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PCR重叠延伸法结合分段克隆技术构建高GC含量基因突变载体 被引量:3
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作者 赵炜 崔红晶 +5 位作者 方炳雄 袁源 刘玢 刘宝华 周中军 刘新光 《海南医学院学报》 CAS 2012年第10期1349-1352,1356,共5页
目的:构建人类KAP-1基因定点突变载体,为研究该基因的功能奠定基础。方法:综合运用PCR重叠延伸法和分段定向克隆技术。结果:DNA测序结果表明定点突变载体构建成功。结论:成功构建高GC含量(局部高达80.50%),全长为2 500bp的人类KAP-1基... 目的:构建人类KAP-1基因定点突变载体,为研究该基因的功能奠定基础。方法:综合运用PCR重叠延伸法和分段定向克隆技术。结果:DNA测序结果表明定点突变载体构建成功。结论:成功构建高GC含量(局部高达80.50%),全长为2 500bp的人类KAP-1基因定点突变载体pCMV6-En-try-KAP-1,为全面深入研究KAP-1基因的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 PCR 高GC含量 重叠延伸 分段克隆
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SARS冠状病毒PUMC_2株全基因组cDNA分段克隆 被引量:1
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作者 樊峥 谈昕煜 +8 位作者 阴彬 邹柯 王婷 沈岩 倪安平 秦川 袁建刚 强伯勤 彭小忠 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期499-503,共5页
目的分段克隆SARS冠状病毒PUMC2株的全基因组cDNA。方法以SARS冠状病毒PUMC2株基因组RNA为模板,用RT-PCR扩增cDNA片段,PCR产物经纯化后,连接入pGEM-T载体中,进行序列测定。结果获得了SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA的分段克隆。结论... 目的分段克隆SARS冠状病毒PUMC2株的全基因组cDNA。方法以SARS冠状病毒PUMC2株基因组RNA为模板,用RT-PCR扩增cDNA片段,PCR产物经纯化后,连接入pGEM-T载体中,进行序列测定。结果获得了SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA的分段克隆。结论SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA分段克隆的获得,为SARS冠状病毒基因功能的研究和全长有感染性cDNA的克隆奠定了基础。 展开更多
关键词 SARS冠状病毒PUMC2株 分段克隆
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色素上皮衍生因子的分段克隆表达对人皮肤鳞状细胞癌细胞增殖的影响
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作者 张志彬 彭胜男 +4 位作者 刘藕根 张颖鹏 李春明 彭亚婷 张淑兰 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2019年第10期1014-1018,共5页
目的有关色素上皮衍生因子(PEDF)短肽对人皮肤鳞状细胞癌细胞增殖的研究鲜有报道。文中旨在获得PEDF蛋白的分段克隆表达,并观察对人皮肤鳞状细胞癌细胞系(SCL-1)细胞增殖的影响。方法采用PCR扩增PEDF1、PEDF2和PEDF3目的基因,将回收的... 目的有关色素上皮衍生因子(PEDF)短肽对人皮肤鳞状细胞癌细胞增殖的研究鲜有报道。文中旨在获得PEDF蛋白的分段克隆表达,并观察对人皮肤鳞状细胞癌细胞系(SCL-1)细胞增殖的影响。方法采用PCR扩增PEDF1、PEDF2和PEDF3目的基因,将回收的片段用NheI/HindⅢ酶切,插入至pET28a(+)载体。连接产物转化入大肠埃希菌BL21并诱导表达,并把融合蛋白的进行分离、纯化。采用CCK-8方法检测24 h、48 h及72 h,不同浓度100、400、800和1000 nmol/L PEDF1、PEDF2和PEDF3肽段对SCL-1细胞增殖影响。结果成功构建PEDF1、PEDF2和PEDF3的原核表达载体,PEDF1、PEDF2和PEDF3融合蛋白,相对分子质量约为18 000、17 000和13 000。24 h时,800 nmol/L、1000 nmol/L浓度PEDF3 SCL-1细胞增殖[(0.61±0.03)、(0.78±0.07)]较0 nmol/L PEDF3(1.00±0.00)明显降低(P<0.05);48 h时,400、800、1000nmol/L浓度PEDF3SCL-1细胞增殖呈现显著抑制,并呈剂量依赖性(P<0.05);72 h时,800、1000 nmol/L浓度PEDF3 SCL-1细胞增殖[(0.53±0.05)、(0.51±0.05)]较400、0 nmol/L[(0.60±0.05)、(1.00±0.00)]显著降低(P<0.05)。结论成功分段克隆表达PEDF融合蛋白,PEDF3抑制了SCL-1细胞增殖,为进一步筛选PEDF活性功能短肽提供了基础。 展开更多
关键词 色素上皮衍生因子 人皮肤鳞状细胞癌 分段克隆 细胞增殖
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人VIGILIN基因分段克隆及表达
4
作者 俞小琴 魏玲 +3 位作者 刘秋英 黄元 赵荣策 覃扬 《四川大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期661-666,共6页
目的探讨人高密度脂蛋白结合蛋白(HDLBP)-VIGILIN蛋白与其他蛋白质相互作用的机制。方法根据VIGILIN基因全长编码区的结构域,将VIGILIN基因全长编码区分为N端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端5段,以pDsred2-N1/VIGILIN为模板分别扩增5个... 目的探讨人高密度脂蛋白结合蛋白(HDLBP)-VIGILIN蛋白与其他蛋白质相互作用的机制。方法根据VIGILIN基因全长编码区的结构域,将VIGILIN基因全长编码区分为N端、KH1-7、KH8-12、KH13-14、C端5段,以pDsred2-N1/VIGILIN为模板分别扩增5个片段及全长cDNA后克隆至pGEX 5X3原核表达载体,测序,然后将鉴定后的重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21中进行诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,并用SDSPAGE电泳及Western blot检测蛋白表达结果。结果成功扩增了人VIGILIN基因编码区分段片段,并且构建到原核表达载体中,经酶切、测序鉴定证实序列完全正确,重组载体构建成功,并且在pGEX原核表达系统中诱导表达GST-VIGILIN融合蛋白,经SDS-PAGE电泳及Western blot检测初步证实表达成功。结论本实验首次根据VIGILIN蛋白不同的结构域成功构建了GST-VIGILIN分段克隆原核表达载体,并且对融合蛋白表达条件进行了优化,成功表达了GST融合蛋白。 展开更多
