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DREB基因双T-DNA植物表达载体的构建及验证 被引量：10
1
作者 韩兆雪 曹墨菊 +1 位作者 朱祯 荣廷昭 《分子植物育种》 CAS CSCD 2004年第1期7-12,共6页
W 34基因经 pGEM T EASY载体 ,克隆到 pBDREB载体EcoRI位点 ,得到在Amp平板上生长的转化子 pBW 34-DREB质粒 ;质粒pBW 34-DREB、pSPROK、pBlueks分别经PstI/KpnI、KpnI/EcoRI、PstI/EcoRI双酶切 ,三片段连接构建成中间表达载体 pBWD Tn... W 34基因经 pGEM T EASY载体 ,克隆到 pBDREB载体EcoRI位点 ,得到在Amp平板上生长的转化子 pBW 34-DREB质粒 ;质粒pBW 34-DREB、pSPROK、pBlueks分别经PstI/KpnI、KpnI/EcoRI、PstI/EcoRI双酶切 ,三片段连接构建成中间表达载体 pBWD Tnos;再用SmaI/EcoRV双酶切 pBWD Tnos,将回收的DREB基因的完整的表达结构元插入到经SmaI酶切的质粒载体 pCDMAR Hyg中 ,构建成双T DNA植物表达载体 pCDMAR pWDT Hyg ,大小为 13 5 9kb ,经酶切鉴定 ,证明构建的载体与预期设计的一致。将此双T载体用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织 ,期望得到无选择标记的安全的转基因植物。 展开更多
关键词 DREB基因 双t-dna 植物表达载体 无选择标记 中间载体
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At2基因双T-DNA植物表达载体的构建 被引量：2
2
作者 王文玲 王贤磊 +2 位作者 熊丽曼 高兴旺 李冠 《北方园艺》 CAS 北大核心 2012年第12期107-112,共6页
以甜瓜品种‘MR-1’为试材,采用PCR技术,扩增出了At2基因并在两端添加BamHⅠ和SacⅠ酶切位点。结果表明:在NCBI上进行BLAST显示其氨基酸序列与GeneBank中已公布的At2基因的同源性为99%;经DNAMAN软件分析,核苷酸序列同源性为99.43%。将... 以甜瓜品种‘MR-1’为试材,采用PCR技术,扩增出了At2基因并在两端添加BamHⅠ和SacⅠ酶切位点。结果表明:在NCBI上进行BLAST显示其氨基酸序列与GeneBank中已公布的At2基因的同源性为99%;经DNAMAN软件分析,核苷酸序列同源性为99.43%。将其连接在中间表达载体G-pPTN133上,得到替换了GUS基因的中间载体A-pPTN133。A-pPTN133再经ScaⅠ酶切后,插入到经ScaⅠ酶切的pPTN133^-中,构建成双T-DNA植物表达载体At2-pPTN133。经酶切和PCR鉴定证明了所构建载体的正确性。 展开更多
关键词 At2基因 双t-dna 植物表达载体 无选择标记
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番木瓜β-Gal基因RNAi双T-DNA植物表达载体的构建及其遗传转化的初步研究 被引量：2
3
作者 何玮毅 陈晓静 +2 位作者 申艳红 卢秉国 潘东明 《热带亚热带植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期556-561,共6页
克隆了番木瓜(Carica papaya L.)果肉的细胞壁水解关键酶β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因保守区,将其反向重复插入载体pKANNIBAL,构建RNAi中间表达载体pKAN/RG,将其上的发夹结构取代经改造的载体pCAMBIA1300上hptⅡ基因,构建中间表达载体p130... 克隆了番木瓜(Carica papaya L.)果肉的细胞壁水解关键酶β-半乳糖苷酶(β-GAL)基因保守区,将其反向重复插入载体pKANNIBAL,构建RNAi中间表达载体pKAN/RG,将其上的发夹结构取代经改造的载体pCAMBIA1300上hptⅡ基因,构建中间表达载体p1300-/MFRG,分离单T-DNA区段,与载体pCAMBIA2301构建RNAi双T-DNA植物表达载体p2301/TTRG。酶切分析和PCR检测表明,p2301/TTRG已被成功导入农杆菌EHA105。通过遗传转化,初步获得了GUS染色呈阳性且具Kan抗性的番木瓜胚性愈伤组织。 展开更多
