脉冲磁场与前软骨干细胞向成熟软骨细胞的增殖与分化:与Ihh/PTHrP信号通路活性有关吗? 被引量：10

1

作者 丁然 游洪波 +1 位作者 李锋 孙凯 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2010年第20期3615-3619,共5页

背景:前期研究证实脉冲电磁场对前软骨干细胞增殖具有促进作用,但其作用机制不明确。目的:进一步探讨脉冲电磁场对前软骨干细胞增殖分化的影响,并观察其对前软骨干细胞Ihh/PTHrP信号通路活性的影响。方法:采用免疫磁珠分选法获取并纯化S... 背景:前期研究证实脉冲电磁场对前软骨干细胞增殖具有促进作用,但其作用机制不明确。目的:进一步探讨脉冲电磁场对前软骨干细胞增殖分化的影响,并观察其对前软骨干细胞Ihh/PTHrP信号通路活性的影响。方法:采用免疫磁珠分选法获取并纯化SD大鼠前软骨干细胞,使用频率为50MHz,电场强度为1mT的脉冲电磁场进行干预,0.5h/次,2次/d,干预2,4,6d后收集细胞,以不给予磁场刺激的为空白对照。通过RT-PCR法检测细胞Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的基因表达水平,再通过Western-blot法测定各组细胞印度刺猬蛋白、甲状旁腺激素相关肽蛋白的表达水平。结果与结论:RT-PCR结果显示,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达随磁场刺激时间延长而增高,且经磁场刺激前软骨干细胞的聚集蛋白聚糖明显高于空白对照组(P<0.05,P<0.01)。Western-blot结果显示,印度豪猪蛋白及甲状旁腺激素相关肽蛋白表达均随磁场刺激时间的延长增加,不同时间磁场刺激组印度刺猬蛋白表达高于空白对照组(P<0.01);甲状旁腺激素相关肽的表达量也随之上升,但当磁场刺激4,6d后的甲状旁腺激素相关肽蛋白表达与空白对照组差异有显著性意义(P<0.05,P<0.01)。提示强度为1mT,频率为50MHz的脉冲电磁场能促进前软骨干细胞向成熟软骨细胞增殖分化,其作用机制可能与改变Ihh/PTHrP信号通路活性有关。 展开更多

关键词 前软骨干细胞 种子细胞 ihh-PTHrp信号通路 软骨组织工程 脉冲磁场

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转化生长因子-β不同亚型对前软骨干细胞增殖分化的影响 被引量：6

2

作者 丁然 王庆 蔡贤华 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期659-664,共6页

目的通过观察转化生长因子-β(TGF-β)3种不同亚型(β1、β2和β3)对前软骨干细胞(PSCs)的增殖分化及细胞外基质合成的影响,为构建组织工程学软骨组织寻找理想的细胞因子。方法通过免疫磁珠分选法得到经过筛选和纯化的PSCs细胞,分别用... 目的通过观察转化生长因子-β(TGF-β)3种不同亚型(β1、β2和β3)对前软骨干细胞(PSCs)的增殖分化及细胞外基质合成的影响,为构建组织工程学软骨组织寻找理想的细胞因子。方法通过免疫磁珠分选法得到经过筛选和纯化的PSCs细胞,分别用含有浓度为10ng/mL的3种亚型的重组TGF-β培养液对PSCs进行培养。PSCs培养后第0、3、6、9天,采用MTT法与BrdU/PI双参法测细胞增殖及DNA合成水平,采用RT-PCR法测定ColⅡ、Aggrecan基因的表达。采用免疫组化法测定培养2周后各组细胞SOX9蛋白表达情况。结果培养3d后,TGF-β1组PSCs的增殖活性明显较对照组下降(P<0.05),而TGF-β2、TGF-β3组增殖活性与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。6d后,与对照组相比,TGF-β1组细胞增殖活性明显降低(P<0.05);而TGF-β2、TGF-β3组则显示了相反的结果,增殖活性较对照组明显增强,且TGF-β3组高于TGF-β2组(P<0.05)。DNA合成呈同样趋势。RT-PCR分析显示,随着时间的延长,与对照组相比,TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3组ColⅡ基因表达均呈上升趋势;TGF-β1与TGF-β3组Aggrecan的表达亦较对照组增加,但TGF-β2组Aggrecan的基因表达无明显改变。免疫组化检测结果显示,TGF-β1、TGF-β3组的SOX9蛋白合成高于对照组(P<0.05),而TGF-β2组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TGF-β1能抑制PSCs增殖活性,而TGF-β2和TGF-β3具有促进PSCs增殖的作用,TGF-β1与TGF-β3均能促进PSCs细胞分化,而TGF-β2对于分化的诱导作用不明显。 展开更多

关键词 前软骨干细胞 转化生长因子-Β 增殖 分化

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人转化生长因子β3基因转染KLD-12自组装纳米肽纤维支架三维培养前软骨干细胞 被引量：3

3

作者 丁然 张勇 +2 位作者 游洪波 李锋 孙凯 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2010年第29期5339-5343,共5页