关键词 VIGILIN基因 结构域 分段克隆 原核表达系统
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抗鸡源EphA2蛋白小鼠多克隆抗体的制备及其特性研究 被引量:1
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作者 姚晓慧 李拓凡 +4 位作者 谢泉 万志敏 邵红霞 秦爱建 叶建强 《中国家禽》 北大核心 2020年第3期29-34,共6页
为深入探究鸡源EphA2生物学功能,试验首先对鸡源EphA2基因进行了原核分段克隆以及真核表达载体构建。重组原核表达载体分别命名为pGEX-6p-1-EphA2-A(1-534aa)和pGEX-6p-1-EphA2-B(585-972aa),真核表达载体命名为pcDNA3.1-EphA2。重组原... 为深入探究鸡源EphA2生物学功能,试验首先对鸡源EphA2基因进行了原核分段克隆以及真核表达载体构建。重组原核表达载体分别命名为pGEX-6p-1-EphA2-A(1-534aa)和pGEX-6p-1-EphA2-B(585-972aa),真核表达载体命名为pcDNA3.1-EphA2。重组原核表达载体转化BL21后经IPTG诱导以及SDS-PAGE分析发现,融合蛋白GST-EphA2-A和GST-EphA2-B均获得有效表达。以纯化的GST-EphA2-A和GST-EphA2-B蛋白免疫小鼠制备了抗鸡EphA2多克隆抗体。间接免疫荧光试验以及Western blot试验表明,所制备的抗鸡EphA2多克隆抗体不仅能识别转染pcDNA3.1-EphA2的DF-1及LMH细胞中表达的外源性EphA2,而且还能有效识别内源性鸡源EphA2蛋白。本研究中鸡EphA2的成功表达及其多克隆抗体研制为后续研究鸡EphA2的功能提供了分子生物学工具。 展开更多
关键词 鸡源EphA2 原核分段克隆表达 真核表达 克隆抗体 反应性
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基于黄河鲤新品系IGF2b基因SNPs获取体系的建立及在该品系选育中的应用 被引量:2
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作者 谢元澄 李欣原 +4 位作者 苏胜彦 梁敬东 徐跑 贺鑫晋 Bouzoualegh Raouf 《中国水产科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第4期686-694,共9页
为了建立鲤 IGF2b (insulin-like growth factor 2)基因全基因组信息 SNPs (single nucleotide polymorphism)的获取体系,并验证该获取体系在黄河鲤新品系选育中运用的适用性,本研究首先对 10个不同鲤品种的 33个鲤个体重测序数据进行分... 为了建立鲤 IGF2b (insulin-like growth factor 2)基因全基因组信息 SNPs (single nucleotide polymorphism)的获取体系,并验证该获取体系在黄河鲤新品系选育中运用的适用性,本研究首先对 10个不同鲤品种的 33个鲤个体重测序数据进行分析,整体上了解 IGF2b 基因的单核苷酸位点及其在基因组上的分布情况。然后在基因组 DNA 水平上分段获取 IGF2b 基因的 SNPs 信息,并以不同的鲤品种验证引物的适用性,最后在黄河鲤新品系中检测其应用。研究结果:获得 8 对聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)引物进行分段克隆的结果,并通过直接测序和限制性片段长度多态性来获取相应的 SNPs。经过直接测序,本文对黄河鲤、建鲤、黄河鲤和建鲤的正反交后代进行 PCR 检测发现条带单一,目地片段正确;结合黄河鲤新品系的体重数据,本文又以 IGF2b3#引物检测到一个与体重明显相关的 SNPs,同时检测到一个与该基因表达量相关的另一个 SNPs。本研究的方法能够在该基因全基因组范围内开展鲤分子育种中 SNPs 的检测,并验证发现黄河鲤新品系 IGF2b3#引物 227 号位点处,出现的突变位点使体重降低,且有一处 SNPs 与其表达量有关。这将为其他物种、其他功能基因的多态性分子标记研究提供思路。 展开更多
关键词 黄河鲤 品系选育 IGF2b 分段克隆 SNPS 分子育种
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Cloning and Sequence Analysis of Actin Gene from Rehmannia glutinosa 被引量:6
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作者 孙鹏 郭玉海 +2 位作者 祁建军 周莉丽 李先恩 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2008年第2期42-44,66,共4页
[ Objective ] The aim of this study is to clone and analyze the actin gene from Rehmannia glutinosa. [ Method ] Degenerate primers were designed according to the conserved regions of actin sequences of Rehmannia gluti... [ Objective ] The aim of this study is to clone and analyze the actin gene from Rehmannia glutinosa. [ Method ] Degenerate primers were designed according to the conserved regions of actin sequences of Rehmannia glutinosa and its similar species, RT-PCR was next conducted to amplify the actin gene from Rehmannia glutinosa. [ Result] The amplified fragment is 724 bp and correspondingly 240 amino acids. The BLAST results indicate that the homology between the amplified fragment and other higher plants for aetin gene sequences and amino acid are more than 80% and 90%, respectively, suggesting that the amplified fragment is the actin gene of Rehmannia glutinosa. [ Conclusion] Phylogenetic analysis shows that the actin gene of Rehmannia glutinosa has an intimate genetic relationship with actin7 gene of Nicotiana tabacum. 展开更多
