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气单胞菌属低温淀粉酶基因改造与原核表达
1
作者 楚敏 史应武 +3 位作者 顾美英 杨红梅 霍向东 张志东 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期479-484,共6页
【目的】获取低温淀粉酶基因,分析其相关功能,为工业生产上的应用提供参考。【方法】以气单胞菌(Aeromonas)LA77为出发菌株克隆低温α-淀粉酶基因,以BL-21(DE3)为宿主菌进行克隆。分析其它已知气单胞菌属低温α-淀粉酶基因同源性,设计... 【目的】获取低温淀粉酶基因,分析其相关功能,为工业生产上的应用提供参考。【方法】以气单胞菌(Aeromonas)LA77为出发菌株克隆低温α-淀粉酶基因,以BL-21(DE3)为宿主菌进行克隆。分析其它已知气单胞菌属低温α-淀粉酶基因同源性,设计特异引物,PCR扩增获得C13片段,将其克隆到pMAL-2X,转化到BL-21(DE3)中,筛选蓝白斑,验证PCR及EcoRⅠ和HindⅢ的双酶切,获得高效表达生物工程菌株pMAL-2X-C13。设计定点突变引物,以pMAL-2X-C13为模板,获得低温淀粉酶基因突变株三株C19、C29、C43。【结果】表达蛋白的分子大小为114kD,突变菌株C19蛋白表达量均高于pMAL-2X-C13。【结论】低温淀粉酶基因突变株C19比原始菌株pMAL-2X-C13淀粉酶基因蛋白表达量更高。 展开更多
关键词 气单胞菌属 α-低温淀粉酶 基因改造 原核表达
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斑点叉尾鮰ZBTB38的原核表达、多克隆抗体制备及应用
2
作者 张世勇 刘洪岩 +3 位作者 钟立强 赵彦华 王明华 陈校辉 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期654-661,共8页
为获得斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)ZBTB38的多克隆抗体,并研究其在性腺中的表达情况,将斑点叉尾鮰zbtb38基因部分序列经密码子优化后连接至pET32a(+)载体,构建重组质粒pET32a(+)-zbtb38,再转入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细... 为获得斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)ZBTB38的多克隆抗体,并研究其在性腺中的表达情况,将斑点叉尾鮰zbtb38基因部分序列经密码子优化后连接至pET32a(+)载体,构建重组质粒pET32a(+)-zbtb38,再转入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞BL21(DE3)中诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western blot)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)等技术进行鉴定。用纯化后的重组蛋白制备兔抗斑点叉尾鮰ZBTB38多克隆抗体,通过酶联免疫吸附(ELISA)和Western blot技术检测抗体效价及其特异性,最后采用Western blot方法检测ZBTB38在性腺中的表达情况,并使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对检测结果进行验证。结果表明,制备的兔抗斑点叉尾鮰ZBTB38多克隆抗体效价可达1:(5.12×10^(5)),能够特异性识别斑点叉尾鮰性腺组织中表达的ZBTB38蛋白,其中精巢组织中的表达水平显著高于卵巢,Western blot与qRT-PCR检测结果较为一致。综上所述,研究成功制备了斑点叉尾鮰ZBTB38的多克隆抗体,为下一步深入研究斑点叉尾鮰zbtb38基因的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 斑点叉尾鮰 锌指蛋白 原核表达 多克隆抗体 性腺
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LHCGR胞外结构域蛋白的生信分析、原核表达及纯化
3
作者 王蒙蒙 刘雨然 +7 位作者 杨慧莹 张梦圆 王燕 朱晓庆 罗燕 邵永斌 连科迅 谷新利 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第2期150-158,共9页
目的为获得小鼠LHCGR胞外结构域蛋白(LHCGR-1),分析其结构及理化性质,为今后研究该蛋白功能及筛选与之相互作用的小分子化合物奠定基础。方法根据NCBI中小鼠LHCGR氨基酸序列合成目的基因Lhcgr-1,经生物信息学分析后,将该基因插入至表达... 目的为获得小鼠LHCGR胞外结构域蛋白(LHCGR-1),分析其结构及理化性质,为今后研究该蛋白功能及筛选与之相互作用的小分子化合物奠定基础。方法根据NCBI中小鼠LHCGR氨基酸序列合成目的基因Lhcgr-1,经生物信息学分析后,将该基因插入至表达载体pET-28a(+),并转化至BL21(DE3)感受态细胞中;经IPTG诱导,表达重组蛋白pET-28a-LHCGR-1,利用SDS-PAGE和Western Blot进行鉴定,之后对该蛋白进行纯化,并通过分子对接技术预测该蛋白与LH、CG的相互作用。结果预测LHCGR-1蛋白分子量为40749.08,由367个氨基酸组成,等电点理论值为5.47;氨基酸序列中有29个丝氨酸位点、10个苏氨酸位点和5个酪氨酸位点;成功构建了表达载体pET-28a-LHCGR-1并获得纯化的目的蛋白;分子对接结果表明目的蛋白可以与LH、CG通过多种相互作用,形成稳定的复合物,有利于其发挥原有的生物学功能。结论成功构建了小鼠胞外结构域蛋白LHCGR-1在大肠杆菌内的原核表达体系并获得了纯化蛋白,分子对接预测该蛋白具有生物学功能,提示该蛋白可以用于后续研究。 展开更多
