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人源抗c-Met单链抗体腹腔注射可抑制A549肺腺癌荷瘤小鼠移植瘤生长
1
作者 安然 刘明珠 +4 位作者 张露 彭上 甄翔程 闵静婷 李正红 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期549-555,共7页
目的 该实验旨在验证间质上皮转化单链抗体(Met scFv)在体内对皮下移植瘤裸鼠的抗肿瘤作用。方法 建立裸鼠肿瘤模型,皮下注射A549肺腺癌细胞,成瘤后通过腹腔注射IRDye680 LT N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯标记的Met scFv,借助小动物成像仪进... 目的 该实验旨在验证间质上皮转化单链抗体(Met scFv)在体内对皮下移植瘤裸鼠的抗肿瘤作用。方法 建立裸鼠肿瘤模型,皮下注射A549肺腺癌细胞,成瘤后通过腹腔注射IRDye680 LT N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯标记的Met scFv,借助小动物成像仪进行实时监测以观察该抗体在荷瘤小鼠体内的动态分布情况,检测肿瘤组织细胞c-Met与抗体的亲和力,定期尾静脉注射Met scFv,观察肿瘤体积变化并绘制肿瘤生长曲线。免疫组织化学染色法检测Met scFv是否能有效结合肿瘤组织中的c-Met抗原。结果 裸鼠体内分布结果表明,在最初的3 h内,Met scFv主要分布于腹腔内。经过大约48 h,荧光信号开始在肿瘤组织中聚集。瘤体免疫组织化学染色结果显示,肿瘤组织中c-Met高表达;定期尾静脉注射Met scFv,可使小鼠瘤体生长明显减缓。结论 Met scFv在体内特异性识别肿瘤细胞且表现出显著的抗肿瘤活性。 展开更多
关键词 细胞间质上皮转化(c-Met) 单链抗体(scFv) 抗原识别 抗肿瘤活性
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牛源抗金黄色葡萄球菌弹性纤维结合蛋白N端蛋白单链抗体的筛选及其体外抑菌的研究
2
作者 闫洁新 张波 +5 位作者 张凡庆 管玉 王曼 张蕾 程曼玲 朱建国 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第2期145-150,共6页
由金黄色葡萄球菌(S.aureus)引发的奶牛乳腺炎是造成国内外奶牛产业经济损失的重要疾病之一。为了获得牛源抗S.aureus弹性纤维结合蛋白N端蛋白(nEbpS)的单链抗体(scFv),本研究利用噬菌体展示技术,将原核表达的nEbpS包被到固相载体酶标板... 由金黄色葡萄球菌(S.aureus)引发的奶牛乳腺炎是造成国内外奶牛产业经济损失的重要疾病之一。为了获得牛源抗S.aureus弹性纤维结合蛋白N端蛋白(nEbpS)的单链抗体(scFv),本研究利用噬菌体展示技术,将原核表达的nEbpS包被到固相载体酶标板上,以实验室前期构建好的抗牛源S.aureus噬菌体库为原始文库进行筛选,得到1株靶向nEbpS的高亲和力scFv,将得到的scFv构建原核质粒进行原核表达,获得了高纯度scFv蛋白,将其与S.aureus ATCC25923在含有Zn2+的Luria-Bertani培养基中共同孵育后发现,50μg/mL scFv组菌液浓度显著小于生理盐水组(P<0.05),结果表明,针对nEbpS的牛源scFv具有良好的抑菌能力,浓度为50μg/mL时即可显著抑制S.aureus ATCC25923的生长。本研究为S.aureus所导致的奶牛乳腺炎提供了一种新型免疫制剂,也为进一步研究nEbpS抗原的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 奶牛乳腺炎 金黄色葡萄球菌 弹性纤维结合蛋白 单链抗体
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给予卵清蛋白表位内化受体DEC⁃205抗体单链可变区嵌合蛋白(SD)可抑制小鼠食物过敏
3
作者 万冲 吴美英 +4 位作者 张雨晴 邵俊维 骆晴晴 鞠吉雨 徐灵芝 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期391-396,共6页