关键词 ACTIN Rehmannia glutinosa Sequence analysis Phylogenetic analysis
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Cloning and Sequencing of Two Acetylcholinesterase cDNA Fragments from Cotton Aphid,Aphis gossypii Glover 被引量:1
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作者 李飞 韩召军 《Zoological Research》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期444-448,共5页
Two acetylcholinesterase (AChE) genes cDNA fragments,Ag.acel and Ag.ace2,have been cloned from cotton aphid,Aphis gossypii Glover using degenerate primers with RT-PCR technique.Ag.acel gene cDNA fragment is of 282?bp ... Two acetylcholinesterase (AChE) genes cDNA fragments,Ag.acel and Ag.ace2,have been cloned from cotton aphid,Aphis gossypii Glover using degenerate primers with RT-PCR technique.Ag.acel gene cDNA fragment is of 282?bp encoding 94 amino acids,and Ag.ace2 gene cDNA fragment is of 264?bp encoding 88 amino acids.Both two putative AChE genes cDNA fragments share numerous similarities with those cloned from other insects.This is the first report of two AChE cDNA fragment sequences in the insect species,which provided the direct evidence of multiple AChE existence in insects. 展开更多
关键词 Aphis gossypii Glover ACETYLCHOLINESTERASE Gene clone cDNA fragment
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酶连接介导PCR法构建酵母PMT3基因缺失菌株 被引量:1
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作者 崔红晶 周涛 +2 位作者 宋浩昌 赵炜 刘新光 《牡丹江医学院学报》 2018年第1期1-3,23,共4页
目的本文运用酶连接介导的PCR法构建酿酒酵母PMT3基因缺失菌株。方法以酿酒酵母基因组DNA为模板,PCR扩增PMT3基因开放阅读框两侧片段,双酶切后,定向克隆于pRS305载体;限制性内切酶MluⅠ线性化基因缺失重组载体(pRS305-pmt3-ko),采用醋... 目的本文运用酶连接介导的PCR法构建酿酒酵母PMT3基因缺失菌株。方法以酿酒酵母基因组DNA为模板,PCR扩增PMT3基因开放阅读框两侧片段,双酶切后,定向克隆于pRS305载体;限制性内切酶MluⅠ线性化基因缺失重组载体(pRS305-pmt3-ko),采用醋酸锂的方法将重组载体转化酵母细胞;经营养缺陷型培养基筛选,PCR法验证阳性克隆酵母菌株。结果基因缺失重组载体测序正确,PMT3基因缺失酵母菌株构建成功。结论利用基因缺失重组载体pRS305-pmt3-ko,成功构建PMT3基因缺失酵母菌株。 展开更多
关键词 PCR 酵母细胞 载体 分段克隆
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Molecular cloning and mRNA expression analysis of myosin heavy chain(MyHC)from fast skeletal muscle of grass carp,Ctenopharyngodon idella 被引量:5
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作者 褚武英 符贵红 +6 位作者 宾石玉 蒙涛 周瑞雪 成嘉 赵发兰 张红芳 张建社 《Chinese Journal of Oceanology and Limnology》 SCIE CAS CSCD 2010年第2期239-247,共9页
The myosin heavy chain(MyHC)is one of the major structural and contracting proteins of muscle.We have isolated the cDNA clone encoding MyHC of the grass carp,Ctenopharyngodon idella. The sequence comprises 5 934 bp,in... The myosin heavy chain(MyHC)is one of the major structural and contracting proteins of muscle.We have isolated the cDNA clone encoding MyHC of the grass carp,Ctenopharyngodon idella. The sequence comprises 5 934 bp,including a 5 814 bp open reading frame encoding an amino acid sequence of 1 937 residues.The deduced amino acid sequence showed 69%homology to rabbit fast skeletal MyHC and 73%–76%homology