关键词 LHCGR 原核表达 蛋白质纯化 生信分析 分子对接
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棉花GhMYB42基因的克隆及原核表达
4
作者 李晨宇 足木热木·吐尔逊 +3 位作者 李晓荣 杨洋 李波 于月华 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2024年第1期48-54,共7页
MYB转录因子对棉花的生长发育起到重要作用,而GhMYB42为MYB家族之一的转录因子同样具有一定的研究价值,因此,从棉花中克隆了GhMYB42基因的编码序列,并构建了原核表达载体。利用生物信息学方法对GhMYB42的核苷酸序列及氨基酸序列进行了分... MYB转录因子对棉花的生长发育起到重要作用,而GhMYB42为MYB家族之一的转录因子同样具有一定的研究价值,因此,从棉花中克隆了GhMYB42基因的编码序列,并构建了原核表达载体。利用生物信息学方法对GhMYB42的核苷酸序列及氨基酸序列进行了分析,通过Gataway BP和LR反应,将GhMYB42基因的编码序列构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,通过设置不同的IPTG诱导条件来确定IPTG诱导蛋白的最佳条件,最后利用Western Blot鉴定重组蛋白。结果显示,GhMYB42(XP_016732693.1)全长序列1508 bp,编码区长792 bp,编码263个氨基酸,预测分子量约为29.534 ku,等电点为5.18。氨基酸序列比对分析发现,MYB转录因子的序列相似率为80.62%,且GhMYB42蛋白N末端含有2个串联的SANT结构域,是一个R2R3转录因子。进化树分析结果显示,陆地棉MYB42蛋白与陆地棉中另一MYB蛋白(XP_012439547.1)相似性最高并在一个分支上。蛋白诱导时由于各个试验梯度结果差别不明显,因此,选择的条件为IPTG的终浓度0.2 mmol/L,温度37℃,时间3 h,蛋白溶解的温度和时间为37℃诱导3 h。Western Blot结果表明,重组蛋白的大小正确,最终成功获得了大小为55.54 ku的GhMYB42重组蛋白,后续将对该重组蛋白进行纯化及深入研究转录因子GhMYB42的功能。 展开更多
关键词 陆地棉 GhMYB42 克隆 序列分析 原核表达
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鸡FGL2基因的克隆分析及原核表达
5
作者 郭亚格 刘佳隆 +7 位作者 齐志颖 何雷 贾艳艳 陈建 陈松彪 廖成水 丁轲 余祖华 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2024年第3期11-18,39,共9页
【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-... 【目的】克隆鸡纤维蛋白原样蛋白2(fibrinogen-like protein 2,FGL2)基因,并进行生物信息学分析和原核表达,为鸡FGL2蛋白的功能研究奠定基础。【方法】采用逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)技术扩增鸡FGL2基因,克隆至pMD19-T载体,测序后对鸡FGL2基因及其编码的蛋白进行生物信息学分析。构建原核表达质粒pET-32a-FGL2,将其转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。【结果】成功克隆了鸡FGL2基因的CDS区,序列全长为1320 bp,编码439个氨基酸。生物信息学分析显示,鸡FGL2氨基酸与火鸡、雉鸡、珍珠鸡、鹌鹑等禽类的同源性高,达96%以上;与哺乳类动物的同源性较低,其中与犬的同源性仅有64.8%。FGL2蛋白由439个氨基酸组成,理论分子质量为50.24 ku,分子式为C_(2221)H_(3451)N_(615)O_(673)S_(22),理论等电点(pI)为8.63,为不稳定的亲水性分泌型蛋白,无跨膜区。成功构建了原核表达质粒pET-32a-FGL2,其在大肠杆菌BL21(DE3)可表达以包涵体形式为主的FGL2融合蛋白,分子质量约为70 ku。【结论】成功克隆出了1320 bp的鸡FGL2基因,明确了其编码蛋白的生物学信息,经诱导表达后获得FGL2重组蛋白。 展开更多
关键词 鸡 FGL2基因 生物信息学分析 原核表达
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鸡白细胞介素-2原核表达及其活性鉴定
6
作者 韩顺子 黄霞 +4 位作者 孟闯 耿士忠 康喜龙 潘志明 焦新安 《中国家禽》 北大核心 2024年第5期56-61,共6页
