SD大鼠乳鼠原代皮质神经元和小胶质细胞同时提取并培养的实验方法

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作者 何龙才 宋文学 +5 位作者 明江 陈光唐 王军浩 廖益东 崔君拴 徐卡娅 《中国组织工程研究》 CAS 北大核心 2025年第7期1395-1400,共6页

背景:原代皮质神经元和小胶质细胞在探索神经系统疾病细胞疗法中起着至关重要的作用,而目前获得2种细胞的方法大多较繁琐,需分别单独提取。因此找到一种便捷、快速可同时提取2种细胞的方法十分关键。目的:探索一种新型同时提取原代皮质... 背景:原代皮质神经元和小胶质细胞在探索神经系统疾病细胞疗法中起着至关重要的作用,而目前获得2种细胞的方法大多较繁琐,需分别单独提取。因此找到一种便捷、快速可同时提取2种细胞的方法十分关键。目的:探索一种新型同时提取原代皮质神经元及小胶质细胞的方法。方法:取24 h内新生SD大鼠乳鼠,将大脑取出放入装有DMEM的培养皿中,去除软脑膜后备用。同一脑组织,先提取原代神经元,再将剩余脑组织用于提取小胶质细胞,整个过程在冰上操作。原代皮质神经元提取培养步骤:镊子夹取2.0-3.0 mm厚度大脑皮质组织置于培养皿,用木瓜蛋白酶消化20 min,中止消化后吹打组织呈互相粘连的组织悬液,吸上清细胞悬液,过滤、分装到15 mL离心管中,离心并重悬后将细胞接种于左旋多聚赖氨酸包被的6孔板爬片上放入细胞培养箱,每隔1 d观察神经元形态,第7天进行MAP2和β-Tubulin免疫荧光染色鉴定。小胶质细胞提取培养步骤:夹取上一步取皮质后剩余脑组织,厚度8-10 mm,置于培养皿,用胰酶消化20 min,中止消化后吹打组织呈匀浆,然后将匀浆转移到培养瓶中培养,第14天将培养瓶封口后进行恒温水平摇床振荡2 h,小胶质细胞脱落于上清中;取纯化后的小胶质细胞继续培养3 d进行Iba1免疫荧光染色鉴定。结果与结论:(1)神经元培养24 h后贴壁、胞体变大,部分神经元长出突触;培养到第3,5天时胞体进一步增大,大部分神经元已呈突触形态,部分神经元成团生长;第7天时,神经元突触延长增粗并互相连接成网。经β-Tubulin、MAP2免疫荧光染色鉴定为神经元。(2)小胶质细胞培养第1天换液后可见细胞贴壁生长;第3,5,7天时细胞密度均较小,细胞形态呈高亮椭圆或圆形,但已基本成团块状生长于其他细胞上层;第10天时小胶质细胞密度明显增大;第14天时小胶质细胞呈致密团块状生长于其他细胞上层,此时可进行分离纯化。取分离纯化后细胞再培养至第3天,经Iba1免疫荧光鉴定为小胶质细胞,且纯度大于95%。(3)结果表明,经此法提取并培养获得的原代皮质神经元和小胶质细胞纯度高、形态好、成活率高。 展开更多

关键词 原代皮质神经元 小胶质细胞 SD大鼠 细胞提取 细胞培养

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HIF-1α在缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元necroptosis中的表达

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作者 张翠翠 陈巍巍 +1 位作者 徐兴顺 耿德勤 《徐州医学院学报》 CAS 2011年第5期293-296,共4页