目的研究卵清蛋白(OVA)表位内化受体DEC⁃205抗体单链可变区嵌合蛋白(SD)对小鼠食物过敏的预防性治疗作用及可能的机制。方法基于食物过敏模型,将小鼠随机分为单纯对照组、PBS组、100μg DEC205受体抗体单链可变区(scFv DEC)处理组、50μ... 目的研究卵清蛋白(OVA)表位内化受体DEC⁃205抗体单链可变区嵌合蛋白(SD)对小鼠食物过敏的预防性治疗作用及可能的机制。方法基于食物过敏模型,将小鼠随机分为单纯对照组、PBS组、100μg DEC205受体抗体单链可变区(scFv DEC)处理组、50μg SD处理组、100μg SD处理组,每次接触卵清蛋白(OVA)24 h前给予相应处理。激发后评估小鼠腹泻发生情况,测肛温,ELISA检测血清中OVA特异性IgE、IgG1、IgG2a以及白细胞介素4(IL⁃4)水平,HE染色观察空肠组织嗜酸性粒细胞浸润情况,甲苯胺蓝染色观察肥大细胞浸润情况。分离培养未成熟骨髓来源的树突状细胞(BMDC),分别以10 ng/mL脂多糖(LPS)、50 ng/mL胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、1000 ng/mL scFv DEC蛋白、(10、100、1000)ng/mL SD蛋白刺激培养24 h,检测上清中IL⁃10水平。结果与PBS组相比,预防性给予SD蛋白,发生腹泻的小鼠数量明显减少,肛温差显著减小,血清OVA特异性IgE、IgG1、IgG2a以及IL⁃4水平显著降低;空肠组织嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润显著减少,SD体外刺激BMDC培养上清IL⁃10水平显著升高。结论SD通过促进树突状细胞的免疫耐受减轻实验性食物过敏反应。 展开更多
关键词 树突状细胞 食物过敏 DEC⁃205抗体单链可变区嵌合蛋白(SD) 白细胞介素10
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应用核糖体展示技术筛选抗人p53单链抗体的效果
4
作者 陈荫楠 罗婉妹 +2 位作者 罗彩林 郑晨娜 郭娜燕 《菏泽医学专科学校学报》 2023年第1期1-5,13,共6页
目的运用核糖体展示技术筛选抗人p53单链抗体,并进行初步分析。方法诱导表达p53蛋白,用其免疫小鼠。提取免疫小鼠脾脏组织的总RNA,通过反转录PCR和重叠延伸PCR分别扩增抗体重链可变区基因VH-Linker和轻链可变区基因VL-Linker,并合成VH-l... 目的运用核糖体展示技术筛选抗人p53单链抗体,并进行初步分析。方法诱导表达p53蛋白,用其免疫小鼠。提取免疫小鼠脾脏组织的总RNA,通过反转录PCR和重叠延伸PCR分别扩增抗体重链可变区基因VH-Linker和轻链可变区基因VL-Linker,并合成VH-linker-VL型单链抗体基因。TNT T7 Quick for PCR DNA试剂盒对单链抗体基因进行体外转录与翻译,以p53蛋白为靶标,经过5轮筛选富集ScFv基因。将获取单链抗体片段进行原核表达后,采用ELISA法和细胞免疫学法检测。结果成功构建抗p53单链抗体库,并筛选出p53蛋白具有较强结合活性的单链抗体株p53-scFv1、p53-scFv2和p53-scFv3,可用以检测细胞中的p53蛋白。结论利用核糖体展示技术获得亲和力较好的抗人p53单链抗体,可为p53抗体的制备提供新思路。 展开更多
关键词 P53蛋白 单链抗体 核糖体
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丙型肝炎病毒非结构蛋白4A人源单链可变区抗体的筛选与鉴定 被引量：19
5
作者 钟彦伟 成军 +4 位作者 施双双 夏小兵 王刚 杨继珍 陈菊梅 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第6期422-424,共3页
目的利用噬菌体表面展示技 术,从半合成人源化单链可变区抗体库中筛选、鉴定丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A 的单 链可变区抗体(ScFv)及其编码基因,为抗HCV的细胞内免疫基因治疗研究开辟新途径。方法采用噬菌体表面展示技术,以重组的... 目的利用噬菌体表面展示技 术,从半合成人源化单链可变区抗体库中筛选、鉴定丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A 的单 链可变区抗体(ScFv)及其编码基因,为抗HCV的细胞内免疫基因治疗研究开辟新途径。方法采用噬菌体表面展示技术,以重组的HCV非结构蛋白NS4A为包被抗原,从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过 程,获得抗原结合活性较强的HCV NS4A人单链可变区抗体片段阳性克隆,并对其 进行免疫学活性及编码基因序列测定。结果筛选得到 的ScFv片段具有抗HCV NS4A的特异性,编码基因符合人源化单链可变区抗体编码基因的特 点。结论利用噬菌体抗体库技术,成功获得HCV NS4A的特异性人抗体,为进一步研究HCV NS4A的生物学功能及细胞内免疫抗HCV基因治疗方 案奠定基础。 展开更多