背景:作者前期试验证实了外源性细胞因子人转化生长因子β3具有很强的诱导前软骨干细胞向成熟软骨分化并促进其增殖的能力。国外的研究均证实了在自组装肽纳米纤维支架中三维培养有利于软骨源性干细胞的增殖与分化。目的:将人转化生长... 背景:作者前期试验证实了外源性细胞因子人转化生长因子β3具有很强的诱导前软骨干细胞向成熟软骨分化并促进其增殖的能力。国外的研究均证实了在自组装肽纳米纤维支架中三维培养有利于软骨源性干细胞的增殖与分化。目的:将人转化生长因子β3基因转染于三维培养于KLD-12肽纳米纤维支架内的前软骨干细胞中,并比较其与二维培养前软骨干细胞转染效率的差异。方法:以免疫磁珠分选法获取并纯化前软骨干细胞,将其种植于KLD-12肽纳米纤维支架内,使用xfectTM stem纳米干细胞转染试剂将人转化生长因子β3基因分别转染入KLD-12三维支架内培养的前软骨干细胞和普通二维培养基培养的前软骨干细胞,通过免疫荧光和反转录-聚合酶链反应法测定转染后48h不同组别转化生长因子β3基因的表达情况,并利用酶联免疫吸附法测定转染后不同时间细胞培养上清液中转化生长因子β3的质量浓度。结果与结论:免疫荧光结果显示,KLD-12三维支架内培养的前软骨干细胞转染后转化生长因子β3阳性细胞率明显高于普通二维培养基内前软骨干细胞(P<0.05),与反转录-聚合酶链反应法检测结果相同。酶联免疫吸附法测定结果显示,转染24h前软骨干细胞上清液中转化生长因子β3蛋白水平呈上升趋势,72h后达到峰值,随后稍下降进入平台期。提示人转化生长因子β3基因在三维培养于KLD-12肽纳米纤维支架内前软骨干细胞中的转染效率高于普通二维培养基培养的前软骨干细胞。 展开更多

关键词 前软骨干细胞 转化生长因子Β3 KLD-12肽纳米纤维支架 转染效率 纳米转染试剂

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TGF-β_3诱导大鼠前软骨干细胞向软骨细胞特性方向分化及其在KLD-12自组装肽纳米凝胶中的培养 被引量：2

4

作者 孙凯 游洪波 +4 位作者 陈安民 郭风劲 祁军 徐志刚 丁然 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期1-5,共5页

目的探讨软骨组织工程方法中修复软骨缺损理想的种子细胞和支架材料。方法免疫磁珠分离纯化新生大鼠前软骨干细胞(PSCs),分别采用KLD-12自组装肽纳米凝胶三维培养(实验组)和普通培养瓶平面培养(对照组),用转化生长因子β3(TGFβ-3)诱导... 目的探讨软骨组织工程方法中修复软骨缺损理想的种子细胞和支架材料。方法免疫磁珠分离纯化新生大鼠前软骨干细胞(PSCs),分别采用KLD-12自组装肽纳米凝胶三维培养(实验组)和普通培养瓶平面培养(对照组),用转化生长因子β3(TGFβ-3)诱导两组PSCs向软骨细胞特性方向分化。利用RT-PCR、免疫组化等方法测定其向软骨细胞特性方向分化过程中特异性细胞外基质Ⅱ型胶原(collagenⅡ)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)表达的情况。结果RT-PCR和免疫组化检测结果表明KLD-12自组装肽纳米凝胶组细胞在诱导7、14 d后均有collagenⅡ和aggrecan表达,且RT-PCR检测结果表明KLD-12自组装肽凝胶组细胞的collagenⅡ和aggrecan mRNA表达水平较对照组高,其差异有统计学意义(均P<0.05)。结论TGFβ-3诱导后的PSCs可向成软骨方向分化,诱导后的PSCs与KLD-12自组装肽凝胶复合有望构建组织工程化软骨,KLD-12自组装肽纳米凝胶是较好的软骨组织工程细胞支架。 展开更多

关键词 前软骨干细胞 转化生长因子Β3 细胞外基质 自组装肽纳米凝胶

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hTGF-β3的构建及其在前软骨干细胞的瞬时表达 被引量：2

5

作者 刘铁 游洪波 +2 位作者 陈安民 许永涛 李锋 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期623-626,702,共5页

目的为骺板损伤的基因治疗创造条件,构建人转化生长因子的真核表达载体,并转染大鼠前软骨干细胞(PSCs),以获得组织工程的种子细胞。方法通过基因工程的方法重组构建pcDNA3.1(+)-hTGF-β3真核表达载体并鉴定,免疫磁珠法分离纯化大鼠前软... 目的为骺板损伤的基因治疗创造条件,构建人转化生长因子的真核表达载体,并转染大鼠前软骨干细胞(PSCs),以获得组织工程的种子细胞。方法通过基因工程的方法重组构建pcDNA3.1(+)-hTGF-β3真核表达载体并鉴定,免疫磁珠法分离纯化大鼠前软骨干细胞后,用纳米级的高分子聚合物线性化的聚乙烯亚胺共转染pcDNA3.1(+)-hTGF-β3与pcDNA3.1-EGFP,观察和检测瞬时转染后的表达情况。结果重组质粒经过酶切电泳和测序鉴定证实构建成功,共转染后在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光,RT-PCR和ELISA可以检测到有目的基因的表达。转染后培养液上清中TGF-β3蛋白含量开始上升,在72h达到高峰,以后逐渐下降。结论真核表达载体hTGF-β3的重组质粒构建正确,并成功转染PSCs,为骺板损伤的组织工程学修复提供了新的选择。 展开更多