关键词 番木瓜 Β-半乳糖苷酶 RNA干扰 双T—DNA植物表达载体 遗传转化
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双T-DNA反式串联植物表达载体构建与验证
4
作者 胡太蛟 冯庆玲 +1 位作者 潘大仁 王锋 《福建农业学报》 CAS 2013年第3期195-200,共6页
通过对双T-DNA串联结构的改变,构建2个双T-DNA反式串联的植物表达载体p1300-DMAR-LF-GCMSAGS和p1300-DMAR-LF-GLCMSAGS。经过转化水稻后验证,结果表明:能够获得无选择标记基因的转基因植株;与顺式串联植物表达载体比较,反式串联的植物... 通过对双T-DNA串联结构的改变,构建2个双T-DNA反式串联的植物表达载体p1300-DMAR-LF-GCMSAGS和p1300-DMAR-LF-GLCMSAGS。经过转化水稻后验证,结果表明:能够获得无选择标记基因的转基因植株;与顺式串联植物表达载体比较,反式串联的植物表达载体成功地将非连锁共整合的频率分别由47.37%和45.83%提高到了55.81%和51.28%,提高无选择标记基因转基因植株的筛选效率。 展开更多
关键词 双t-dna 反式串联 植物表达
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LFY基因双T-DNA植物表达载体的构建
5
作者 孙磊 张启翔 《分子植物育种》 CAS CSCD 2006年第2期205-208,共4页
LFY基因是从从野生型拟南芥中克隆出的一个与调控花分生组织启动相关的基因,它有促进植物提早开花的作用。用PCR方法从克隆载体上扩增出LFY基因并在两端添加XhoⅠ酶切位点,将其连接在用XhoⅠ切除了hyg基因的pCAMBIA1301表达载体上,得到... LFY基因是从从野生型拟南芥中克隆出的一个与调控花分生组织启动相关的基因,它有促进植物提早开花的作用。用PCR方法从克隆载体上扩增出LFY基因并在两端添加XhoⅠ酶切位点,将其连接在用XhoⅠ切除了hyg基因的pCAMBIA1301表达载体上,得到去除选择标记的LFY基因植物表达载pCAM-BIA1301-LFY。质粒pCAMBIA1301经HindⅡ/EcoRⅠ双酶切补平自连后得到去除多克隆位点的质粒pCAMBIA1301-,再经SacII/SphI双酶切后插入到经SacⅡ酶切的pCAMBIA1301-LFY中。建成双T-DNA植物表达载体pCAMBIA1301-LFY-hyg-,经酶切鉴定证明了所构建载体的正确性。将此双T-DNA载体用农杆菌介导法转化菊花叶片,期望得到无选择标记含LFY基因的转基因菊花。 展开更多
关键词 LFY基因 双t-dna 植物表达载体 无选择标记
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多基因双T-DNA植物表达载体的构建及拟南芥转化 被引量：6
6
作者 李煦 王荣春 +1 位作者 何影 杨爱芳 《山东大学学报（理学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第9期1-6,29,共7页
多基因植物表达载体用于植物遗传转化是培育具有多种优良品质作物的有效策略.双T-DNA系统是实现筛选完成后选择标记基因删除的一种简便可行的方式.为培育高度抗逆或去除标记基因的农作物,构建了多基因双T-DNA植物表达载体2T-bbgdD,其中... 多基因植物表达载体用于植物遗传转化是培育具有多种优良品质作物的有效策略.双T-DNA系统是实现筛选完成后选择标记基因删除的一种简便可行的方式.为培育高度抗逆或去除标记基因的农作物,构建了多基因双T-DNA植物表达载体2T-bbgdD,其中含有一个抗除草剂基因bar,3个抗逆相关基因(DREB1A,Na+依赖性Pi转运体基因(d5),betA)和一个报告基因gfp.利用农杆菌介导法将该载体转入拟南芥,获得了多基因共转化及去除标记基因的转基因拟南芥.可将此植物表达载体进一步用于作物的遗传转化. 展开更多