关键词 非结构蛋白NS4A 单链抗体 丙型肝炎 HCV
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人源抗HBsAg单链抗体在巴氏毕赤酵母中的表达 被引量：21
6
作者 熊盛 任向荣 +5 位作者 唐永红 粟宽源 余宙耀 罗勇 王一飞 李久香 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期19-23,共5页
在P .pastoris中分泌表达非融合抗HBsAg单链抗体 (HBscFv)。设计引物从pGEM HBscFv上扩增目的基因 ,亚克隆至P .pastoris表达载体pPICZαA中 ,线性化后转化P .pastorisGS115 ;转化子经菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定后 ,甲醇诱导目... 在P .pastoris中分泌表达非融合抗HBsAg单链抗体 (HBscFv)。设计引物从pGEM HBscFv上扩增目的基因 ,亚克隆至P .pastoris表达载体pPICZαA中 ,线性化后转化P .pastorisGS115 ;转化子经菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定后 ,甲醇诱导目的蛋白表达。结果发现 ,重组HBscFv可以在α因子的引导下 ,分泌至培养基中 ,产量为80mg L ;分泌至培养基中的HBscFv具有结合HBsAg活性 ,活性总量在诱导培养 72h后达最高峰 ,在诱导培养后期 ,HBscFv活性下降 ;PAS糖显色结果表明 ,酵母表达HBscFv是一种低糖基化蛋白或非糖基化蛋白。 展开更多
关键词 人源抗HBsAg单链抗体 巴氏毕赤酵母 表达 乙型肝炎
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鼻咽癌人源抗独特型单链抗体的制备及筛选 被引量：13
7
作者 何小鹃 李官成 +2 位作者 朱建高 李跃辉 周国华 《癌症》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第2期124-129,共6页
背景与目的:抗独特型抗体作为肿瘤抗原替代物可用于肿瘤治疗,这已在临床试验中得到证实。但由于目前所使用的抗独特型抗体多为鼠源性,用于人体可产生人抗鼠抗体反应,从而影响疗效。本实验拟构建噬菌体人源抗独特型抗体库,并从中筛选出... 背景与目的:抗独特型抗体作为肿瘤抗原替代物可用于肿瘤治疗,这已在临床试验中得到证实。但由于目前所使用的抗独特型抗体多为鼠源性,用于人体可产生人抗鼠抗体反应,从而影响疗效。本实验拟构建噬菌体人源抗独特型抗体库,并从中筛选出能模拟鼻咽癌相关抗原的β型抗独特型单链抗体scFv(Ab2βscFv),以解决鼠源性抗独特型抗体用于临床所产生的人抗鼠抗体反应。方法:体外致敏并用EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)转化鼻咽癌患者的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC),用RT-PCR分别扩增VH和VL基因并连接成scFv基因,将scFv基因与载体fUSE5连接后,转化大肠杆菌MC1061,构建噬菌体呈现型scFv库。在用单抗FC2对文库进行4轮筛选后,用SandwichELISA和结合抑制法从中筛选出β型Ab2scFv。结果:用单抗FC2体外致敏并经EBV转化的10例鼻咽癌患者的PBMC中,8例有鼻咽癌抗独特型抗体产生。经PCR分别扩增出5种VH(γ、μ)和7种VL(κ、λ)基因,经连接组成14种scFv基因。在与载体连接后,导入大肠杆菌MC1061,得到库容为1.5×108的初级噬菌体抗独特型抗体库。经富集筛选后,从中随机挑取270个克隆进行ELISA筛选,得到91个Ab2scFv单克隆,阳性率为33.7%。再用结合抑制法从中初步筛选出5个可能为β型的Ab2scFv。 展开更多
关键词 鼻咽癌 人源抗独特型单链抗体 噬菌体呈现技术 EB病毒 免疫治疗
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日本血吸虫未成熟卵单链抗体库的构建、筛选及初步应用 被引量：13
8
作者 何卓 汪世平 +4 位作者 肖小芹 曾少华 刘明社 李林 周帅锋 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第8期921-928,共8页
