期726-729,共4页
海栖热袍菌内切葡聚糖酶Cel12B是极耐热胞外酶，氨基酸序列分析表明不含有纤维素结合结构域（CBD），对结晶纤维素无活性，但同样菌种来源的木聚糖酶XynA有催化结构域和纤维素结合结构城。用同样极耐热酶CBD区域和Cel12B融合构建重组质... 海栖热袍菌内切葡聚糖酶Cel12B是极耐热胞外酶，氨基酸序列分析表明不含有纤维素结合结构域（CBD），对结晶纤维素无活性，但同样菌种来源的木聚糖酶XynA有催化结构域和纤维素结合结构城。用同样极耐热酶CBD区域和Cel12B融合构建重组质粒pET-20b—Cel12B—CBD，经诱导表达后，对结晶纤维素有活性，酶学特性研究表明：最适反应温度为100℃、最适pH为5．8、在pH4．5—7．0时酶活力稳定，90℃保温2h仍有87％的酶活。 展开更多
关键词 海栖热袍菌 纤维素结合域 内切葡聚糖酶 基因融合
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交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DY3菌株产内切葡聚糖酶的性质研究及基因克隆 被引量：15
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作者 熊鹏钧 文建军 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期233-237,共5页
从深海样品ES0 10 9中分离到一株具有高内切葡聚糖酶活力的细菌DY3 ,16SrDNA序列分析表明该菌与交替假单胞菌属 (Pseudoalteromonassp .)的Pseudoalteromonascitrea和Pseudoalteromonaselyakovii的同源性为 99%。PCR扩增DY3的内切葡聚... 从深海样品ES0 10 9中分离到一株具有高内切葡聚糖酶活力的细菌DY3 ,16SrDNA序列分析表明该菌与交替假单胞菌属 (Pseudoalteromonassp .)的Pseudoalteromonascitrea和Pseudoalteromonaselyakovii的同源性为 99%。PCR扩增DY3的内切葡聚糖酶基因celX全长 14 79bp ,编码一个 492AA的蛋白质。酶的氨基酸序列分析表明CelX与Pseudoalteromonashaloplanktis的内切葡聚糖酶CelG有 95%的相似性 ,包括一个糖基水解酶家族 5的催化结构域 ,一个连接序列和位于C端的的CBM5结构域。对酶性质的初步研究发现 ,CelX的最适温度为 40℃ ,酶的最适pH在 6～ 展开更多
关键词 交替假单胞菌 DY3菌株 16SrDNA序列分析 内切葡聚糖酶 基因 纤维素酶 克隆
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内生芽孢杆菌BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因与定殖相关性 被引量：6
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作者 范晓静 杨瑞先 +1 位作者 邱思鑫 胡方平 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期262-272,共11页
【目的】克隆植物内生解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因(β-1,4-endoglucanase gene,eglS),探明BS2中该基因与定殖的相关性。【方法】以枯草芽孢杆菌BS168基因组为模板扩增组成型启动子rpsD。... 【目的】克隆植物内生解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BS2的β-1,4-内切葡聚糖酶基因(β-1,4-endoglucanase gene,eglS),探明BS2中该基因与定殖的相关性。【方法】以枯草芽孢杆菌BS168基因组为模板扩增组成型启动子rpsD。依据芽孢杆菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因的同源序列设计1对引物,以BS2基因组为模板扩增eglS。将rpsD启动子基因和eglS片段用T4连接酶连接,并对连接产物进行PCR扩增,得到eglS表达盒片段。将表达盒片段插入穿梭载体pGFP4412用以构建eglS过表达质粒。设计引物扩增eglS的同源重组片段,与具有单交换功能的整合载体pMUTIN-GFP+连接构建敲除质粒。eglS的过表达质粒和敲除质粒转化芽孢杆菌感受态细胞分别获得过表达突变体和敲除突变体。将过表达质粒转化敲除突变体感受态细胞获得互补突变体。采用荧光显微镜观察、PCR、平板酶活力检测及实时荧光定量PCR方法鉴定突变体。3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定突变体和野生菌的β-1,4-内切葡聚糖酶活力,同时采用定量灌根接种法检测不同菌株30 d内在小白菜各组织中的定殖数量。【结果】获得在荧光显微镜下呈现绿色荧光的过表达突变体和互补突变体。PCR检测结果表明敲除突变体中能够扩增出675 bp的目的条带,而以野生菌株和整合载体DNA为模板扩增时没有对应条带,成功得到敲除突变体。野生菌及各突变体β-1,4-内切葡聚糖酶平板活力检测结果显示,野生菌BS2只有一个水解圈且透明,过表达突变体与互补突变体有大于野生菌的双水解圈,内圈的水解圈透明,外圈的水解圈不透明。