to the MyHCs from the mandarin fish,walleye pollack,white croaker,chum salmon,and carp.The putative sequences of subfragment-1 and the light meromyosin region showed 61.4%–80%homology to the corresponding regions of other fish MyHCs.The tissue-specific and developmental stage-specific expressions of the MyHC gene were analyzed by quantitative real-time PCR.The MyHC gene showed the highest expression in the muscles compared with the kidney,spleen and intestine.Developmentally,there was a gradual increase in MyHC mRNA expression from the neural formation stage to the tail bud stage.The highest expression was detected in hatching larva.Our work on the MyHC gene from the grass carp has provided useful information for fish molecular biology and fish genomics. 展开更多
关键词 grass carp real-time PCR myosin heavy chain fast skeletal muscle gene expression
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Genetic diversity of populations and clones of Rhopilema esculentum in China based on AFLP analysis 被引量:1
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作者 乔洪金 刘相全 +3 位作者 张锡佳 姜海滨 王际英 张利民 《Chinese Journal of Oceanology and Limnology》 SCIE CAS CSCD 2013年第2期391-397,共7页
Amplified fragment length polymorphisms(AFLP) markers were developed to assess the genetic variation of populations and clones of Rhopilema esculentum Kishinouye(Scyphozoa,Rhizostomatidae).One hundred and seventy-nine... Amplified fragment length polymorphisms(AFLP) markers were developed to assess the genetic variation of populations and clones of Rhopilema esculentum Kishinouye(Scyphozoa,Rhizostomatidae).One hundred and seventy-nine loci from 56 individuals of two hatchery populations and two wild populations were genotyped with five primer combinations.The polymorphic ratio,Shannon's diversity index and average heterozygosity were 70.3%,0.346 and 0.228 for the white hatchery population,74.3%,0.313,and 0.201 for the red hatchery population,79.3%,0.349,and 0.224 for the Jiangsu wild population,and 74.9%,0.328 and 0.210 for the Penglai wild population,respectively.Thus,all populations had a relatively high level of genetic diversity.A specific band was identified that could separate the white from the red hatchery population.There was 84.85% genetic differentiation within populations.Individual cluster analysis using unweighted pair-group method with arithmetic mean(UPGMA) suggested that hatchery populations and wild populations could be divided.For the hatchery populations,the white and red populations clustered separately;however,for the wild populations,Penglai and Jiangsu populations clustered together.The genetic diversity at the clone level was also determined.Our data suggest that there are relatively high genetic diversities within populations but low genetic differentiation between populations,which may be related to the long-term use of germplasm resources from Jiangsu Province for artificial seeding and releasing.These findings will benefit the artificial seeding and conservation of the germplasm resources. 展开更多
关键词 Rhopilema esculentum AFLP genetic diversity population CLONE
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