关键词 转化生长因子Β3 前软骨干细胞 聚乙烯亚胺

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SV40T抗原基因永生化新生大鼠前软骨干细胞株的构建 被引量：2

6

作者 胡伟华 郭风劲 +2 位作者 张树威 陈安民 丁然 《医药导报》 CAS 2007年第5期460-464,共5页

目的建立永生化大鼠前软骨干细胞(PSCs)株,为研究前软骨干细胞的分化机制及临床应用奠定基础。方法用L ipofectam ineTM2000介导基因转染,将含有SV40T抗原基因的真核表达载体pCMVSV40T/PUR导入经免疫磁珠分选出的原代PSCs进行稳定表达,... 目的建立永生化大鼠前软骨干细胞(PSCs)株,为研究前软骨干细胞的分化机制及临床应用奠定基础。方法用L ipofectam ineTM2000介导基因转染,将含有SV40T抗原基因的真核表达载体pCMVSV40T/PUR导入经免疫磁珠分选出的原代PSCs进行稳定表达,用嘌呤霉素筛选出阳性克隆并扩大培养,观察细胞形态及生长状况,绘制细胞生长曲线,用免疫细胞化学方法和RT-PCR鉴定SV40T抗原基因在转染细胞中的表达。结果分离获得转化细胞阳性克隆,用免疫组化证实FGFR-3表达阳性,提取RNA后用RT-PCR法成功扩增出588 bp的片段。转染细胞经扩大培养,命名为永生化前软骨干细胞。贴壁培养的转染细胞群体倍增时间为(22.98±2.77)h,传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论在体外培养条件下,可以从新生大鼠干骺端分离、培养出前软骨干细胞,pCMVSV40T/PUR转染能使其永生化。 展开更多

关键词 SV40T 前软骨干细胞 细胞培养 永生化

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低强度脉冲超声波对SD大鼠前软骨干细胞增殖及细胞外基质mRNA表达的影响 被引量：2

7

作者 张迪 祁军 +2 位作者 江渟 李昆朋 郭风劲 《中国组织工程研究》 CAS CSCD 2012年第6期1075-1079,共5页

背景:研究证明低强度脉冲超声波不仅可以促进骨折愈合,而且还对软骨细胞增殖和细胞外基质分泌具有一定的调节作用。目的:进一步验证低强度脉冲超声波对大鼠前软骨干细胞增殖及细胞外基质分泌的影响。方法:分离新生大鼠乳鼠的前软骨干细... 背景:研究证明低强度脉冲超声波不仅可以促进骨折愈合,而且还对软骨细胞增殖和细胞外基质分泌具有一定的调节作用。目的:进一步验证低强度脉冲超声波对大鼠前软骨干细胞增殖及细胞外基质分泌的影响。方法:分离新生大鼠乳鼠的前软骨干细胞,鉴定后第3代细胞培养,分为空白对照组、5,12,20min/d组4组。以低强度脉冲超声波刺激后继续培养细胞24h。分别于刺激后第1,3,5天用CCK-8法检测细胞增殖。另以低强度脉冲超声波刺激后间隔30min提取总RNA,用RT-PCR法检测Ⅱ型胶原、Aggrecan、转化生长因子β1及Sox9基因的表达。结果与结论:低强度脉冲超声波对大鼠前软骨干细胞的增殖有促进作用,与对照组相比第1天时20min/d组增殖明显(P<0.05)。大鼠前软骨干细胞Ⅱ型胶原、Aggrecan、转化生长因子β1及Sox9基因mRAN的表达均有明显增加,刺激天数越多mRAN的表达量越多,以20min/d组增高最为明显。提示低强度脉冲超声波可以促进SD大鼠前软骨干细胞的增殖能力,并可以促进细胞外基质mRAN的表达,这一效应可能是通过转化生长因子β1及Sox9基因所介导的。 展开更多

关键词 低强度脉冲超声波 软骨组织工程 前软骨干细胞 细胞外基质 转化生长因子Β1 SOX9

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永生化人前软骨干细胞株的构建 被引量：1

8

作者 尹德龙 陈安民 +2 位作者 郭风劲 王俊芳 程浩 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期223-226,共4页

