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反式切割CRISPR/Cas技术在食源致病微生物检测方面的原理及应用
1
作者 戴永进 孙静 +3 位作者 张莫然 刘玉娟 陈洪周 陆颖健 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第22期351-360,共10页
食源性致病微生物是食品安全的一大严重威胁,传统的生化检测手段面临着一系列挑战。近年来,随着成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)技术的逐步发展,具有反式切割活性的CRIS... 食源性致病微生物是食品安全的一大严重威胁,传统的生化检测手段面临着一系列挑战。近年来,随着成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)技术的逐步发展,具有反式切割活性的CRISPR/Cas体系受到了越来越多的关注。本文综述了具有反式切割活性的CRISPR/Cas体系的起源与分类,并详细介绍了具有反式切割活性的CRISPR/Cas体系的作用原理。同时,本文对反式切割CRISPR/Cas技术在食源性致病微生物领域的多方面应用进行了综述,并讨论了该技术的优劣和未来发展方向。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas 反式切割 食源性致病菌 核酸检测
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LwaCas13a蛋白的表达纯化与活性分析
2
作者 豆玲 李泽轩 +5 位作者 贾訸潇 张彩云 左富江 李婷 谢元江 段晓雷 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期2941-2950,共10页
【目的】获得高纯度、高浓度、优良反式切割活性的韦德纤毛菌(Leptotrichia wadei)的Cas13a(LwaCas13a)蛋白,为研发基于CRISPR-LwaCas13a系统的动物病毒RNA检测新方法提供重要的生物学工具。【方法】通过PCR、双酶切与连接反应构建pET15... 【目的】获得高纯度、高浓度、优良反式切割活性的韦德纤毛菌(Leptotrichia wadei)的Cas13a(LwaCas13a)蛋白,为研发基于CRISPR-LwaCas13a系统的动物病毒RNA检测新方法提供重要的生物学工具。【方法】通过PCR、双酶切与连接反应构建pET15b-SUMO-LwaCas13a重组质粒,并进行原核诱导表达与条件优化;发酵100 mL大肠杆菌BL21(DE3)菌诱导表达LwaCas13a蛋白后进行纯化,纯化后利用超滤法浓缩蛋白,使用BCA法检测蛋白浓度。将LwaCas13a蛋白、CRISPR RNA(CrRNA)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)靶标RNA及荧光标记单链RNA(ssRNA)探针共孵育,利用全波长荧光分析仪检测CRISPR-LwaCas13a反式切割活性,与商业化Cas13a蛋白进行活性对比,并优化LwaCas13a与CrRNA最佳结合比例。【结果】成功构建重组质粒pET15b-SUMO-LwaCas13a;LwaCas13a重组蛋白的最佳诱导表达条件为0.4 mmol/L IPTG、18℃诱导16 h;经过纯化最终获得95%纯度、7.5 mg/mL浓度的LwaCas13a蛋白。荧光检测结果显示,LwaCas13a蛋白具有明显的反式切割活性,为商业化Cas13a蛋白活性的1.25倍,且LwaCas13a蛋白与CrRNA的最佳结合比例为1∶2。【结论】试验成功表达纯化出高纯度、高浓度的LwaCas13a重组蛋白,其反式切割活性优于商业化Cas13a蛋白,并明确了该蛋白与CrRNA的最佳配比,为利用LwaCas13a进行动物病毒RNA检测新技术的研发提供了依据。 展开更多
关键词 LwaCas13a蛋白 原核表达 SUMO酶切 反式切割活性
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CRISPR/Cas系统在食源性致病菌快速检测新技术中的研究进展 被引量：2
3
作者 寇秀颖 周宝青 +3 位作者 陈玲 代京莎 张菊梅 吴清平 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2023年第7期313-323,共11页
食源性致病菌的早期筛查与快速检测对食品安全和临床诊断至关重要。然而,传统检测方法操作繁琐、费时费力,难以满足快速检测需求。成簇、规则间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)... 食源性致病菌的早期筛查与快速检测对食品安全和临床诊断至关重要。然而,传统检测方法操作繁琐、费时费力,难以满足快速检测需求。成簇、规则间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和关联蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)组成的CRISPR/Cas是广泛存在于细菌和古细菌中的一种免疫系统,其高效特异序列识别及切割活性的特性,为食源性致病菌高灵敏、快速检测提供了一种新的途径。本文介绍了CRISPR/Cas系统的原理、机制及发展,总结了近年来基于CRISPR/Cas系统结合不同结果报告方式用于食源性致病菌快速检测的最新进展,并对其优势、局限性和未来发展方向进行了讨论。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas 食源性致病菌 反式切割 快速检测技术
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基于CRISPR/Cas系统的生物传感器研究进展
4
作者 李倩 范高超 《山东化工》 CAS 2023年第17期111-113,117,共4页
聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关酶(Cas)统称为CRISPR/Cas系统,在许多方面彻底改变了生物学和生物医学研究。CRISPR/Cas系统作为识别和操纵核酸的强大分子机器之一,具有极强的信号放大能力和基因编辑能力。近几年,开发... 聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关酶(Cas)统称为CRISPR/Cas系统,在许多方面彻底改变了生物学和生物医学研究。CRISPR/Cas系统作为识别和操纵核酸的强大分子机器之一,具有极强的信号放大能力和基因编辑能力。近几年,开发了许多基于CRISPR/Cas系统的检测方法用于临床诊断、生物传感和生物成像等领域。通过国内外的研究现状,对CRISPR/Cas系统的几种常见种类及其在生物传感中的应用研究进行概述,为CRISPR/Cas系统在核酸检测以及分子诊断等方面地进一步研究提供了理论基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas系统 反式切割 生物传感
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基于CRISPR/Cas的体外核酸检测体系的研究进展
5
作者 李金成 肖美娇 陈渝萍 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期73-87,共15页
作为当前最先进的检测方法,基于特定核苷酸序列的核酸检测法被广泛地应用于基因分型、病原体和遗传疾病诊断及环境监控等领域。CRISPR/Cas系统可在指导RNA的导引下精准高效地识别和切割目标DNA/RNA,被用于研发新一代高灵敏、高特异性的... 作为当前最先进的检测方法,基于特定核苷酸序列的核酸检测法被广泛地应用于基因分型、病原体和遗传疾病诊断及环境监控等领域。CRISPR/Cas系统可在指导RNA的导引下精准高效地识别和切割目标DNA/RNA,被用于研发新一代高灵敏、高特异性的体外核酸检测技术。重点综述了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13、CRISPR/Cas14系统应用于体外核酸检测的作用机制及高通量多通道检测、目标核酸的富集与扩增和信号输出方式等信号传感方向的技术进展,介绍了CRISPR/Cas核酸检测在监控内源性疾病、病毒、细菌和寄生虫中的新应用,讨论了其优缺点与面临的挑战,并展望了其未来的研究方向,为CRISPR/Cas核酸检测的转化提供参考和依据。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas CAS 蛋白 反式切割活性 核酸检测 病原微生物
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