运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)单链抗体(scFv)表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26～28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体.并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26～28k... 运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)单链抗体(scFv)表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26～28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体.并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26～28ku特异性scFv大量表达.随后以此为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,以期获得SIEA26～28ku天然分子候选疫苗相关的编码基因.结果显示,所获得的SIEA26～28ku特异性scFv,表达量高,采用该探针初步筛选出相关基因核糖体蛋白S4.SIEA26～28ku特异性scFv的获得,为进一步筛选、分析鉴定抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗SIEA26～28ku的编码基因奠定了基础. 展开更多
关键词 日本血吸虫 未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA) 单链抗体(scFv) 噬菌体展示抗体库 CDNA文库
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大肠杆菌表达的单链抗体柱复性的研究 被引量：7
9
作者 朱迎春 王琰 +3 位作者 高荣凯 刘群英 化冰 陈宇萍 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1999年第2期169-172,共4页
对包含体表达的抗乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）的单链抗体（ＳｃＦｖ）纯化复性进行了探索．尝试了利用金属螯合亲和层析和凝胶层析柱进行柱上在位复性的可行性．对包含体表达的ＳｃＦｖ进行透析复性与柱复性，比较其相对复性率及蛋... 对包含体表达的抗乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）的单链抗体（ＳｃＦｖ）纯化复性进行了探索．尝试了利用金属螯合亲和层析和凝胶层析柱进行柱上在位复性的可行性．对包含体表达的ＳｃＦｖ进行透析复性与柱复性，比较其相对复性率及蛋白质回收率，发现柱上复性效果优于传统的透析复性．抗ＨＢｓＡｇＳｃＦｖ经凝胶色谱ＳｅｐｈａｃｙｌＳ２００柱复性的相对复性率为９８％，蛋白质回收率为８１％．由于将纯化复性同步进行，简化了操作程序。 展开更多
关键词 单链抗体ScFv 包含体 纯化 复性 乙型肝炎病毒
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分泌型抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体的构建及表达 被引量：16
10
作者 程虹 刘彦仿 +2 位作者 张惠中 沈万安 张素珍 《世界华人消化杂志》 CAS 2001年第6期640-644,共5页
目的分泌型抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体的构建及表达。方法采用PCR方法在抗肝癌sFv的5端引入引导序列使其能够在真核细胞中表达并分泌,在其下游连接人TNF-α基因,构建分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因,并将该基因克隆入带有... 目的分泌型抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体的构建及表达。方法采用PCR方法在抗肝癌sFv的5端引入引导序列使其能够在真核细胞中表达并分泌,在其下游连接人TNF-α基因,构建分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因,并将该基因克隆入带有GFP报告基因的真核表达载体,用磷酸钙共沉淀法转染小鼠成纤维细胞NIH3T3进行瞬时表达。结果 DNA序列分析证实在sFv的5端引入正确的60bp引导肽序列,酶切鉴定证明成功构建了分泌型抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体,并在NIH3T3细胞中成功地表达了融合荧光蛋白。结论成功构建并表达了分泌型抗肝癌单链双功能抗体融合GFP基因,为肝癌免疫基因治疗的进一步研究奠定了基础。 展开更多