试验旨在获得具有生物活性的鸡白细胞介素-2(ChIL-2)重组蛋白。试验以克隆获得的ChIL-2基因为模板,分别构建原核重组表达菌BL21(pCold-ChIL-2)和BL21(pGEX-6P-1-ChIL-2),进行诱导表达和纯化;通过BrdU ELISA法检测重组蛋白诱导鸡脾脏淋... 试验旨在获得具有生物活性的鸡白细胞介素-2(ChIL-2)重组蛋白。试验以克隆获得的ChIL-2基因为模板,分别构建原核重组表达菌BL21(pCold-ChIL-2)和BL21(pGEX-6P-1-ChIL-2),进行诱导表达和纯化;通过BrdU ELISA法检测重组蛋白诱导鸡脾脏淋巴细胞的增殖情况,评估其生物活性;以rHis-ChIL-2免疫小鼠制备多克隆抗体。结果显示:成功构建了原核重组表达菌BL21(pCold-ChIL-2)、BL21(pGEX-6P-1-ChIL-2);经表达纯化后分别获得纯度较高的rHis-ChIL-2和rGST-ChIL-2蛋白,大小分别为14 ku和39.4 ku;rHis-ChIL-2和rGST-ChIL-2蛋白分别能够促进脾脏淋巴细胞显著或极显著增殖(P<0.01或P<0.001),均具有良好的生物活性;以纯化的rHis-ChIL-2免疫小鼠制备的多克隆抗体效价为5.12×105,可识别rHis-ChIL-2和rGST-ChIL-2,与真核表达的ChIL-2蛋白反应。结果表明,原核表达的重组蛋白ChIL-2具有良好的生物活性,采用其制备的多克隆抗体可识别真核表达的ChIL-2蛋白,为后期ChIL-2的检测奠定基础。 展开更多
关键词 ChIL-2 原核表达 生物活性 多克隆抗体
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A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
7
作者 秦文珍 李挺 +11 位作者 赵欣 董苏洁 翟焕杰 叶晨倩 叶曼青 童武 郑浩 于海 单同领 童光志 兰道亮 孔宁 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期195-200,共6页
A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体,可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF,并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中,诱导表达重... A型塞内卡病毒(SVA)是一种新兴的猪病原体,可引起母猪水泡样病变和仔猪急性死亡。本研究将SVA的VP1基因分别克隆到原核表达载体pCold-I和pCold-TF,并将测序正确的重组质粒VP1-pCold-I、VP1-pCold-TF转化BL21(DE3)大肠杆菌中,诱导表达重组蛋白。结果显示:VP1-pCold-I表达的目的蛋白在沉淀(包涵体)中,VP1-pCold-TF表达的蛋白为可溶性蛋白。分别纯化上述表达的蛋白,并免疫BALB/c小鼠,经四次免疫后得到多克隆抗体。经Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定,制备的多克隆抗体具有良好的Western blot效价和IFA效价,为相关基础研究和应用研究提供了工具。 展开更多
关键词 A型塞内卡病毒 VP1 原核表达 多克隆抗体
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芦笋皂苷合成相关糖基转移酶基因克隆及原核表达分析
8
作者 钟匀 林春 +3 位作者 刘正杰 董陈文华 毛自朝 李兴玉 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期255-263,共9页
【目的】克隆芦笋(Asparagus officinalis)甾醇糖基转移酶基因AoSGT1,分析其潜在催化活性,为解析芦笋皂苷合成途径及代谢调控机制提供科学依据。【方法】基于芦笋转录组数据设计特异性引物,扩增AoSGT1基因的完整开放阅读框(open reading... 【目的】克隆芦笋(Asparagus officinalis)甾醇糖基转移酶基因AoSGT1,分析其潜在催化活性,为解析芦笋皂苷合成途径及代谢调控机制提供科学依据。【方法】基于芦笋转录组数据设计特异性引物,扩增AoSGT1基因的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),经测序验证获得目标基因序列并进行生物信息学分析;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RTqPCR)测定各组织基因表达量;构建pGEX-4T-3-AoSGT1原核表达载体,并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(De3),随后诱导实现重组蛋白表达。【结果】AoSGT1长1800 bp,编码599个氨基酸,其相对分子质量为66.72 kD,属于亲水性蛋白,无跨膜域和信号肽。系统发育结果表明,AoSGT1与盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)Dz3GT_(2)有较高同源性,同属UGT80B1亚家族。多序列比对揭示了该蛋白序列包含甾醇糖基转移酶保守结构域PSBD Box和PSPG Box,预示其具有对甾体化合物3β-OH位点潜在糖基化活性。RT-qPCR结果显示,AoSGT1在芦笋根中高表达,而在茎和花中低表达。此外,SDS-PAGE结果表明,目标蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,其大小与预测值相符。【结论】成功克隆AoSGT1基因,并确认其在芦笋中呈现组织特异性表达,推测其可能参与芦笋甾体皂苷生物合成。同时,成功在大肠杆菌中实现了目标蛋白的异源表达。 展开更多