背景:前软骨干细胞体外培养增殖能力有限,但永生化细胞株可以提供大量性状稳定的永生化细胞,并且猿肾病毒40大T抗原基因(simian virus40large tumor antigen,SV40Tag)是较为常用且有效的体外永生化细胞的基因片段之一。目的:以SV40Tag... 背景:前软骨干细胞体外培养增殖能力有限,但永生化细胞株可以提供大量性状稳定的永生化细胞,并且猿肾病毒40大T抗原基因(simian virus40large tumor antigen,SV40Tag)是较为常用且有效的体外永生化细胞的基因片段之一。目的:以SV40Tag转染的人前软骨干细胞构建永生化人前软骨干细胞株。方法:采用酶消化法及免疫磁珠筛选技术分离纯化人胚胎前软骨干细胞。利用脂质体介导基因转染技术将含有SV40Tag的质粒pCMVSV40T/PUR转染原代胚胎前软骨干细胞,以未转染细胞作阴性对照。阳性克隆扩大培养,观察细胞形态学以及传代复苏情况,计算细胞存活率和群体倍增时间,绘制细胞生长曲线。以免疫荧光细胞化学技术检测永生化人前软骨干细胞成纤维生长因子受体3,以RT-PCR检测永生化人前软骨干细胞及人前软骨干细胞中SV40Tag和成纤维生长因子受体3表达。结果与结论:贴壁培养的永生化人前软骨干细胞形态与原代人前软骨干细胞形态无明显差别。传代、冻存、复苏对人永生化前软骨干细胞的存活率无影响,第6,10代人前软骨干细胞的存活率降低(P<0.01)。与第6,10代人前软骨干细胞相比,永生化人前软骨干细胞增殖较旺盛,群体倍增时间短、增殖率高(P<0.01)。第2代永生化人前软骨干细胞成纤维生长因子受体3染色阳性,成纤维生长因子受体3的RT-PCR结果显示在约400bp处有一特异形扩增条带,SV40Tag的RT-PCR结果显示在约560bp处有一特异形扩增条带,未转染的原代细胞未见条带。提示以免疫磁珠筛选技术及脂质体转染技术成功构建了SV40Tag永生化人前软骨干细胞株。 展开更多

关键词 人前软骨干细胞 永生化 SV40Tag 软骨组织工程

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藻酸盐水凝胶与前软骨干细胞构建组织工程化骺板 被引量：7

9

作者 游洪波 陈安民 《生物骨科材料与临床研究》 CAS 2004年第7期1-5,共5页

目的探讨藻酸盐水凝胶(alginate hydrogel,AH)与前软骨干细胞(precartilaginousstem cells,PSCs)复合物体内构建骺板样组织的可行性。方法利用多聚赖氨酸和藻酸盐制备AH。将PSCs在含有TGF-β3的藻酸盐微珠中培养,分别于7、14、21天将被... 目的探讨藻酸盐水凝胶(alginate hydrogel,AH)与前软骨干细胞(precartilaginousstem cells,PSCs)复合物体内构建骺板样组织的可行性。方法利用多聚赖氨酸和藻酸盐制备AH。将PSCs在含有TGF-β3的藻酸盐微珠中培养,分别于7、14、21天将被诱导的PSCs包埋入AH制备成AH-PSCs复合物,未被诱导的PSCs作对照。分别将AH-PSCs自体植入大鼠背部肌肉中,定期取材测定移植物的重量、细胞数,并行组织学检查及Ⅱ型胶原免疫组化检测。结果PSCs被诱导7天组移植物大约70％能形成骺板样结构;PSCs被诱导14天组及21天组的移植物能形成软骨组织及骨组织,但无骺板样结构;PSCs未被诱导的移植物无软骨组织及骨组织形成。被诱导7天组的移植物在20周的平均重量及每个移植物所含的细胞数均大于被诱导14天组或21天组的移植物(P<0.01);被诱导7天组的移植物在20周时平均重量及每个移植物所含的细胞数均大于在4周或10周时(P<0.01)。结论TGF-β3诱导PSCs7天的AH-PSCs复合物在体内能构建骺板样组织。 展开更多

关键词 前软骨干细胞 转化生长因子Β 藻酸盐水凝胶 骺板样组织

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前软骨干细胞的分离培养及其鉴定 被引量：2

10

作者 程浩 陈安民 游洪波 《中国康复》 2004年第4期198-200,共3页

目的 :探讨体外分离、培养及鉴定前软骨干细胞 (PCSC) ,为相关的实验研究奠定基础。方法 :采用酶消化法从新生大鼠干骺端中收集细胞 ,用免疫磁珠法分选出前软骨干细胞 ,用DMEM F12培养基进行体外培养 ,用免疫组化方法鉴定 ,对分离出的... 目的 :探讨体外分离、培养及鉴定前软骨干细胞 (PCSC) ,为相关的实验研究奠定基础。方法 :采用酶消化法从新生大鼠干骺端中收集细胞 ,用免疫磁珠法分选出前软骨干细胞 ,用DMEM F12培养基进行体外培养 ,用免疫组化方法鉴定 ,对分离出的前软骨干细胞进行相关分子生物学研究。结果 :从新生大鼠干骺端中成功培养出前软骨干细胞 ,培养条件下贴壁生长 ,成团块状 ,细胞表面有FGFR 3的标记物 ;细胞生长迅速。结论 展开更多