关键词 肝细胞癌 单链抗体 肿瘤坏死因子 绿色荧光蛋白 基因表达
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抗克伦特罗噬菌体单链抗体库的构建、筛选及鉴定 被引量：9
11
作者 潘科 王弘 +4 位作者 张宏斌 王捷 雷红涛 杨金易 孙远明 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 北大核心 2005年第11期51-54,共4页
利用噬菌体展示技术构建克伦特罗(CBL)单链抗体(scFv)库,从中筛选CBL特异性噬菌体scFv,从而成功扩增出抗CBL的VL,VH基因片段并采用重叠延伸PCR拼接为全长的scFv基因片段,抗体库库容约为1.6×104,经4轮吸附—洗脱—扩增的富集,采用... 利用噬菌体展示技术构建克伦特罗(CBL)单链抗体(scFv)库,从中筛选CBL特异性噬菌体scFv,从而成功扩增出抗CBL的VL,VH基因片段并采用重叠延伸PCR拼接为全长的scFv基因片段,抗体库库容约为1.6×104,经4轮吸附—洗脱—扩增的富集,采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法筛选到6个具有CBL结合活性的噬菌体scFv,为进一步大量表达CBL单链抗体奠定了基础. 展开更多
关键词 克伦特罗 单链抗体 噬菌体展示
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肝癌特异性鼠源及人源化单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的表达 被引量：18
12
作者 袁清安 俞炜源 黄翠芬 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2000年第1期86-90,共5页
为探讨一株肝细胞癌特异性鼠源及其人源化单链抗体基因在大肠杆菌中的可溶性表达策略并比较二者对抗原的结合能力,在三种载体中分别以融合、分泌及胞内表达的方式进行了研究,表达产物均以包涵体形式存在;对复性后的单链抗体以细胞ELISA... 为探讨一株肝细胞癌特异性鼠源及其人源化单链抗体基因在大肠杆菌中的可溶性表达策略并比较二者对抗原的结合能力,在三种载体中分别以融合、分泌及胞内表达的方式进行了研究,表达产物均以包涵体形式存在;对复性后的单链抗体以细胞ELISA及竞争抑制流式细胞仪法进行检测,表明人源化单链抗体和鼠源单链抗体有相近的抗原结合能力。结论是:在大肠杆菌中表达的基因工程单链抗体的可溶性可能主要由自身氨基酸一级序列决定;先前的设计所采取的人源化方案没有影响到鼠源抗体的CDR的天然构象。 展开更多
关键词 单链抗体 肝癌 大肠杆菌 免疫原性 可溶性表达
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从半合成抗体库克隆抗TNF-α人单链抗体 被引量：10
13
作者 王琰 刘群英 +3 位作者 化冰 陈宇萍 朱迎春 陈晓穗 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1999年第2期87-89,共3页
通过噬菌体抗体库技术，不经免疫克隆抗ＴＮＦ－α人单链抗体，用固相化的人重组ＴＮＦ－α抗原对半合成噬菌体抗体库进行了４轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选，可见到明显富集，从第３轮和第４轮洗脱下来的克隆中获得两株可特异结合ＴＮ... 通过噬菌体抗体库技术，不经免疫克隆抗ＴＮＦ－α人单链抗体，用固相化的人重组ＴＮＦ－α抗原对半合成噬菌体抗体库进行了４轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选，可见到明显富集，从第３轮和第４轮洗脱下来的克隆中获得两株可特异结合ＴＮＦ－α的克隆，其可变区分别属于ＶＨ１、ＶＨ３和Ｖλ１亚群。 展开更多
关键词 噬菌体抗体库 TNFΑ 人单链抗体
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人源抗狂犬病毒单链抗体库的构建及体外亲和筛选 被引量：11
14
作者 赵小玲 荫俊 +2 位作者 王慧 姜明 侯小军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期243-247,共5页