关键词 植物表达载体 DNA重组 多基因 双t-dna 拟南芥 遗传转化
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具双T-DNA区的大麦黄矮病毒复制酶基因RNAi植物表达载体的构建(英文)
7
作者 孙文瑜 陈静 +1 位作者 王磊 付体华 《应用与环境生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期745-749,共5页
RNAi系双链RNA诱导同源mRNA降解,导致特定基因表达沉默的一种现象.RNAi技术是通过基因工程防治植物病毒病的最佳途径.由大麦黄矮病毒(Barely yellow dwarf virus,简称BYDV)引起的禾谷类黄矮病发病面积和危害程度在我国呈加重趋势.BYDV-... RNAi系双链RNA诱导同源mRNA降解,导致特定基因表达沉默的一种现象.RNAi技术是通过基因工程防治植物病毒病的最佳途径.由大麦黄矮病毒(Barely yellow dwarf virus,简称BYDV)引起的禾谷类黄矮病发病面积和危害程度在我国呈加重趋势.BYDV-GAV是当前流行的大麦黄矮病毒株系,本文针对BYDV-GAV复制酶基因序列,构建能在细胞内转录形成发卡RNA双链结构的表达盒,并将其置于中间载体pVec8-2b的T-DNA区,pVec8-2b的另一T-DNA区含有hpt选择报告基因表达盒.具双T-DNA区的病毒复制酶基因发卡RNA高效表达载体已导入根癌农杆菌,可用于诱导植物RNAi,创制无选择标记基因的抗大麦黄矮病转基因作物. 展开更多
关键词 大麦黄矮病毒BYDV RNAI 双t-dna区载体 无选择标记基因植物
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一种双顺反子表达载体的构建及应用的研究 被引量：8
8
作者 刘新平 陈苏民 +4 位作者 陈南春 赵忠良 柴玉波 崔有宏 薛泳涛 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1996年第2期156-159,共4页
将表达载体ｐＥＣ３４中的一段寡核苷酸序列，其中包括翻译增强子序列、ＳＤ序列、终止码、起始码及两端的限制性内切酶位点，插入ＧＳＴ基因后，构建成双顺反子的表达载体．利用此载体表达了非融合的人骨形成蛋白２Ａ（ｈＢＭＰ２Ａ）... 将表达载体ｐＥＣ３４中的一段寡核苷酸序列，其中包括翻译增强子序列、ＳＤ序列、终止码、起始码及两端的限制性内切酶位点，插入ＧＳＴ基因后，构建成双顺反子的表达载体．利用此载体表达了非融合的人骨形成蛋白２Ａ（ｈＢＭＰ２Ａ）和人骨形成蛋白３（ｈＢＭＰ３）Ｃ端肽段，将第一顺反子基因（ＧＳＴ基因）切小到原来的１／３时，则位于下游的第二顺反子基因编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达量增加一倍。 展开更多
关键词 双顺反子 基因表达 表达载体
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双表达载体研究GM-CSF对HCVC基因免疫应答的影响 被引量：10
9
作者 廖国阳 姜述德 +3 位作者 孙明波 杨卉娟 陈俊英 张新文 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期289-291,294,共4页
目的 HCV C蛋白基因诱导的免疫应答较弱 ,因而增强 HCV C蛋白基因免疫对于开发 HCV疫苗具有极其的重要性。方法将 GM- CSF基因与 pc15 4基因插入双表达载体 pc DNA3 .0 BA构建成双价质粒 pc DNA3 .0 BApc15 4 GM- CSF,肌肉免疫 Balb/ c... 目的 HCV C蛋白基因诱导的免疫应答较弱 ,因而增强 HCV C蛋白基因免疫对于开发 HCV疫苗具有极其的重要性。方法将 GM- CSF基因与 pc15 4基因插入双表达载体 pc DNA3 .0 BA构建成双价质粒 pc DNA3 .0 BApc15 4 GM- CSF,肌肉免疫 Balb/ c小鼠。