关键词 前软骨干细胞 细胞培养 分离

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人前软骨干细胞体外分离培养及鉴定的实验研究 被引量：1

11

作者 王俊芳 夏仁云 +4 位作者 方煌 陈安民 李锋 尹德龙 程浩 《生物骨科材料与临床研究》 CAS 2009年第2期1-4,共4页

目的探讨体外分离、培养人前软骨干细胞(PSCs)的可行性,分析其表型特点,为相关的实验研究奠定基础。方法采用酶消化法从流产胎儿干骺端中收集细胞,用免疫磁性分选技术分离出前软骨干细胞,体外扩增培养,用流式细胞术、免疫组化、免疫荧光... 目的探讨体外分离、培养人前软骨干细胞(PSCs)的可行性,分析其表型特点,为相关的实验研究奠定基础。方法采用酶消化法从流产胎儿干骺端中收集细胞,用免疫磁性分选技术分离出前软骨干细胞,体外扩增培养,用流式细胞术、免疫组化、免疫荧光、RT-PCR等方法鉴定纯化后的PSCs。结果从流产胎儿干骺端中成功培养出人前软骨干细胞,细胞表面表达成纤维生长因子受体-3(FGFR-3)标记物,细胞生长迅速。结论在体外培养条件下可以从流产胎儿干骺端中分离培养出较高丰度的前软骨干细胞。 展开更多

关键词 前软骨干细胞 成纤维生长因子受体-3 细胞培养

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人端粒酶反转录酶基因电转染优化培养大鼠前软骨干细胞

12

作者 彭义 曲家富 +2 位作者 曹立海 赵国志 杜晓健 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2016年第14期2110-2116,共7页

背景:将人端粒酶反转录酶转染至目的细胞中,可以提高其端粒酶活性,保持端粒的长度,在调控增殖和分化方面有重要作用。目的:探讨人端粒酶反转录酶基因转染对体外培养大鼠前软骨干细胞端粒酶活性及生物学特性的影响。方法:体外培养Wistar... 背景:将人端粒酶反转录酶转染至目的细胞中,可以提高其端粒酶活性,保持端粒的长度,在调控增殖和分化方面有重要作用。目的:探讨人端粒酶反转录酶基因转染对体外培养大鼠前软骨干细胞端粒酶活性及生物学特性的影响。方法:体外培养Wistar大鼠前软骨干细胞,以反转录病毒PLXSN为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染,同时设置对照组、阴性对照序列组、转染组。用TRAP-ELISA法检测前软骨干细胞端粒酶活性,RT-PCR、Western blot检测前软骨干细胞人端粒酶反转录酶基因和蛋白的表达,CCK-8法、细胞生长曲线检测细胞生长增殖情况,流式细胞仪测定细胞周期分布的变化。结果与结论:(1)人端粒酶反转录酶基因转染前软骨干细胞48 h,端粒酶活性明显升高;(2)与对照组、阴性对照序列组相比,转染组人端粒酶反转录酶基因和蛋白水平表达明显,细胞的生长速度明显增快,G0/G1期细胞数减少,S期细胞数增多,差异有显著性意义(P<0.05);(3)结果表明,以反转录病毒PLXSN为载体介导人端粒酶反转录酶基因转染使前软骨干细胞端粒酶活性明显升高,能够促进大鼠前软骨干细胞增殖。 展开更多

关键词 端粒 末端转移酶 转染 软骨细胞 组织工程 干细胞 培养 端粒酶反转录酶 基因 电转染 大鼠 前软骨干细胞

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转化生长因子-β3诱导大鼠前软骨干细胞成软骨分化的量效作用 被引量：2

13

作者 黄志刚 李锋 +1 位作者 游洪波 陈安民 《华中医学杂志》 CAS 2008年第3期185-187,共3页

目的研究转化生长因子-β3(TGF-β3)诱导大鼠前软骨干细胞(PSCs)向软骨方向分化的可行性以及剂量效应关系。方法在体外将分离纯化的大鼠PSCs置于含有不同剂量TGF-β3的诱导培养液中培养,依据其浓度分为5个实验组和1个对照组(不含TGF-β... 目的研究转化生长因子-β3(TGF-β3)诱导大鼠前软骨干细胞(PSCs)向软骨方向分化的可行性以及剂量效应关系。方法在体外将分离纯化的大鼠PSCs置于含有不同剂量TGF-β3的诱导培养液中培养,依据其浓度分为5个实验组和1个对照组(不含TGF-β3),观察细胞生长情况,分别进行Ⅱ型胶原的免疫组织化学检测及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Ⅱ型胶原mRNA表达。结果细胞生长良好。免疫组织化学检测对照组Ⅱ型胶原表达阴性,而含TGF-β3的诱导培养液诱导的各组细胞Ⅱ型胶原表达均阳性,其中10μg/L组阳性率最高。RT-PCR半定量检测也显示10μg/L组Ⅱ型胶原mRNA表达量最多,与其它组比较,差异均有显著意义(P<0.05)。结论TGF-β3在体外能有效诱导PSCs向软骨细胞定向分化。TGF-β3对PSCs促分化作用存在剂量依赖性。 展开更多