目的 探讨低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）是否参与缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元necroptosis.方法 原代皮质神经元培养14天,予caspase抑制剂Z-VAD-FMK（20 μmol/L）预保护30 min,缺糖缺氧2 h,再灌注0、2、6... 目的 探讨低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）是否参与缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元necroptosis.方法 原代皮质神经元培养14天,予caspase抑制剂Z-VAD-FMK（20 μmol/L）预保护30 min,缺糖缺氧2 h,再灌注0、2、6、12、24、48 h,进行LDH测定;RT-PCR测HIF-1α RNA表达;Western blot检测总HIF-1α蛋白表达情况;分别提取细胞质和细胞核蛋白,Western blot分别检测胞质、胞核内HIF-1α蛋白表达情况.结果 caspase抑制剂Z-VAD-FMK预作用30 min、缺糖缺氧2 h、再灌注2 h后培养基中LDH增加（P＜0.05）,再灌注12 h达高峰;缺糖缺氧后HIF-1α RNA表达无变化（P＞0.05）;HIF-1α总蛋白表达增加（P＜0.05）,再灌注12 h达高峰;再灌注6 h时细胞质HIF-1α蛋白表达达高峰（P＜0.05）,随后降低;再灌注12 h时,细胞核HIF-1α蛋白表达达高峰（P＜0.05）,随后降低.结论 HIF-1α参与缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元necroptosis. 展开更多

关键词 低氧诱导因子-1Α NECROPTOSIS 缺糖缺氧 原代皮质神经元

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TLR3在poly(I:C)-LMW预处理后缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元的表达意义 被引量：4

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作者 宋璞 崔桂云 +3 位作者 陈伟 赵秋宸 花放 沈霞 《中国实用神经疾病杂志》 2012年第8期1-5,共5页

目的观察TRL3激动剂poly(I:C)-LMW预处理对原代皮质神经元Toll样受体3(TLR3)表达的影响,探讨TLR3在缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元损伤中的作用。方法取体外培养7d的大鼠原代皮质神经元细胞,对细胞分别予以正常条件下培养(空白对照组);... 目的观察TRL3激动剂poly(I:C)-LMW预处理对原代皮质神经元Toll样受体3(TLR3)表达的影响,探讨TLR3在缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元损伤中的作用。方法取体外培养7d的大鼠原代皮质神经元细胞,对细胞分别予以正常条件下培养(空白对照组);缺糖缺氧2h,复糖复氧24h(OGD组);TRL3激动剂预处理12h(激动剂组);TRL3激动剂预处理12h后缺糖缺氧2h,复糖复氧24h(激动剂+OGD组)。免疫荧光法观察各组细胞生长状态,分别以Western blot法、RT-PCR法测定TLR3蛋白及TLR3mRNA的表达情况。结果 与空白对照组相比,激动剂及缺氧复氧处理方法均诱导原代皮质神经元TLR3、TLR3mRNA表达增强(P<0.05);激动剂预处理后,与OGD组相比,激动剂+OGD组神经元细胞状态较好,数目较多(P<0.05)。结论 TLR3参与缺糖缺氧诱导的原代皮质神经元的损伤过程,激动剂可减轻神经元缺糖缺氧后损伤。 展开更多

关键词 Toll样受体3(TRL3) poly(I:C)-LMW 激动剂 原代皮质神经元 缺糖缺氧

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miR-132在氧糖剥夺诱导原代皮质神经元缺血损伤中的作用 被引量：5

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作者 杨利强 徐伟杰 关欣 《中风与神经疾病杂志》 CAS 2020年第8期676-679,共4页

目的探讨miR-132在氧糖剥夺诱导原代皮质神经元缺血损伤中的作用。方法体外培养原代皮质神经元细胞,构建氧糖剥夺(OGD/R)模型模拟缺血再灌注损伤。细胞随机分为假手术组(Sham)、OGD组、慢病毒对照组(LV-control)、miR-132低表达组(LV-an... 目的探讨miR-132在氧糖剥夺诱导原代皮质神经元缺血损伤中的作用。方法体外培养原代皮质神经元细胞,构建氧糖剥夺(OGD/R)模型模拟缺血再灌注损伤。细胞随机分为假手术组(Sham)、OGD组、慢病毒对照组(LV-control)、miR-132低表达组(LV-anti-miR-132)、miR-132过表达组(LV-miR-132)。采用CCK-8、real-time PCR、Western blot等技术研究miR-132对OGD损伤原代皮质神经元的影响和机制。结果miR-132在OGD诱导的缺血损伤模型中表达水平明显降低(P<0.05);在OGD诱导原代皮质神经元缺血损伤过程中,降低miR-132的表达,会加剧OGD损伤明显减少细胞活力;增加miR-132表达水平,会减轻OGD损伤提升细胞存活率。Western blot结果显示,过表达miR-132会上调突触相关蛋白Synapsin-1、PSD95蛋白表达水平。结论过表达miR-132通过上调突触相关蛋白Synapsin-1、PSD95的表达水平改善OGD诱导的缺血损伤,提高原代皮质神经元的存活率。 展开更多