结果 GM- CSF和 pc15 4在 Cos- 7细胞中同时获得瞬时表达 ;pc DNA3 .0 BApc15 4 GM- CSF双价质粒较单价 pc DNA3 .0 BApc15 4诱导小鼠产生抗体的几何平均滴度显著增高 ( P=0 .0 4 ) ,而 pc DNA3 .0 BApc15 4 + pc DNA3 .0BAGMCSF混合质粒较单价质粒 pc DNA3 .0 BApc15 4诱导小鼠产生抗体的滴度极显著降低 ( P<0 .0 1)。HCV C蛋白抗原特异性的脾淋巴细胞增殖能力 ,双价质粒较单价及单价混合质粒极显著增高 ( P<0 .0 1)。结论双表达载体同时输送 GM- CSF与pc15 4基因能增强 Balb/ c小鼠对 HCV C蛋白基因的体液免疫应答及免疫鼠脾淋巴细胞对特异性抗原刺激的增殖能力。 展开更多
关键词 DNA疫苗 双表达载体 HCV-C蛋白 GM-CSF
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CMO与BADH双基因表达载体构建及在烟草中的表达 被引量：10
10
作者 刘君 韩烈保 +3 位作者 陈其军 信金娜 何宇锋 李雪 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期5-9,共5页
目的将甜菜碱合成关键酶CMO与BADH基因构建到同一表达载体中。方法用转基因方法将该表达载体导入植物体内,完善植物体内的甜菜碱合成途径,提高植物的抗旱性和耐盐性。以pC1303质粒为基础,构建了均由35S启动子驱动的CMO基因和BADH基因的... 目的将甜菜碱合成关键酶CMO与BADH基因构建到同一表达载体中。方法用转基因方法将该表达载体导入植物体内,完善植物体内的甜菜碱合成途径,提高植物的抗旱性和耐盐性。以pC1303质粒为基础,构建了均由35S启动子驱动的CMO基因和BADH基因的植物双基因表达载体pC35SC35SB1303。利用冻融法将其导入农杆菌LBA4404中,通过农杆菌介导法分别将CMO基因、BADH基因以及该双基因表达载体导入烟草中。结果PCR检测和Northern杂交分析表明,外源基因已整合到受体植物基因组中并正常表达。结论对转基因植株及对照植株甜菜碱含量的检测结果表明,转双基因植株的甜菜碱含量明显高于转BADH基因植株、转CMO基因植株及对照植株。 展开更多
关键词 双基因表达载体 CMO BADH 甜菜碱含量
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细胞因子与猪瘟病毒E_2基因真核双表达载体的构建及其免疫增强作用 被引量：8
11
作者 陈创夫 余兴龙 +4 位作者 马正海 李作生 李红卫 涂长春 殷震 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2002年第11期1406-1410,共5页
构建了猪瘟病毒E2 基因与IL 2、IL 3基因的双表达真核表达载体 ,观察其表达水平 ,并对其免疫增强效果进行了观察。结果表明 ,构建了 2种猪瘟病毒E2 基因与白细胞介素 2、3的真核表达质粒pIRSTIL 2 ,pIRSTIL 3。将 2种质粒转染BHK 2 1细... 构建了猪瘟病毒E2 基因与IL 2、IL 3基因的双表达真核表达载体 ,观察其表达水平 ,并对其免疫增强效果进行了观察。结果表明 ,构建了 2种猪瘟病毒E2 基因与白细胞介素 2、3的真核表达质粒pIRSTIL 2 ,pIRSTIL 3。将 2种质粒转染BHK 2 1细胞 ,均可在体外表达E2 抗原和有生物活性的IL 2、IL 3两种质粒能诱导产生CSFV的特异性免疫反应。pIRSTIL 2 ,pIRSTIL 3所诱导的免疫应答反应比使用单表达质粒 pIRST强。试验表明 ,细胞因子与目的基因构建的双表达基因疫苗能有效提高基因疫苗的免疫效果。 展开更多
关键词 细胞因子 猪瘟病毒 E2基因 免疫增强作用 双表达载体 猪瘟 基因疫苗 真核表达
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猪γ-干扰素双顺反子表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 被引量：11