关键词 转化生长因子-Β3 前软骨干细胞 分化 软骨形成

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波长620nm红光促进前软骨干细胞向软骨细胞分化的实验研究 被引量：4

14

作者 李昆朋 许涛 +4 位作者 杜宇 宫晨 彭飞 陈安民 郭风劲 《中华物理医学与康复杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期172-176,共5页

目的探讨620nm波长红光在诱导前软骨干细胞（PSCs）向软骨细胞分化中的作用。方法使用细胞免疫磁珠分选大鼠PSCs并体外培养，使用发光二极管（LED）发出的620nm波长红光，分别予以不同能量照射细胞，使用阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组... 目的探讨620nm波长红光在诱导前软骨干细胞（PSCs）向软骨细胞分化中的作用。方法使用细胞免疫磁珠分选大鼠PSCs并体外培养，使用发光二极管（LED）发出的620nm波长红光，分别予以不同能量照射细胞，使用阿利新蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色观察软骨特异性细胞外基质（Ⅱ型胶原和蛋白聚糖）表达情况，光镜下观察细胞形态改变。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术分别检测各组细胞的Sox9和Ⅱ型胶原mRNA表达并进行半定量分析。结果PSCs经过软骨诱导和红光照射14d后，细胞形态由梭形变为多角形和类圆形，阿利新蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性反应，单纯诱导组呈弱阳性而对照组呈阴性；RT—PCR结果显示红光诱导的各组细胞Sox9和Ⅱ型胶原mRNA表达均明显增加，与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05），0．5J／cm2组、1J／cm2组和2J／cm2组组间差异具有统计学意义（P〈0．05），但4J／cm2组和2J／cm2组组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论低能量620nm红光照射对诱导PSCs向软骨细胞分化有明显的促进作用。 展开更多

关键词 软骨细胞 细胞分化 前软骨干细胞 红光

原文传递

Ihh信号通过甲状旁腺激素相关肽依赖和非依赖方式参与调控前软骨干细胞的分化和增殖 被引量：5

15

作者 许凯 陈安民 +1 位作者 成薇婷 郭风劲 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期1048-1051,共4页

目的观察印度豪猪蛋白（Ihh）和甲状旁腺激素相关肽（PTHrP）信号通路对大鼠前软骨干细胞（PSCs）分化和增殖的调控作用。方法应用免疫磁珠筛选技术获得大鼠PSCs。噻唑蓝（M3T）比色法筛选Ihh信号阻断剂环王巴明（Cyclopamine，Cyclo）... 目的观察印度豪猪蛋白（Ihh）和甲状旁腺激素相关肽（PTHrP）信号通路对大鼠前软骨干细胞（PSCs）分化和增殖的调控作用。方法应用免疫磁珠筛选技术获得大鼠PSCs。噻唑蓝（M3T）比色法筛选Ihh信号阻断剂环王巴明（Cyclopamine，Cyclo）的最低有效浓度，PTHrP真核质粒（pEGPF—N1-PTHrP）转染PSCs。细胞分4组：对照组（Control，PBS100μl，n=3）、Ihh信号阻断组（Ihh^-，20nmol／L Cyclo 100μl，n=3）、PTHrP信号增强组（PTHrP^＋，1．0μg pEGPF—N1-PTHrP，n=3）和双重干预组（Ihh^-／PTHrP^＋，20nmol／L Cyclo 100tμ＋1．0μg pEGPF—N1-PTHrP，n=3）。干预2周后应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测Ihh、PTHrP、Ⅱ型胶原（ColⅡ）的mRNA表达，BrdU掺入法测细胞增殖，免疫组织化学检测ColⅡ表达，阿辛蓝染色检测酸性糖胺多糖含量。结果成功获得PSCs，筛选获得Cyclo最低有效工作浓度为20nmol／L；1．0μg PTHrP真核质粒转染效率〉60％，转染后高表达该基因；Ihh^-组ColⅡ基因和蛋白表达明显下降，PTHrP^＋组和Ihh^-／PTHrP^＋组ColⅡ基因和蛋白表达稳定，酸性糖胺多糖分泌多；BrdU实验显示Ihh^-组和Ihh／PTHrP^＋组增殖率分别为（23．26±3．96）％和（21．65±5．12）％，相对Control组（35．42±3．79）％差异有统计学意义（P〈0．01），而两组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论Ihh-PTHrP信号通路参与对PSCs分化和增殖的调控，Ihh信号可独立调控PSCs的增殖，但对其分化的调控依赖PTHrP信号的作用。 展开更多

关键词 前软骨干细胞 信号通路 分化 增殖

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脉冲电磁场对免疫磁性分选人前软骨干细胞增殖功能的影响 被引量：4

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作者 王俊芳 夏仁云 +3 位作者 方煌 陈安民 尹德龙 程浩 《中华物理医学与康复杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期296-300,共5页