目的 :构建人源噬菌体展示单链抗体 (scFv)库 ,筛选抗狂犬病毒特异性、高亲和力的scFv。方法 :应用重组噬菌体抗体技术 ,从经狂犬病毒WISTARPM株疫苗免疫者的外周血淋巴细胞中 ,分离并构建scFv基因。将其克隆入噬粒载体pCANTAB 5E中 ,... 目的 :构建人源噬菌体展示单链抗体 (scFv)库 ,筛选抗狂犬病毒特异性、高亲和力的scFv。方法 :应用重组噬菌体抗体技术 ,从经狂犬病毒WISTARPM株疫苗免疫者的外周血淋巴细胞中 ,分离并构建scFv基因。将其克隆入噬粒载体pCANTAB 5E中 ,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K0 7援救构建噬菌体单链抗体库。采用狂犬病毒Vero疫苗亲和富集法 ,淘选阳性重组噬菌体 ,经鉴定后对其进行序列分析。用竞争ELISA ,初步检测重组scFv的特异性抗原结合活性。结果 :成功地构建了库容量约为 7× 10 8抗狂犬病毒噬菌体scFv库 ,筛选到 1株新的抗狂犬病毒的scFv S12。结论 :噬菌体展示scFv库的成功构建及人源抗狂犬病毒特异性scFv的获得 ,为进一步研制抗狂犬病毒的高特异性。 展开更多
关键词 狂犬病毒 噬菌体展示技术 单链抗体
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卵巢癌抗独特型单链抗体的人源化——抗独特型微抗体的构建与表达 被引量：11
15
作者 崔恒 昌晓红 +2 位作者 冯捷 刘蓓 曹善津 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期490-494,共5页
为了降低人抗鼠抗体反应 ,获得满意的免疫原性 ,将模拟人卵巢癌抗原的抗独特型单链抗体人源化 .采用重叠PCR和基因工程的技术 ,将 6B11ScFv基因的轻链和重链颠倒 ,成为 6B11VL VH.再与人IgG1铰链区和CH3区的基因进行融合 (VL VH CH3) ,... 为了降低人抗鼠抗体反应 ,获得满意的免疫原性 ,将模拟人卵巢癌抗原的抗独特型单链抗体人源化 .采用重叠PCR和基因工程的技术 ,将 6B11ScFv基因的轻链和重链颠倒 ,成为 6B11VL VH.再与人IgG1铰链区和CH3区的基因进行融合 (VL VH CH3) ,构建抗独特型微抗体的原核表达载体 .转化E .coliBL2 1(DE3)后用IPTG诱导表达 .经SDS PAGE分离显示 ,在 5 0kD左右处有一诱导蛋白带 .不连续非变性凝胶电泳显示 ,表达产物分子量为 10 0kD左右 .采用ELISA、竞争抑制实验、West ern印迹对其进行活性测定 .结果表明 ,人源化的抗独特型微抗体具有特异性双价结合卵巢癌单克隆抗体COC16 6 9和识别人免疫球蛋白IgG1的活性 。 展开更多
关键词 卵巢癌 抗独特型单链抗体 人源化 抗独特型微抗体 构建 表达 人IgG1 重组融合基因
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抗人红细胞H抗原单链抗体基因克隆和表达 被引量：10
16
作者 邵长利 史利军 +4 位作者 姚站馨 王宏业 吕茂民 刘明 章金刚 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期238-242,共5页
目的克隆抗人红细胞H抗原单克隆抗体轻、重链可变区(VH、VL)基因并构建单链抗体(ScFv)基因及其表达载体,实现其在原核细胞中的表达。方法从分泌抗人红细胞H抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株2E8中提取总RNA,采用RT-PCR法获得抗人红细胞H抗... 目的克隆抗人红细胞H抗原单克隆抗体轻、重链可变区(VH、VL)基因并构建单链抗体(ScFv)基因及其表达载体,实现其在原核细胞中的表达。方法从分泌抗人红细胞H抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株2E8中提取总RNA,采用RT-PCR法获得抗人红细胞H抗原单克隆抗体的VH、VL基因;利用重叠引物延伸法(splicing by overlap extension,SOE)将轻重链可变区基因连接,并引入连接肽(Linker)编码序列,构建VH-Linker-VL结构的单链抗体(ScFv)基因,将其克隆到原核表达载体pET-his中,转化BL21(DE3)plysS细胞,IPTG诱导表达;获得的目的蛋白经纯化后,用SDS-PAGE与Western blotting对目的蛋白进行鉴定,间接ELISA、竞争ELISA和免疫荧光法检测目的蛋白的活性。结果克隆的VH基因长度为351bp,属于鼠抗体可变区重链基因家族I(B)亚群;VL基因长度为339bp,属于鼠抗体可变区轻链基因家族I亚群;SOE法克隆的单链抗体基因为750bp;构建的含原核表达载体的菌株经IPTG诱导后,SDS-PAGE及Western blotting法检测到Mr32000的目的蛋白(表达的ScFv);ScFv纯化后,经免疫荧光法、间接与竞争ELISA法检测到该ScFv蛋白具有生物结合活性。结论成功地克隆了抗人红细胞H抗原单克隆抗体VH与VL基因和ScFv基因,构建ScFv基因的表达载体,实现了ScFv在大肠杆菌BL21(DE3)plysS细胞中的活性表达,为基于红细胞H抗原的免疫检测技术建立奠定了基础。 展开更多