12
作者 曹瑞兵 蔡梅红 +1 位作者 陈德胜 陈溥言 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期52-55,共4页
提取经 Con A诱导培养的猪外周血白细胞总 RNA,RT- PCR扩增出猪 IFN- γ基因并克隆到 p GEM- T- easy载体 ,测序结果表明 ,扩增片段为含有信号肽的猪 IFN-γ完整基因。亚克隆猪 IFN-γ成熟蛋白编码基因 ,并对其 5′段前 2个稀有密码子... 提取经 Con A诱导培养的猪外周血白细胞总 RNA,RT- PCR扩增出猪 IFN- γ基因并克隆到 p GEM- T- easy载体 ,测序结果表明 ,扩增片段为含有信号肽的猪 IFN-γ完整基因。亚克隆猪 IFN-γ成熟蛋白编码基因 ,并对其 5′段前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。通过引入 SD序列 ,成功构建了猪 IFN- γ原核双顺反子表达载体 p L CS-po IFN2 G,并实现了猪 IFN-γ在大肠杆菌中的高表达 ,约占菌体总蛋白的 5 6 .5 %。表达产物以包涵体形式存在 ,用含 7mol/L 盐酸胍的变性液溶解及含 0 .5 mol/L盐酸胍复性液复性处理 ,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后 ,细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪 展开更多
关键词 猪γ—干扰素 双顺反子 表达载体 大肠杆菌 基因表达 基因克隆
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双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体的构建与鉴定 被引量：7
13
作者 李瑞芳 张添元 罗进贤 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期714-719,共6页
利用大肠杆菌质粒pSP72和枯草杆菌质粒pUB18共整合得到双功能克隆载体pSB。在pSB多克隆位点依次引入枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因启动子-信号肽序列sacBp.s.、地衣芽孢杆菌淀粉酶基因终止子序列α-amyT和短小芽孢杆菌增强子基因degQ,最终... 利用大肠杆菌质粒pSP72和枯草杆菌质粒pUB18共整合得到双功能克隆载体pSB。在pSB多克隆位点依次引入枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因启动子-信号肽序列sacBp.s.、地衣芽孢杆菌淀粉酶基因终止子序列α-amyT和短小芽孢杆菌增强子基因degQ,最终构建了双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体pSBPTQ。将VasostatinⅠ基因作为靶基因检测sacBp.s.、α-amyT和degQ在pSBPTQ进行外源基因表达时的功能,结果表明,在蔗糖诱导下,sacB启动子有效启动了Vasostatin I基因的表达和分泌,α-amy T提高了VasostatinⅠ基因的转录效率,而degQ明显增强了VasostatinⅠ基因的表达水平。VasostatinⅠ基因在蔗糖诱导下成功表达并分泌到枯草杆菌细胞外,蛋白质分泌效率达到90%左右。质粒稳定性试验结果表明,经过40个世代之后,质粒pSBPTQ在枯草杆菌DB1342中仍旧保持在83%以上。 展开更多
关键词 枯草杆菌 双功能载体 诱导型 表达分泌 构建
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丙肝病毒(HCV)及乙肝病毒(HBV)双表达载体的构建及表达 被引量：4
14
作者 邓涛 范公忍 +5 位作者 陈天宝 陈乃玲 胡大荣 李琳 黄树林 贾克明 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期149-151,154,共4页