关键词 miR-132 氧糖剥夺 缺血损伤 原代皮质神经元

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过表达CYLD对氧糖剥夺/复氧大鼠原代皮质神经元中NF-κB信号通路的影响 被引量：1

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作者 朱君 胥虹贝 +2 位作者 周雪灵 卢文豪 罗勇 《中国细胞生物学学报》 CAS CSCD 2019年第8期1551-1557,共7页

脑卒中是目前导致我国人口寿命缩短的最主要原因之一。在缺血性脑卒中的局灶性缺血/再灌注后,受损脑组织中存在多种复杂的病理生理机制,核因子-κB(nuclear factor kappaB, NF-κB)信号通路参与的炎症反应是重要机制之一。相关研究显示... 脑卒中是目前导致我国人口寿命缩短的最主要原因之一。在缺血性脑卒中的局灶性缺血/再灌注后,受损脑组织中存在多种复杂的病理生理机制,核因子-κB(nuclear factor kappaB, NF-κB)信号通路参与的炎症反应是重要机制之一。相关研究显示,头帕肿瘤综合征蛋白(cylindromatosis, CYLD)可以参与NF-κB信号通路的调节。在脑缺血/再灌注损伤中,上调CYLD表达水平,对氧糖剥夺/复氧后NF-κB信号通路是否存在影响?如何影响?尚未见明确报道,这需要我们进一步探究。该研究通过上调CYLD在SD大鼠原代皮质神经元中的表达水平,观察其对氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)后神经元中NF-κB信号通路的影响。使用过表达慢病毒感染体外培养的原代皮质神经元,采用免疫荧光实验鉴定神经元, Western blot及RT-qPCR验证CYLD的过表达情况, CCK-8实验检测细胞活力, Western blot检测p-IκBα的蛋白表达情况, RT-qPCR检测NF-κB p65的mRNA表达情况。结果显示,过表达CYLD慢病毒可有效提高神经元中CYLD的表达水平;过表达CYLD后,较对照组相比,神经元在氧糖剥夺/复氧处理后的活力有所增高, p-IκBα的表达水平有所下降,同时NF-κB p65的m RNA表达水平也明显降低。研究结果表明,在原代皮质神经元中过表达CYLD,能减轻氧糖剥夺/再复氧对神经元的损伤、抑制NF-κB信号通路的激活。 展开更多

关键词 CYLD NF-ΚB信号通路 原代皮质神经元 氧糖剥夺/复氧

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盐酸右美托咪定对丙泊酚诱导原代培养皮质神经元凋亡的影响 被引量：3

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作者 李建立 郭洪霞 +2 位作者 梁巍 容俊芳 刘锐 《医药导报》 CAS 2016年第11期1164-1168,共5页