目的研究脉冲电磁场对免疫磁性分选人前软骨干细胞（PSCs）增殖功能的影响。方法采用酶消化法从流产胎儿下肢股骨干骺端中收集细胞，选用免疫磁性分选技术分离出PSCs；经体外扩增培养后采用流式细胞术、免疫组化、免疫荧光、RT—PCR等... 目的研究脉冲电磁场对免疫磁性分选人前软骨干细胞（PSCs）增殖功能的影响。方法采用酶消化法从流产胎儿下肢股骨干骺端中收集细胞，选用免疫磁性分选技术分离出PSCs；经体外扩增培养后采用流式细胞术、免疫组化、免疫荧光、RT—PCR等技术鉴定纯化后的PSCs。采用50Hz 1mT脉冲电磁场间断刺激纯化后的PSCs，并绘制细胞生长曲线，采用MTT法测定细胞增殖活性，采用流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡情况。结果从流产胎儿干骺端中成功培养出细胞表面表达成纤维生长因子受体-3（FGFR-3）标记物的人PSCs；免疫磁性分选系统能有效分离纯化PSCs；PSCs经脉冲电磁场刺激4d和6d后，发现能明显促进细胞增殖功能（P〈0．05），其S期细胞数量百分比较对照组显著增高（P〈0．01），细胞早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率均较对照组明显降低（P〈0．05）。结论免疫磁性分选系统能有效分离、纯化PSCs，脉冲电磁场刺激能显著提高体外培养人PSCs增殖功能并抑制细胞凋亡。 展开更多

关键词 前软骨干细胞 成纤维生长因子受体-3 细胞培养 脉冲电磁场

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激活的Notch1信号系统抑制前软骨干细胞凋亡及其机制研究 被引量：4

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作者 张衣北 陈安民 +1 位作者 郭风劲 黄士龙 《中华小儿外科杂志》 CSCD 北大核心 2006年第11期592-595,共4页

目的研究激活的Notch1信号系统抑制体外培养的前软骨干细胞(precartilainous stem cells,PSCs)凋亡及其机制。方法用RT-PCR检测PSCs细胞中Notch信号系统的表达,并分别向培养细胞中加入Notch1激活剂rhNF-kB、抑制剂γ-secretase inhibito... 目的研究激活的Notch1信号系统抑制体外培养的前软骨干细胞(precartilainous stem cells,PSCs)凋亡及其机制。方法用RT-PCR检测PSCs细胞中Notch信号系统的表达,并分别向培养细胞中加入Notch1激活剂rhNF-kB、抑制剂γ-secretase inhibitorⅡ(MW167)和Bcl-2抑制剂HA 14-1,空白对照加PBS缓冲液,在凋亡诱导剂Celecoxib诱导后,用MTT检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡和Western Blot检测Hes-1及Bcl-2蛋白的表达。结果PSCs细胞中存在Notch1／Jagged1信号通路,rhNF-kB组细胞活力增加,凋亡较少,Hes-1蛋白和Bcl-2蛋白表达明显增加,而MW167组、HA 14-1组和对照组细胞凋亡明显,差异有显著性意义(P<0．05),且HA 14-1组和HA 14-1协同rhNF-kB组无Bcl-2表达。结论激活的Notch1信号系统通过促进靶基因Hes-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来抑制PSCs细胞凋亡。 展开更多

关键词 Notch信号系统 前软骨干细胞 凋亡

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降钙素基因相关肽诱导前软骨干细胞成骨分化的实验研究 被引量：2

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作者 印卫锋 李文凯 +2 位作者 李光辉 郭风劲 王江 《中华物理医学与康复杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期329-334,共6页

目的探讨降钙素基因相关肽（CGRP）体外定向诱导前软骨干细胞（PSCs）向成骨细胞分化的作崩及其机制。方法将分离培养的大鼠乳鼠PSCs分别置于含有不同浓度（包括0，1×10^-8mol／L，1×10^-9mol／L，1×10^-10nml／L）CGRP... 目的探讨降钙素基因相关肽（CGRP）体外定向诱导前软骨干细胞（PSCs）向成骨细胞分化的作崩及其机制。方法将分离培养的大鼠乳鼠PSCs分别置于含有不同浓度（包括0，1×10^-8mol／L，1×10^-9mol／L，1×10^-10nml／L）CGRP的DMEM／F12培养液中培养，观察细胞形态学变化。于细胞培养后不同时间点采用CCK-8榆洲细胞增殖情况；^将细胞随机分为实验组及对照组，实验组置于禽有CGRP（1×10μmol／L）的成骨培养基中培养，对照组则酋于不含CGRP的成骨培养基中培养。对各组细胞进行茜素红染色并检测碱性磷酸酶（AI．P）岔量；采用RT—pCR法检测各组细胞成骨相关基因[如Runt相关基因转录因子2（RUNX2）、骨桥蛋白（OPN）及骨钙蛋白（BGP）等]表达；采用Westernblot法检测B-catenin蛋白表达以评估CGRP对wut／β-catenin通路激活的影响。结果 与对旦H组（其培养基中无CGRP）比较，CGRP在体外能显著促进PSCs细胞ALP含量增加，矿化结节增大、增多，显著上调RUNX2、OPN、BGP等成骨相关基因及蛋门β—catenin表达，但对PSCs增殖无明显影响。结论CGRP可能通过激活Wnt／β-catenin通路促进PSCs向成骨细胞方向分化。 展开更多