目的 :为探索HCV/HBV高效联合基因免疫策略 ,构建具有 2套独立表达单元的HCV/HBV真核表达载体。方法 :分别将与HCV核心区基因互补的cDNA和HBV核心区基因克隆于具有 2套独立表达单元的真核表达载体pRSC的巨细胞病毒启动子和RSV启动子下... 目的 :为探索HCV/HBV高效联合基因免疫策略 ,构建具有 2套独立表达单元的HCV/HBV真核表达载体。方法 :分别将与HCV核心区基因互补的cDNA和HBV核心区基因克隆于具有 2套独立表达单元的真核表达载体pRSC的巨细胞病毒启动子和RSV启动子下游 ,称为pRSC HBV/HCV ,转染SP2 / 0细胞 ,通过免疫荧光和Western印迹法观测蛋白的表达 ,免疫Balb/c小鼠 ,用酶联免疫小鼠体液免疫应答。结果 :pRSC HBV/HCV转染SP2 / 0细胞可见HBcAg及HCV核蛋白染色阳性荧光细胞 ,SDS Page电泳显示在 14kD及 2 1kD处均可见蛋白条带 ,与HBcAg及HCV核蛋白的的理论预期值一致 ,Western印迹分析显示在 14kD及 2 1kD处可见特异性的蛋白条带。 5只免疫鼠中全部出现抗 HCV及抗 HBV抗体 ,而对照组全阴性。结论 :pRSC HBV/HCV可分别表达HBcAg及HCV核蛋白 ,免疫Balb/c小鼠后可诱导其体液免疫应答 ,为进一步开展HCV/HBV联合基因免疫奠定了实验基础。 展开更多
关键词 丙肝病毒 乙肝病毒 联合基因免疫 双表达载体 HCV/HBV其核表达载体 体液免疫应答 细胞免疫应答
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可去除选择标记的DREB基因双T-DNA载体共转化玉米 被引量：6
15
作者 谭登峰 韩兆雪 +2 位作者 曹墨菊 潘光堂 荣廷昭 《四川农业大学学报》 CSCD 2008年第1期15-19,共5页
通过体外重组构建双T-DNA双元载体pCDMARpWDT-Hyg,选择标记基因hpt(hygromycin phospho-transferase)和抗逆转录因子基因DREB分别位于两个独立的T-DNA。用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,通过在抗性培养基上严格筛选,在获得的再生转... 通过体外重组构建双T-DNA双元载体pCDMARpWDT-Hyg,选择标记基因hpt(hygromycin phospho-transferase)和抗逆转录因子基因DREB分别位于两个独立的T-DNA。用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,通过在抗性培养基上严格筛选,在获得的再生转化植株中,同时整合hpt基因和DREB基因的共转化率达到26·3%。该转化系统的建立为下一步得到无选择标记的转基因植株奠定基础。此外,本实验还通过gus基因的瞬时表达分析了农杆菌转化玉米的影响因素。 展开更多
关键词 玉米 DREB基因 双T—DNA载体 农杆菌介导法 瞬时表达
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抗菌肽B、D双基因表达载体的构建及转化广藿香的研究 被引量：12
16
作者 张家明 孙雪飘 郑学勤 《热带作物学报》 CSCD 1997年第1期50-57,共8页
将人工合成的柞蚕抗菌肽D基因和天蚕抗菌肽B基因分别接上启动子和终止于，克隆到双元表达载体PBin19上，构建成双价抗菌肽基因表达载体pTBD。用三亲交配的方法将pTBD导入根癌农杆菌菌株LBA4404，再通过农杆菌将抗菌肽B、D基因导入广藿... 将人工合成的柞蚕抗菌肽D基因和天蚕抗菌肽B基因分别接上启动子和终止于，克隆到双元表达载体PBin19上，构建成双价抗菌肽基因表达载体pTBD。用三亲交配的方法将pTBD导入根癌农杆菌菌株LBA4404，再通过农杆菌将抗菌肽B、D基因导入广藿香，获27个转基因植株。Southern杂交结果表明，抗菌肽B、D基因已同时整合进3个株系染色体组中。与病原细菌Pseudomonassolanacearum试管共培养结果表明，转基因植株获得较强抗病性。盆栽接菌试验结果也表明．转基因植株具有较强抗病性。 展开更多
关键词 广藿香 抗菌肽 双基因表达载体 转基因植株