敲除突变体沿菌体边缘也有一个小水解圈。实时荧光定量PCR的分析结果证实野生菌及突变体间β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量存在差异,过表达突变体和互补突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量增高,分别是野生菌的111和82倍;敲除突变体中β-1,4-内切葡聚糖酶基因的表达量相对于野生菌BS2几乎为0。突变体与野生菌在小白菜体内定殖数量以及酶活力检测结果表明,在相同的小白菜组织以及相同的分离时间内,敲除突变体的定殖数量最少,其在根茎叶中的定殖数量与其他菌株相比均有显著性差异(P<0.05)。敲除突变体的酶活力也显著低于其他菌株(P<0.05)。过表达突变体的酶活力以及在小白菜体内的定殖数量在P<0.05水平上显著高于敲除突变体和野生菌,互补突变体的酶活力和在小白菜体内的定殖数量与过表达突变体基本一致。【结论】内生芽孢杆菌BS2菌株β-1,4-内切葡聚糖酶的活力高低与其在小白菜体内的定殖数量之间呈正相关关系,其表达的β-1,4-内切葡聚糖酶在定殖过程中发挥一定作用。 展开更多
关键词 内生芽孢杆菌BS2 Β-1 4-内切葡聚糖酶 过表达 基因敲除 定殖
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适冷海洋细菌交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)MB-1内切葡聚糖酶基因的克隆和表达 被引量：15
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作者 游银伟 汪天虹 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期142-144,共3页
从黄海深海海底淤泥中筛选出一株产纤维素酶的适冷革兰氏阴性杆菌MB 1,克隆和分析了MB 1的 16SrDNA序列 (GenBank接受号 :AY5 5 132 1) ,经鉴定为交替假单胞菌 (Pseudoalteromonas) ,命名为Pseudoalteromonassp .MB 1。克隆了该菌适冷... 从黄海深海海底淤泥中筛选出一株产纤维素酶的适冷革兰氏阴性杆菌MB 1,克隆和分析了MB 1的 16SrDNA序列 (GenBank接受号 :AY5 5 132 1) ,经鉴定为交替假单胞菌 (Pseudoalteromonas) ,命名为Pseudoalteromonassp .MB 1。克隆了该菌适冷内切葡聚糖酶基因celA(GenBank接受号 :AY5 5 132 2 ) ,并在大肠杆菌 (Escherichiacoli)BL2 1中进行了表达。重组E .coli菌体破碎后 ,获取上清液 ,其中融合蛋白GST CelA浓度约为 78 5mg L。分析了融合酶GST CelA的性质 ,其最适反应温度为 35℃ ,最适反应pH值为 7 2 ,为中性适冷酶。 展开更多
关键词 海洋适冷酶 交替假单胞菌 内切葡聚糖酶 融合蛋白表达
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香蕉穿孔线虫β-1，4-内切葡聚糖酶基因的克隆与特征分析 被引量：3
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作者 肖罗 陈国华 +3 位作者 戴良英 吕春花 杨宇红 谢丙炎 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期1431-1440,共10页
植物寄生线虫的分泌物在线虫的侵染过程中具有重要的作用,其中纤维素水解酶是研究较多的主要分泌物之一。采用RT-PCR和RACE方法,从香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)中获得编码β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA序列,命名为RS-eng-1(GenBan... 植物寄生线虫的分泌物在线虫的侵染过程中具有重要的作用,其中纤维素水解酶是研究较多的主要分泌物之一。采用RT-PCR和RACE方法,从香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)中获得编码β-1,4-内切葡聚糖酶基因的cDNA序列,命名为RS-eng-1(GenBank登录号为EU414839)。该cDNA序列全长1630bp,包含一个1404bp的开放阅读框(ORF),编码含467个氨基酸的蛋白,理论分子量与等电点分别为48.22kD和6.04。序列分析表明该酶含有糖基水解酶家族5(GHF5)的保守结构域,N端具有22个氨基酸残基组成的信号肽,C端含有细菌式样的纤维素结合域(CBDⅡ)。原位杂交结果显示此基因在香蕉穿孔线虫的食道腺部位表达,并且Southern结果显示其为多拷贝基因。cDNA与基因组DNA重叠分析表明,此基因包含6个内含子,切割点符合5′-GT...AG-3′的规律。进化分析表明该酶与细菌Bacillus subtilis和Erwina carotovora分泌的纤维素酶属于同一支,推测其来源于细菌的水平基因转移。 展开更多
关键词 香蕉穿孔线虫 香蕉 Β-1 4-内切葡聚糖酶 GHF5家族 原位杂交
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