关键词 芦笋 甾体皂苷 甾醇糖基转移酶 基因克隆 生物信息学分析 RT-QPCR 原核表达 转录组
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猪圆环病毒2型ORF9蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备
9
作者 边孟婷 梁海英 +7 位作者 曾智勇 汤德元 王彬 叶泥 柳佳佳 黄书 潘向英 田红利 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期226-232,共7页
为了鉴定并深入研究ORF9蛋白在猪圆环病毒2型感染中的作用,本研究制备了小鼠抗ORF9蛋白多克隆抗体并进行了初步应用。首先通过扩增克隆ORF9基因,构建原核表达质粒pET-32a(+)-PCV2-ORF9并转化至BL21(DE3)感受态细胞中,再利用SDS-PAGE对... 为了鉴定并深入研究ORF9蛋白在猪圆环病毒2型感染中的作用,本研究制备了小鼠抗ORF9蛋白多克隆抗体并进行了初步应用。首先通过扩增克隆ORF9基因,构建原核表达质粒pET-32a(+)-PCV2-ORF9并转化至BL21(DE3)感受态细胞中,再利用SDS-PAGE对可能影响ORF9蛋白表达效果的因素(温度、IPTG浓度、时间)进行优化研究,随后将重组蛋白经纯化复性后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定小鼠多抗效价,并用IFA和Western-blot方法对抗ORF9多克隆抗体特异性进行研究。结果显示,重组质粒p ET-32a(+)-PCV2-ORF9构建成功;ORF9重组蛋白在IPTG浓度为0.1 mmol/L、37℃条件下诱导4 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达,分子量大小约24.2 ku;经ELISA检测制备的多抗效价为1∶6 400;IFA和Western-blot试验结果均证明ORF9蛋白能被PCV2阳性血清和小鼠多克隆抗体特异性识别。本研究成功表达并纯化了具备抗原性的PCV2 ORF9重组蛋白,制备的特异性抗PCV2 ORF9多克隆抗体为探究ORF9蛋白在PCV2感染中的作用奠定了基础材料。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 ORF9蛋白 原核表达 多克隆抗体
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副鸡禽杆菌lpxM蛋白的原核表达及免疫原性研究
10
作者 梁之瑄 梅晨 +4 位作者 张雪 徐浩钧 支岩 李焕荣 王宏俊 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期719-727,共9页
[目的]探究副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)外膜蛋白lpxM的免疫原性,为预防鸡传染性鼻炎提供理论参考。[方法]构建pET-28a-lpxM原核表达载体,经PCR扩增和双酶切鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱... [目的]探究副鸡禽杆菌(Avibacterium paragallinarum)外膜蛋白lpxM的免疫原性,为预防鸡传染性鼻炎提供理论参考。[方法]构建pET-28a-lpxM原核表达载体,经PCR扩增和双酶切鉴定后将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG进行诱导表达,并对诱导时间和诱导浓度进行优化,用尿素缓冲液纯化重组蛋白lpxM并进行SDS-PAGE分析。利用Western blotting鉴定重组蛋白的特异性。将重组蛋白与MONTANIDEISA 71 VG佐剂制备成疫苗v-lpxM,通过动物试验观察重组蛋白的免疫效果。[结果]重组质粒pET-28a-lpxM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后成功表达,在37 ku处有目的蛋白特异性条带,在37℃、700 mmol/L IPTG、诱导4 h时蛋白表达量最高;重组蛋白lpxM在上清和沉淀中均有表达,且在沉淀中表达量相对较高;Western blotting结果显示,C型副鸡禽杆菌Modesto株的阳性鸡血清与纯化后的重组蛋白可发生免疫反应。免疫保护试验结果显示,v-lpxM疫苗对A、B和C型副鸡禽杆菌的保护率分别为0、20%和60%。[结论]本研究成功构建了原核表达载体pET-28a-lpxM,实现了lpxM重组蛋白的高效表达,且表现出良好的免疫原性。研究结果为探究副鸡禽杆菌外膜蛋白lpxM的免疫学特性以及为鸡传染性鼻炎的预防和疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 副鸡禽杆菌 lpxM蛋白 原核表达 免疫原性
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克氏原螯虾虾青蛋白A2基因克隆、组织分布及原核表达
11
作者 陈浩 吉宏武 +3 位作者 张迪 刘书成 宋文奎 郝记明 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期63-72,共10页