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骨形态发生蛋白9、6双表达腺病毒载体的构建及其成骨诱导作用 被引量：3
17
作者 迭小红 罗庆 +2 位作者 陈聪 罗光金 康权 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期1273-1279,共7页
目的构建双表达骨形态发生蛋白(BMP)9、6重组腺病毒并探讨其对C3H10细胞成骨的影响。方法以单一表达的BMP9或BMP6 AdEasy质粒为模板,PCR自扩增BMP9和BMP6基因序列,先后将其插入穿梭质粒pASG2,获得双表达穿梭质粒pASG2-BMP9、6,然后与腺... 目的构建双表达骨形态发生蛋白(BMP)9、6重组腺病毒并探讨其对C3H10细胞成骨的影响。方法以单一表达的BMP9或BMP6 AdEasy质粒为模板,PCR自扩增BMP9和BMP6基因序列,先后将其插入穿梭质粒pASG2,获得双表达穿梭质粒pASG2-BMP9、6,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183中同源重组,酶切鉴定成功后,转染至HEK293细胞中包装和扩增得到高滴度双表达腺病毒AdBMP9、6,体外转染C3H10细胞,RT-PCR方法检测BMP9、BMP6 mRNA水平的表达,早期成骨指标碱性磷酸酶染色、晚期指标钙茜素红染色检测其成骨作用。结果成功构建双表达重组腺病毒AdBMP9、6,RT-PCR证实双表达腺病毒能成功转染C3H10细胞,并且转染的C3H10细胞早晚期成骨指标碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色活性较单一表达BMP9或BMP6的腺病毒组均增强。结论双表达重组腺病毒载体AdBMP9、6具有定向诱导C3H10细胞成骨分化的能力,且较单一表达BMP9或BMP6强。 展开更多
关键词 双表达载体 骨形态发生蛋白9 骨形态发生蛋白6 重组腺病毒 成骨
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GFAP启动子调控的双顺反子真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27的构建及表达分析 被引量：2
18
作者 朱舟 徐逸 +3 位作者 田学愎 潘邓记 谢敏杰 王伟 《中国组织化学与细胞化学杂志》 CAS CSCD 2007年第1期34-39,共6页
目的构建并鉴定带GFAP启动子的Flag-p27和EGFP双顺反子真核表达载体,观察其表达。方法利用IRES和GFAP启动子,通过质粒抽提、琼脂糖凝胶电泳、酶切、连接、转化等多种基因工程技术,经多步亚克隆后完成能同时表达p27和EGFP基因的星形胶质... 目的构建并鉴定带GFAP启动子的Flag-p27和EGFP双顺反子真核表达载体,观察其表达。方法利用IRES和GFAP启动子,通过质粒抽提、琼脂糖凝胶电泳、酶切、连接、转化等多种基因工程技术,经多步亚克隆后完成能同时表达p27和EGFP基因的星形胶质细胞特异性真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27。转染体外培养的星形胶质细胞,观察EGFP的表达,并通过免疫荧光细胞化学技术观察p27的表达。结果经酶切鉴定和测序鉴定,成功构建真核表达载体pGFAP-IRES2-EGFP-p27。转染星形胶质细胞后可见EGFP的表达,并且在EGFP阳性的细胞中P27表达水平明显增高。结论GFAP启动子能启动目的基因p27和EGFP在星形胶质细胞的表达,连于Flag-p27的下游EGFP可作为报告基因,指示p27的表达情况。带启动子GFAP的Flag-p27和EGFP双顺反子真核表达载体的构建为进一步研究星形胶质细胞增生与神经系统疾病的关系,并为寻找神经系统疾病的有效基因治疗途径奠定基础。 展开更多
关键词 双顺反子 星形胶质细胞 真核表达载体 细胞周期
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人白细胞介素12双亚基共表达真核载体的构建 被引量：2