关键词 红细胞 H抗原 单链抗体 原核表达
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二硫键稳定单链抗体融合PE38免疫毒素的构建及活性分析 被引量：10
17
作者 王建丽 郑玉玲 +3 位作者 王保莉 郭霭光 马茹 姜永强 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期74-77,共4页
目的构建二硫键稳定单链抗体(B3dsscFv)融合PE38原核表达载体,实现其高效表达,并对初步纯化后的复性产物的稳定性、对肿瘤细胞的结合和杀伤活性进行测定。方法重叠PCR连接B3抗体的VH和VL片段,并将PCR产物克隆至pET22b表达载体(B3dsscFv-... 目的构建二硫键稳定单链抗体(B3dsscFv)融合PE38原核表达载体,实现其高效表达,并对初步纯化后的复性产物的稳定性、对肿瘤细胞的结合和杀伤活性进行测定。方法重叠PCR连接B3抗体的VH和VL片段,并将PCR产物克隆至pET22b表达载体(B3dsscFv-pET22b)。测序正确的PE38基因片段经酶切连接至B3dsscFv-pET22b,构建B3dsscFv-PE38-pET22b表达载体。IPTG诱导转化菌,将表达的包涵体进行变性、复性后用阳离子柱Q-Sepharose进行了初步纯化,ELISA测定此融合蛋白中单链抗体的结合活性及其在37℃的稳定性,并采用MTT法检测其对B3抗原表面阳性细胞HT-29的杀伤作用。结果双酶切鉴定表明成功地构建了B3dsscFv-PE38-pET表达载体,表达产物以包涵体形式存在,占总蛋白量的45%左右。复性后的B3dsscFv-PE38保持单链抗体的结合活性,并且对结肠癌HT-29细胞具有一定的杀伤作用,最大杀伤率可达96%。该蛋白在37℃孵育16h后,仍能保持大部分活性。结论所获B3dsscFv-PE38免疫毒素具备导向和杀伤肿瘤细胞的双重功能和良好的稳定性,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。 展开更多
关键词 单克隆抗体 B3 二硫键稳定单链抗体 PE38 肿瘤导向
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抗人CD19单链抗体基因的构建、表达及功能测定 被引量：12
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作者 陈森 饶青 +1 位作者 王建祥 王敏 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期686-691,共6页
采用RTPCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD19单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL可变区基因,再通过重叠延伸拼接(spliceoverlapextension)PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗人CD19单链抗体(抗CD19... 采用RTPCR方法从分泌抗人类白细胞表面分化抗原CD19单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL可变区基因,再通过重叠延伸拼接(spliceoverlapextension)PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗人CD19单链抗体(抗CD19ScFv)基因。将其克隆至表达载体PET28a并在大肠杆菌中表达。SDSPAGE和Westernblot分析结果表明,抗CD19ScFv在BL21(DE3)菌中获得表达,重组蛋白的相对分子量为27kD,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体,镍柱亲和层析纯化和体外复性过程,获得了高纯度的单链抗体片段。流式细胞分析结果证实抗CD19ScFv可与人类白细胞表面的分化抗原CD19结合,保留了鼠源性单抗与CD19结合活性。抗人CD19ScFv的构建与表达,为下一步针对B淋巴系统恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 CD19 单链抗体(ScFv) 原核表达