虾青蛋白对甲壳类水产品色泽的形成和调控具有重要作用。为探究克氏原螯虾虾青蛋白A2(PcCRA2)的基因结构及原核表达,作者通过基因克隆获得PcCRA2基因编码序列(cra2),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测cra2基因在克氏原螯虾9种组织中的... 虾青蛋白对甲壳类水产品色泽的形成和调控具有重要作用。为探究克氏原螯虾虾青蛋白A2(PcCRA2)的基因结构及原核表达,作者通过基因克隆获得PcCRA2基因编码序列(cra2),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测cra2基因在克氏原螯虾9种组织中的表达模式,并以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,进行PcCRA2异源重组表达。结果表明,克氏原螯虾cra2基因cDNA全长573 bp,编码190个氨基酸。生物信息学分析显示,虾青蛋白A2相对分子质量为21 158.9,理论等电点为5.59。氨基酸序列比对发现,克氏原螯虾cra2编码蛋白质序列与红螯螯虾相似度最高,为91.58%。RT-qPCR结果显示,cra2在所检组织中均有表达,在表皮的表达量最高(P<0.05)。构建了pET28a-cra2原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达。其最佳诱导表达条件为:接种4 h后加入0.5 mmol/L IPTG于30℃诱导6 h;UV-vis结果表明重组蛋白质能与虾青素特异性结合,最大吸收峰为505 nm。该研究结果为进一步研究虾青蛋白质的生物功能奠定基础。 展开更多
关键词 虾青蛋白 克氏原螯虾 实时荧光定量PCR 原核表达
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非洲猪瘟病毒MGF360-13L蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
12
作者 陈世钰 蒋亚君 +5 位作者 鑫婷 崔帅 王洋 郭晓宇 贾红 朱鸿飞 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第1期194-201,共8页
本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒(ASFV)MGF360-13L基因原核表达系统表达13L蛋白,并制备其鼠源多克隆抗体。利用生物信息学方法,对ASFV MGF360-13L基因进行序列比对,分析其同源性、构建遗传进化树;将非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因密码子优... 本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒(ASFV)MGF360-13L基因原核表达系统表达13L蛋白,并制备其鼠源多克隆抗体。利用生物信息学方法,对ASFV MGF360-13L基因进行序列比对,分析其同源性、构建遗传进化树;将非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因密码子优化后进行合成,连接至PET32a载体构建重组质粒pET32a-13L,转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达获得目的蛋白,采用镍柱纯化法进行蛋白纯化。将纯化后的蛋白乳化后免疫8周龄BALB/c雌鼠制备多克隆抗体,间接ELISA和Western blot检测抗体特异性。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白分子量大小为58.2 kDa,主要以包涵体形式存在;Western blot结果显示免疫猪阳性血清可特异性识别该蛋白,具有良好的反应性,表明该重组蛋白获得正确表达。利用该蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体进行Western blot,结果显示其能与MGF360-13L重组蛋白发生特异性反应。间接ELISA测定抗体效价高达1∶256000。本研究成功制备非洲猪瘟病毒MGF360-13L重组蛋白,以其为免疫原制备的多克隆抗体具备较高的特异性和反应性,为进一步阐述MGF360-13L蛋白的生物学功能和研制非洲猪瘟新型疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 MGF360-13L基因 序列分析 原核表达 多克隆抗体
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A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域的原核表达与鉴定
13
作者 林维鹏 崔鹏飞 +2 位作者 王思文 邓国华 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期107-112,139,共7页