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作者 羊东晔 卢放根 +3 位作者 赵水平 汤熙翔 刘小伟 吴小平 《湖南医科大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第4期338-342,共5页
目的 :为满足基因治疗的需要构建人白细胞介素 12 (hIL 12 )双亚基共表达质粒。方法 :先从人胚肾组织的逆转录产物中用PCR方法扩增出它的两个亚基P4 0 和P3 5的cDNA全长 ,分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+/ )中构建单亚基质粒———P(... 目的 :为满足基因治疗的需要构建人白细胞介素 12 (hIL 12 )双亚基共表达质粒。方法 :先从人胚肾组织的逆转录产物中用PCR方法扩增出它的两个亚基P4 0 和P3 5的cDNA全长 ,分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+/ )中构建单亚基质粒———P(+) /P4 0 和P( ) /P3 5,然后再将二者串联克隆入真核表达载体 pcDNA3.1(+)中得到P(+) /IL 12质粒。脂质体转染HepG2后 2 4,48hELISA检测细胞培养上清内hIL 12蛋白质表达。结果 :P(+) /IL 12质粒经酶切和测序证明两亚基连接方向正确 ,序列无突变 ;ELISA检测细胞上清结果证实可表达hIL 12蛋白质。结论 :成功构建P4 0 和P3 5双亚基真核共表达质粒———P(+) /IL 12 ,为模拟hIL 12生理表达方式 ,简化hIL 12基因治疗操作奠定了基础。 展开更多
关键词 人白细胞介素12 双亚基 表达 真核载体 克隆
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HLA-C和HLA-G基因真核细胞双表达载体的克隆及鉴定分析 被引量：1
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作者 张磊 杨珏琴 +2 位作者 姚芳娟 许玲娣 范丽安 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期334-337,342,共5页
目的　构建人HLA C和HLA G基因真核细胞双表达载体。方法　用RT PCR从孕妇蜕膜组织有核细胞总mRNA中逆转录扩增全长HLA C和HLA GcDNA ,首先将HLA G经BamHⅠ和ClaⅠ双酶切 ,HLA C经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后 ,分别定向插入真核细胞双顺反子... 目的　构建人HLA C和HLA G基因真核细胞双表达载体。方法　用RT PCR从孕妇蜕膜组织有核细胞总mRNA中逆转录扩增全长HLA C和HLA GcDNA ,首先将HLA G经BamHⅠ和ClaⅠ双酶切 ,HLA C经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后 ,分别定向插入真核细胞双顺反子载体pVITRO2的多克隆位点 1(mcs1)和 2 (mcs2 )中 ,然后经酶切和测序鉴定 ,确定已建立pVITRO2的单表达质粒pVITRO2 HLA G和pVITRO2 HLA C ,再将HLA CcDNA经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切 ,定向插入单表达质粒pVITRO2 HLA G的多克隆位点 2 (mcs2 )中 ,经PCR反应初筛 ,再经双酶切鉴定。结果　限制性内切酶和测序分析表明已成功构建了HLA Cw 0 10 3和HLA G 0 10 1的单表达质粒pVITRO2 HLA C和pVITRO2 HLA G以及双表达质粒pVITRO2 HLA CG。结论　本研究成功构建了真核细胞双顺反子载体pVITRO2的双表达质粒pVITRO2 HLA CG ,以及单表达质粒pVITRO2 HLA C和pVITRO2 HLA G。 展开更多
关键词 HLA-C HLA-G 双顺反子载体pVITR02 双表达质粒
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