关键词 干细胞 前软骨干细胞 降钙素基因相关肽 成骨分化 Wnt/13一catenin通路

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高效绿色荧光蛋白基因修饰前软骨干细胞与骨基质明胶复合体异位成软骨的研究 被引量：1

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作者 游洪波 陈安民 +3 位作者 孙凯 王国宾 王茂朋 张国良 《中华实验外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期1036-1038,共3页

目的观察高效绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰前软骨干细胞（PSCs）与骨基质明胶（BMG）复合体的成软骨活性。方法EGFP基因转染PSCs得到EGFP基因修饰PSCs。将其与BMG的复合体体外培养后植入裸鼠右后肢肌袋中，左后肢植入BMG作对照。定期... 目的观察高效绿色荧光蛋白（EGFP）基因修饰前软骨干细胞（PSCs）与骨基质明胶（BMG）复合体的成软骨活性。方法EGFP基因转染PSCs得到EGFP基因修饰PSCs。将其与BMG的复合体体外培养后植入裸鼠右后肢肌袋中，左后肢植入BMG作对照。定期取材测定移植物的重量、细胞数，观察GFP表达，免疫组织化学检测Ⅱ型胶原表达。结果EGFP基因修饰PSCs体外培养6周仍有较强GFP表达。移植后1～6周均有较强GFP表达，3～6周有较强Ⅱ型胶原表达。移植后2～6周复合体平均重量分别为（0．71±0．07）、（1．35±0．32）、（1．76±0．48）、（1．96±0．54）、（1．89±0．13）g，均比对照组重（P〈0．01）；1～6周时复合体平均所含细胞总数分别为（40．0±2．1）×10^6、（67．0±5．6）×10^6、（139．0±11．2）×10^6、（169．0±2．9）×10^6、（173．0±13．5）×10^6、（169．0±6．9）×10^6个，均大于对照组（P〈0．01）。结论EGFP基因修饰PSCs与BMG复合体能在异位形成软骨组织。 展开更多

关键词 前软骨干细胞 基因转染 骨基质 明胶

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自组装多肽纳米凝胶支架三维培养前软骨干细胞的实验研究 被引量：5

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作者 罗文 范建楠 叶川 《中国修复重建外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第12期1505-1511,共7页

目的构建新型自组装多肽纳米凝胶支架RGDmx,探讨支架的细胞相容性及其对前软骨干细胞(precartilaginous stem cells,PSCs)增殖和向软骨细胞方向分化的影响。方法取新生SD大鼠四肢长骨干骺端组织分离培养PSCs,采用免疫磁珠分选系统分选... 目的构建新型自组装多肽纳米凝胶支架RGDmx,探讨支架的细胞相容性及其对前软骨干细胞(precartilaginous stem cells,PSCs)增殖和向软骨细胞方向分化的影响。方法取新生SD大鼠四肢长骨干骺端组织分离培养PSCs,采用免疫磁珠分选系统分选纯化原代细胞,并进行鉴定。取KLD-12、KLD-12-PRG多肽冻干粉,以体积比1∶1复合构建RGDmx。将纯化后的第3代PSCs接种至KLD-12(对照组)和RGDmx(实验组)培养,1、3、7、14 d用细胞计数(cell counting kit,CCK)-8法检测支架细胞增殖-毒性;制备不同混合比(0、20%、40%、60%、80%、100%)RGDmx,观察其对PSCs增殖的影响;采用无血清软骨形成培养液(complete chondrogenic medium,CCM)诱导两组支架内PSCs向软骨细胞方向分化,培养14 d时行甲苯胺蓝染色法鉴定,并用RT-PCR法检测两组软骨分化特异性基因Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达情况。结果成功分离纯化获得成纤维细胞生长因子受体3表达阳性细胞,免疫组织化学染色及免疫荧光染色鉴定为PSCs。CCK-8检测结果显示,复合培养后实验组细胞吸光度(A)值随培养时间延长逐步提高,7 d达峰值;其中7、14 d时细胞A值高于对照组(P<0.05);复合培养7 d时,混合比为40%组细胞A值较其他混合比组高,差异有统计学意义(P<0.05)。CCM诱导培养14 d时,两组支架内细胞甲苯胺蓝染色均呈阳性;RT-PCR检测示实验组细胞Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论自组装多肽纳米凝胶支架RGDmx具有良好的细胞相容性,可有效促进PSCs增殖及向软骨细胞方向分化,是组织工程较理想的细胞载体系统。 展开更多

关键词 组织工程支架 自组装多肽纳米凝胶支架 前软骨干细胞 关节软骨缺损修复

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