目的探讨盐酸右美托咪定对丙泊酚诱导原代培养皮质神经元凋亡的影响及其机制。方法将原代培养7 d的大鼠皮质神经元随机分为溶剂对照组(给予等体积20%脂肪乳)、丙泊酚组(丙泊酚终浓度500μmol·L^(-1))和盐酸右美托咪定+丙泊酚组(盐... 目的探讨盐酸右美托咪定对丙泊酚诱导原代培养皮质神经元凋亡的影响及其机制。方法将原代培养7 d的大鼠皮质神经元随机分为溶剂对照组(给予等体积20%脂肪乳)、丙泊酚组(丙泊酚终浓度500μmol·L^(-1))和盐酸右美托咪定+丙泊酚组(盐酸右美托咪定终浓度分别为0.001,0.01,0.1,1μmol·L^(-1),丙泊酚终浓度500μmol·L^(-1)),药物处理12 h后,噻唑蓝(MTT)法检测神经元存活率,光学显微镜观察神经元形态,Hoechst33258核染色法检测神经元凋亡率,罗丹明染色检测神经元线粒体膜电位。结果与溶剂对照组比较,丙泊酚组神经元存活率显著下降(P<0.05)。与丙泊酚组比较,盐酸右美托咪定各剂量组神经元存活率升高(P<0.01),作用呈剂量依赖性。与溶剂对照组比较,光镜下丙泊酚组神经元数量明显减少,胞体立体感消失,细胞轮廓不清,神经元轴突断裂。与丙泊酚组比较,盐酸右美托咪定各剂量组神经元形态学损伤明显改善。与溶剂对照组比较,丙泊酚组神经元凋亡率显著上升(P<0.01),线粒体膜电位显著下降(P<0.01)。与丙泊酚组比较,盐酸右美托咪定各剂量组神经元凋亡率显著下降(P<0.01),线粒体膜电位显著上升(P<0.01)。结论盐酸右美托咪定可通过抑制神经元线粒体膜电位下降,减轻丙泊酚所致原代培养皮质神经元凋亡。 展开更多

关键词 右美托咪定 盐酸 丙泊酚 凋亡 皮质神经元 原代培养 线粒体膜电位

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细胞自噬缓解氧-糖剥夺诱导原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤 被引量：1

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作者 陈璐勔 罗艳琳 +3 位作者 赵丽 韩松 李淑娟 李俊发 《基础医学与临床》 CSCD 北大核心 2014年第12期1611-1615,共5页

目的在离体细胞水平,探讨氧-糖剥夺(OGD)致原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤过程中,细胞自噬的变化情况和可能作用。方法出生24 h内C57BL/6J乳鼠脑皮质神经元原代培养7 d后,分为常氧(Nor.)、15、30、60、90和120 min OGD后24 h复糖复氧... 目的在离体细胞水平,探讨氧-糖剥夺(OGD)致原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤过程中,细胞自噬的变化情况和可能作用。方法出生24 h内C57BL/6J乳鼠脑皮质神经元原代培养7 d后,分为常氧(Nor.)、15、30、60、90和120 min OGD后24 h复糖复氧等6组,每组n=6;免疫印迹(Western blot)法检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达和LC3Ⅱ/Ⅰ比值;借助MTT比色法和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,检测神经元的损伤;用细胞自噬下游抑制剂巴弗洛霉素A1(Baf A1100 nmol/L)抑制自噬后,观察神经元的损伤。结果与对照组相比,随OGD时间的延长,自噬相关蛋白Beclin-1表达水平和LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著升高,30 min达到峰值,之后略有回降(P<0.05);在OGD处理30和60 min致使神经元显著损伤的基础上,细胞自噬抑制剂Baf A1可明显加重60 min OGD处理神经元的损伤和提高LC3Ⅱ/Ⅰ的比值(P<0.05)。结论 OGD可诱发原代培养小鼠脑皮质神经元自噬发生,且细胞自噬可缓解OGD处理皮质神经元的缺血损伤。 展开更多

关键词 原代培养脑皮质神经元 氧-糖剥夺(OGD) 细胞自噬 巴弗洛霉素A1(BafA1) 缺血性损伤

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去泛素化酶在皮质神经元缺糖缺氧再灌注损伤后坏死样凋亡中的表达 被引量：2

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作者 冯涛 丁红梅 耿德勤 《中华行为医学与脑科学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期692-695,共4页