A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源... A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全。PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一。为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源重组策略将8×His标签与一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的CBD区基因序列克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-8×His-CBD,经PCR及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度IPTG诱导不同时间后,经SDS-PAGE检测蛋白表达后使用镍柱纯化。结果显示,菌体裂解上清中在21 ku处可见目的条带,与8×His-CBD蛋白预期大小符合,且以0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h时蛋白表达量最高,镍柱纯化后可获得纯度大于95%的8×His-CBD蛋白。为确定该蛋白是否具有生物学活性,本研究以帽子结构类似物m7GTP对其进行等温滴定量热试验,结果显示8×His-CBD蛋白和m~7GTP结合时存在明显热峰,表明8×His-CBD蛋白具有生物学活性;经计算,其Kd值为1.71×10^(-5)(±2.92×10^(-6))mol/L。本研究结果对流感病毒的基础研究和抗流感病毒药物的研发具有借鉴意义。 展开更多
关键词 A型流感病毒 PB2蛋白 帽子结合结构域 原核表达 纯化
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A型塞内卡病毒VP3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
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作者 林铱婷 姬康 +8 位作者 谭姗姗 晋怡 宋若琪 马瑞一 王颖 牛胜 赵宇军 田文霞 任建乐 《中国动物检疫》 CAS 2024年第4期96-102,共7页
为制备A型塞内卡病毒(SVA)VP3蛋白多克隆抗体,采用同源重组技术将SVA VP3基因连接至原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒pET-SVA-VP3。将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),以1 mmol/L的IPTG进行诱导表达并纯化表达产物... 为制备A型塞内卡病毒(SVA)VP3蛋白多克隆抗体,采用同源重组技术将SVA VP3基因连接至原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒pET-SVA-VP3。将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),以1 mmol/L的IPTG进行诱导表达并纯化表达产物,随后将纯化的VP3重组蛋白皮下多点注射新西兰白兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot分别对抗体效价、反应性和特异性进行鉴定。结果显示:重组VP3蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约36 kDa;制备的VP3蛋白多克隆抗体能与VP3重组蛋白和SVA发生特异性反应,其ELISA效价达1:10000以上,Western blot和IFA效价达1:5000。综上,本研究成功制备了SVA VP3多克隆抗体,其具有较高的效价和特异性,可为后续SVA致病机制及检测方法等研究奠定基础。 展开更多
关键词 A型塞内卡病毒 VP3蛋白 原核表达 多克隆抗体 效价 特异性
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基于Fosmid文库筛选山羊瘤胃源酯类水解酶基因及其原核表达验证
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作者 李林芳 刘功炜 +3 位作者 杨凯尧 王智伟 崔雯元 杨雨鑫 《中国畜牧杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期346-355,共10页
试验旨在挖掘瘤胃微生物中潜在的酯类水解酶基因并进行原核表达,研究其酶学性质及对芥子碱的降解效果。利用功能筛选方法,从前期构建的山羊瘤胃微生物Fosmid文库中鉴定出潜在的酯类水解酶基因,并在大肠杆菌中异源表达,通过酶活测定及芥... 试验旨在挖掘瘤胃微生物中潜在的酯类水解酶基因并进行原核表达,研究其酶学性质及对芥子碱的降解效果。利用功能筛选方法,从前期构建的山羊瘤胃微生物Fosmid文库中鉴定出潜在的酯类水解酶基因,并在大肠杆菌中异源表达,通过酶活测定及芥子碱的降解研究来筛选功能酶,最后分析酯类水解酶的酶学性质。结果表明:从山羊瘤胃微生物Fosmid文库中鉴定到6个酯类水解酶基因Estg1、Estg2、Esty1、Estp、Estk1和Estk2,并在E.coli BL21(DE3)中成功表达,获得的酯类水解酶的活性均高于空载对照(P<0.05),其中Estp和Estk1的活性最高,分别为205.33 U/mL和212.67 U/mL,其分子量为33、28 ku,且能够降解芥子碱,降解率分别为13.26%和11.66%;酯酶Estp和Estk1在温度为40℃、pH 11时活性最高,在40~50℃、pH8~11条件下相对稳定;金属离子Mn^(2+)和Ni^(2+)对酯酶Estp和Estk1的活性有促进作用(P<0.01),有机溶剂正己烷能增强其活性(P<0.05);而EDTA、金属离子Cu^(2+)、Zn^(2+)、Co^(2+)和Fe^(3+)、有机溶剂乙腈以及表面活性剂吐温-80和曲拉通X-100会抑制Estp和Estk1的活性(P<0.01)。本研究从山羊瘤胃宏基因组文库中筛选了2个高产酯类水解酶的基因,异源表达后具有嗜中温、耐碱、耐有机溶剂等特性,且能够降解芥子碱,可为酯类水解酶的深入挖掘及应用提供理论依据。 展开更多