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抗肝癌单链抗体融合TNFα导向作用的初步实验研究 被引量：15
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作者 孙志伟 刘彦仿 +1 位作者 马兰花 李国华 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期69-72,共4页
目的获得有效果的抗肝癌基因工程单链免疫细胞因子（ＴＮＦα）。方法将抗肝癌单克隆抗体（ｍＡｂ）ＨＡｂ２５的单链抗体（ｓｃＦｖ２５）与人ＴＮＦα基因偶联，构建抗肝癌免疫细胞因子（ｓｃＦｖ２５－ＴＮＦα），亚克隆人原核ＧＳ... 目的获得有效果的抗肝癌基因工程单链免疫细胞因子（ＴＮＦα）。方法将抗肝癌单克隆抗体（ｍＡｂ）ＨＡｂ２５的单链抗体（ｓｃＦｖ２５）与人ＴＮＦα基因偶联，构建抗肝癌免疫细胞因子（ｓｃＦｖ２５－ＴＮＦα），亚克隆人原核ＧＳＴ融合表达载体ｐＧＥＸ ４Ｔ－１中，在大肠杆菌中进行表达。对肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１涂片进行间接免疫荧光染色，测定纯化后目的蛋白的活性。通过对荷肝癌（ＳＭＭＣ－７７２１）裸鼠进行的初步抑瘤实验，检测ｓｃＦｖ２５－ＴＮＦα的导向治疗效果。结果ｓｃＦｖ２５－ＴＮＦα具有与亲本抗体ＨＡｂ２５类似的抗原结合特异性。 ｓｃＦｖ２５－ＴＮＦα对荷肝癌裸鼠体内直径２ｍｍ左右的肿瘤具有明确的导向杀伤作用，达到３／３完全缓解，明显强于ＴＮＦα对照组，该组有效者只有２／３，且无完全缓解。结论ｓｃＦｖ２５－ＴＮＦα为具有一定效果的抗肝癌双功能抗体。 展开更多
关键词 肝细胞肝癌 基因工程 单链抗体 细胞因子 实验研究 导向治疗
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乙肝病毒核心抗原单链抗体细胞内免疫抗乙肝病毒基因治疗研究 被引量：19
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作者 陆荫英 王琳 +5 位作者 刘妍 于敏 李克 王业东 张玲霞 成军 《世界华人消化杂志》 CAS 2002年第7期765-769,共5页
目的:研究乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)人源单链抗体(ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒(HBV)基因治疗的作用。方法:用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBcAg人源可变区单链抗体,聚合酶链反应(PCR)法和基因重组技术体外扩增HBcAg单链抗体基... 目的:研究乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)人源单链抗体(ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒(HBV)基因治疗的作用。方法:用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBcAg人源可变区单链抗体,聚合酶链反应(PCR)法和基因重组技术体外扩增HBcAg单链抗体基因,并构建表达HBcAgScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-HBcAg,转染PA317细胞,逆转录PCR(RT-PCR)方法验证细胞培养液上清分泌的假病毒颗粒中HBcAg ScFv的表达;将假病毒颗粒感染2.2.15细胞,酶联免疫吸附法(ELISA)检测其上清HBsAg和HBeAg,定量检测HBV DNA。结果:成功筛选出HBcAg ScFv,PCR扩增出750bp的全基因,构建HBcAg ScFv基因的逆转录病毒载体,转染PA317细胞,在上清中检测出含HBcAg ScFv假病毒颗粒的存在,上清感染2.2.15细胞后第3、5、7、14天,HBsAg、HBeAg逐渐下降,到14d时HBsAg已变为阴性,DNA定量检测无明显变化。结论:HBcAg ScFV能成功地在逆转录病毒载体中表达,并有抑制HBsAg、HBeAg表达的作用。 展开更多
关键词 乙肝病毒核心抗原 单链抗体 细胞内免疫 抗乙肝病毒 基因治疗
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