目的 探讨去泛素化酶（Cylindromatosis,CYLD）在皮质神经元中的定位及缺糖缺氧再灌注损伤后神经元坏死样凋亡中的表达变化.方法 ①皮质神经元培养6d,免疫荧光观察4,6-联脒-2-苯基吲哚（4＇,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）核染及神... 目的 探讨去泛素化酶（Cylindromatosis,CYLD）在皮质神经元中的定位及缺糖缺氧再灌注损伤后神经元坏死样凋亡中的表达变化.方法 ①皮质神经元培养6d,免疫荧光观察4,6-联脒-2-苯基吲哚（4＇,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）核染及神经元特异性标志物β3-tubulin表达,验证培养神经元的纯度.②原代皮质神经元细胞培养14 d,通过成熟神经元特异性标志物NeuN鉴定神经元,DAPI染核,同时用免疫荧光共定位观察目的蛋白CYLD在神经元内的定位.③培养14 d的神经元首先被分为正常对照组（Control组）,无糖Earle＇s平衡盐组（EBSS组）,Dmso组缺糖缺氧（OGD）复灌不同时间组（0h、2h、6h、8h、12 h）组.预给予广谱抗凋亡抑制剂（zVAD-fmk,zVAD） 20 μmol/L、30 min,缺糖缺氧2h,复灌不同时间点,通过Western、比色法检测神经元CYLD蛋白水平变化、乳酸脱氢酶（LDH）水平.④随后神经元被分为正常对照、OGD组,给予缺糖缺氧2h,复灌8h,通过Western blot观察细胞浆、核内CYLD蛋白表达变化情况.结果 CYLD在神经元中定位于细胞核、胞浆,胞浆CYLD随着缺糖缺氧后复灌时间的延长,8h到达高峰（P＜0.05）,与LDH[分别为Control组（1.00±0.00）,EBSS组（1.07 ±0.03）,DMSO组（1.09±0.03）,0h组（1.40±0.12）,2h组（1.74±0.08）,6h组（2.25±0.12）,8h组（2.97±0.15）,12 h组（3.01±0.08）]水平变化一致（P＜0.05）,随后降低；细胞核内CYLD蛋白在缺糖缺氧2h,复灌8h后无明显变化（P＞0.05）.结论 去泛素化酶CYLD在胞浆中参与皮质神经元缺糖缺氧再灌注损伤后的坏死样凋亡,下调其表达可能保护脑缺血再灌注损伤. 展开更多

关键词 去泛素化酶 坏死样凋亡 缺糖缺氧 原代皮质神经元

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血清反应因子参与皮质神经元缺糖缺氧诱导坏死样凋亡的实验研究 被引量：1

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作者 冯涛 丁红梅 +1 位作者 董红艳 耿德勤 《中国临床神经科学》 2013年第3期271-276,共6页

目的探讨血清反应因子(SRF)在皮质神经元中的定位及缺糖缺氧(OGD)再灌注损伤后神经元坏死样凋亡中的作用。方法皮质神经元:①培养第6天,免疫荧光观察4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)核染及β3-tubulin神经元特异性标志物表达,验证培养神经元... 目的探讨血清反应因子(SRF)在皮质神经元中的定位及缺糖缺氧(OGD)再灌注损伤后神经元坏死样凋亡中的作用。方法皮质神经元:①培养第6天,免疫荧光观察4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)核染及β3-tubulin神经元特异性标志物表达,验证培养神经元的纯度;②培养第14天,二氨基联苯胺(DAB)显色法观察SRF定位;③培养第6天,给予慢病毒(HIV病毒载体)干扰SRF表达;④培养第14天,制作OGD模型(OGD 2 h,复灌8 h),预给予广谱抗凋亡抑制剂(zVAD-fmk)20μmol.L-130 min。将细胞分为:正常对照组(对照组);OGD/zVAD-fmk/SRF慢病毒阴性对照组(OZ-组);ODG/zVAD-fmk/SRF慢病毒阳性组(OZ+组)。经比色法、Western blot等方法观察SRF蛋白和乳酸脱氢酶(LDH)水平的变化。结果 SRF在神经元中定位于细胞核;经SRF干扰后OZ+组SRF蛋白水平下调(P<0.05);不同处理组神经元分泌LDH水平与SRF蛋白水平变化一致(P<0.05)。结论 SRF参与皮质神经元缺血/再灌注损伤后神经元坏死样凋亡,定位于胞核。 展开更多