关键词 FOSMID文库 酯类水解酶 原核表达 酶学性质 芥子碱
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嗜水气单胞菌外膜蛋白TolB的原核表达及生物信息学分析
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作者 陈甜梦 蔡彤璇 +3 位作者 王嘉璐 田牧野 赵宝华 刘东 《河南农业科学》 北大核心 2024年第2期136-143,共8页
为筛选TolB作为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)渔用疫苗候选抗原,从嗜水气单胞菌中克隆了外膜蛋白tolB基因并异源表达,采用生物信息学方法预测TolB的理化性质和结构特征。结果显示,tolB基因片段(去除信号肽)全长1 263 bp,编码1条含... 为筛选TolB作为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)渔用疫苗候选抗原,从嗜水气单胞菌中克隆了外膜蛋白tolB基因并异源表达,采用生物信息学方法预测TolB的理化性质和结构特征。结果显示,tolB基因片段(去除信号肽)全长1 263 bp,编码1条含有420个氨基酸残基的多肽,分子质量45.78 ku。成功在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中异源表达TolB蛋白,其为稳定的亲水性外膜蛋白。TolB蛋白家族在不同菌株间具有同源性,尤其在气单胞菌间亲缘关系更近。TolB蛋白二级结构以无规则卷曲为主,具有潜在的B细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和辅助T细胞(Th)抗原表位;相互作用网络主要为TolPal系统蛋白。综上,TolB具有成为嗜水气单胞菌亚单位疫苗有效候选抗原的特性。 展开更多
关键词 嗜水气单胞菌 TolB 原核表达 蛋白质纯化 生物信息学
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新型鹅星状病毒衣壳蛋白原核表达及多克隆抗体制备
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作者 高冬生 张菡 +7 位作者 王海燕 张晓战 赵盼盼 于彤彤 宋幸辉 乔宏兴 李庆东 彭志锋 《河南农业科学》 北大核心 2024年第4期137-142,共6页
为了研制针对新型鹅星状病毒(GAstV)的血清学检测方法和高效抗体,克隆新型GAstV HNZZ-4毒株的ORF2基因序列,构建pET-32a-Cap重组质粒,进行衣壳蛋白(Cap)原核表达;用重组Cap蛋白免疫兔只制备多克隆抗体,并采用Western blot和免疫过氧化... 为了研制针对新型鹅星状病毒(GAstV)的血清学检测方法和高效抗体,克隆新型GAstV HNZZ-4毒株的ORF2基因序列,构建pET-32a-Cap重组质粒,进行衣壳蛋白(Cap)原核表达;用重组Cap蛋白免疫兔只制备多克隆抗体,并采用Western blot和免疫过氧化物酶单层试验鉴定制备的多克隆抗体的反应原性。结果表明,重组质粒pET-32a-Cap经限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行酶切后,得到大小约5000 bp和750 bp的2个与预期一致的条带;阳性重组质粒测序结果显示,成功构建了重组表达载体pET-32a-Cap;pET-32a-Cap原核表达获得了分子质量约为27.5 ku的GAstV重组Cap蛋白;制备的兔抗GAstV Cap多克隆抗体能够与重组Cap蛋白发生特异性反应,且能特异性结合感染LMH细胞的GAstV。综上,制备的兔源抗新型GAstV Cap多克隆抗体保留了抗原性,特异性较好。 展开更多
关键词 鹅星状病毒 衣壳蛋白 原核表达 多克隆抗体
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苹果坏死花叶病毒CP基因原核表达及其抗血清制备
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作者 邢飞 王红清 李世访 《西南大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期63-69,共7页
苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是近年新发现的病原物,并且是与我国苹果花叶病症状高度相关的重要病毒,进行ApNMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因原核表达、制备多克隆抗血清,以建立快速、灵敏、准确的ApNMV常规... 苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是近年新发现的病原物,并且是与我国苹果花叶病症状高度相关的重要病毒,进行ApNMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因原核表达、制备多克隆抗血清,以建立快速、灵敏、准确的ApNMV常规检测方法尤为必要.通过设计特异性引物,以RT-PCR方法成功获得ApNMV CP基因序列,插入到原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG进行重组蛋白(含His-tag)诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,用Ni Sepharose 6 Fast Flow进行蛋白纯化,回收共得到重组蛋白2.4 mg.在屏障环境下免疫2只SPF级新西兰兔,制备出多克隆抗血清,稀释400倍后仍能与ApNMV阳性苹果叶片样品发生免疫反应.由此证明,本研究建立的ApNMV间接ELISA检测方法具有较好的灵敏性,检测效率高,能够用于田间大量样品ApNMV的诊断. 展开更多