关键词 血清反应因子 坏死样凋亡 缺糖缺氧 原代皮质神经元

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小鼠原代神经元细胞狂犬病病毒滴度测定 被引量：1

10

作者 单晶辉 王心蕊 +3 位作者 关振宏 李宁 宋艳 张茂林 《中国公共卫生》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期572-574,共3页

目的探索利用小鼠原代神经元细胞测定狂犬病病毒(rabies virus,RV)滴度的可行性。方法分离培养小鼠大脑皮质原代神经元细胞,接种100小鼠脑内接种半数致死量(MICLD50)的标准攻击强毒(CVS)毒株,通过免疫荧光和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)... 目的探索利用小鼠原代神经元细胞测定狂犬病病毒(rabies virus,RV)滴度的可行性。方法分离培养小鼠大脑皮质原代神经元细胞,接种100小鼠脑内接种半数致死量(MICLD50)的标准攻击强毒(CVS)毒株,通过免疫荧光和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测其感染性,并在此基础上在原代神经元细胞上进行了该毒株的细胞半数感染量(CCID50)测定。结果成功制备了小鼠大脑皮质原代神经元细胞;原代神经细胞培养物接种CVS 96h后,用抗微管相关蛋白质(MAP2)抗体和抗RV阳性血清作为一抗并经荧光抗体染色后,在胞体和突起上均有神经元特异性和RV特异性着染;在共聚焦显微镜下,当相同的细胞部位上出现红色和绿色交迭时呈现粉色斑点,免疫荧光证实原代神经细胞可被CVS感染,同时RT-PCR得到1 770 bp左右的目的条带,说明其被CVS感染;该原代细胞上所测定的CVS病毒滴度为104.5CCID50/0.1 mL,而该病毒的原始滴度为104.5MICLD50/0.03 mL。结论小鼠脑原代神经元细胞上测定的CVS株的病毒滴度与通过脑内接种法测定的滴度相同。 展开更多

关键词 狂犬病病毒 大脑皮质原代神经元 小鼠脑内接种半数致死量 细胞半数感染量

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RIP3在necroptosis信号通路中的胞内定位

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作者 陈巍巍 张翠翠 +1 位作者 徐兴顺 耿德勤 《徐州医学院学报》 CAS 2011年第5期297-299,共3页

目的 研究necroptosis信号通路中受体相互作用蛋白3（RIP3）的胞内定位.方法 SD大鼠原代皮质神经元细胞培养12天,zVAD 20 μmol/L预处理30 min,TNFα 30 ng/ml处理不同时间,Western blot检测胞质、胞核中RIP3蛋白水平,结合免疫荧光观察R... 目的 研究necroptosis信号通路中受体相互作用蛋白3（RIP3）的胞内定位.方法 SD大鼠原代皮质神经元细胞培养12天,zVAD 20 μmol/L预处理30 min,TNFα 30 ng/ml处理不同时间,Western blot检测胞质、胞核中RIP3蛋白水平,结合免疫荧光观察RIP3的胞内定位.结果 随着TNFα作用时间的延长,胞质、胞核中RIP3蛋白水平均呈上升趋势,胞质中RIP3蛋白水平在8 h达高峰,随后下降,胞核中RIP3蛋白水平在12 h达高峰,即在12 h出现核转位的高峰（P＜0.05）.结论 正常细胞中RIP3存在于胞质,necroptosis时发生核转位. 展开更多

关键词 受体相互作用蛋白3 NECROPTOSIS 原代皮质神经元

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