关键词 苹果坏死花叶病毒 外壳蛋白基因 原核表达 抗血清 酶联免疫吸附分析方法
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猴痘病毒A5L蛋白的原核表达及其免疫原性评价
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作者 熊嘉琦 贾梦乐 +6 位作者 杨领弟 王毅豪 孙静婷 王婷 黎美凤 孔令保 彭棋 《中国畜牧兽医》 CSCD 北大核心 2024年第1期365-372,共8页
【目的】获取高纯度猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)A5L蛋白,制备小鼠抗A5L高效价抗血清,为MPXV A5L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-A5L,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,通过... 【目的】获取高纯度猴痘病毒(Monkeypox virus, MPXV)A5L蛋白,制备小鼠抗A5L高效价抗血清,为MPXV A5L蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】构建重组质粒pET-28a-A5L,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,通过分析不同IPTG诱导浓度、诱导温度、诱导时间条件下重组蛋白A5L表达情况,筛选最佳表达条件。通过Western blotting鉴定重组蛋白A5L表达,利用SDS-PAGE分析重组蛋白可溶性。A5L蛋白经His-Bind镍柱亲和层析纯化后免疫小鼠,通过ELISA法检测抗体效价。【结果】双酶切和测序结果显示,原核表达载体pET-28a-A5L构建成功。Western blotting结果显示重组蛋白A5L在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达;A5L蛋白在诱导温度42℃、诱导剂(IPTG)浓度为1.6 mmol/L、诱导16 h后表达量最高,大小为40 ku。SDS-PAGE分析结果显示,A5L蛋白主要以包涵体形式存在,最佳咪唑洗脱浓度为50 mmol/L。ELISA结果显示,制备的鼠抗A5L蛋白抗体最高效价达1∶205 440。【结论】本研究成功构建了重组质粒pET-28a-A5L,并在原核表达系统中成功表达重组蛋白A5L,制备的A5L多克隆抗体具有较好的免疫原性,研究结果为进一步探究MPXV A5L蛋白的生物学功能奠定基础。 展开更多
关键词 猴痘病毒 原核表达 A5L蛋白 免疫原性
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蜂毒PLA2原核表达及溶血作用研究
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作者 刘苗苗 王兆宇 +2 位作者 陈龙龙 吕建华 赵慧婷 《山西农业大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第2期63-70,共8页
[目的]蜂毒(Bee_Venom,BV)是天然的动物药,药理效应广泛,成分较为复杂。磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)是蜂毒的重要活性成分和主要过敏原,可与蜂毒肽发挥协同作用,诱发溶血。本研究旨在通过原核系统表达并纯化出蜂毒磷脂酶A2(BvPLA2... [目的]蜂毒(Bee_Venom,BV)是天然的动物药,药理效应广泛,成分较为复杂。磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)是蜂毒的重要活性成分和主要过敏原,可与蜂毒肽发挥协同作用,诱发溶血。本研究旨在通过原核系统表达并纯化出蜂毒磷脂酶A2(BvPLA2)蛋白,并通过溶血试验对比蜂毒(bee venom,BV)、蜂毒肽(melittin)以及BvP⁃LA2的溶血效果。[方法]将已构建好的pET28a-BvPLA2融合表达载体转化到大肠杆菌BL21菌株中并通过IPTG低温诱导蛋白表达,对表达产物进行鉴定并纯化获得重组BvPLA2蛋白。采集小鼠眼球全血与生理盐水等体积混合配制成2%的红细胞混悬液,加入不同浓度的BvPLA2蛋白液、蜂毒液及蜂毒肽,通过酶标仪测定溶血率。[结果]经IPTG诱导后的表达产物在约15 kDa的分子量处呈现清晰的条带,与理论推算值一致。超声破碎后在上清及沉淀中均表达出特异性条带,且上清中的表达量与沉淀表达量基本一致。不同浓度的BvPLA2蛋白液均具有溶血效果,溶血率均超过5%,且低浓度BvPLA2溶血率较高。经对比得出,BvPLA2溶血率显著低于蜂毒和蜂毒肽(P<0.05)。[结论]通过原核表达系统成功诱导并纯化出可溶性目标蛋白BvPLA2,且BvPLA2具有一定的溶血效果,但溶血效果显著低于蜂毒和蜂毒肽。 展开更多
关键词 蜂毒 磷脂酶A2 原核表达 溶血性
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