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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究 被引量：4
1
作者 刘妍 成军 +5 位作者 王建军 白桂芹 王志凌 郭风劲 纪冬 崔玉芳 《肝脏》 2005年第1期24-26,共3页
目的　应用抑制性消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库 ,克隆HCVNS4B蛋白反式激活相关基因。方法　以HCVNS4B表达质粒pcDNA3 .1( ) NS4B... 目的　应用抑制性消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库 ,克隆HCVNS4B蛋白反式激活相关基因。方法　以HCVNS4B表达质粒pcDNA3 .1( ) NS4B转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1( )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,进行抑制性消减杂交分析。将富集的二次PCR产物与T A载体连接 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑取克隆聚合酶链反应 (PCR)扩增后进行测序及同源性分析。结果　文库扩增后得到 3 3个阳性克隆 ,经菌落PCR分析显示其中 2 8个克隆含有大小不等的 2 0 0～ 10 0 0bp插入片段。测序及同源性分析显示 ,12种已知基因编码蛋白 ,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS4B反式激活靶基因。结论　成功构建了HCVNS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,为进一步阐明HCVNS4B反式调节的靶基因在肝炎。 展开更多
关键词 NS4B 非结构蛋白 反式激活基因 克隆化研究 丙型肝炎病毒(HCV) 聚合酶链反应(PCR) CDNA消减文库 抑制性消减杂交分析 反式激活相关基因 HepG2细胞 反式激活靶基因 分子生物学机制 同源性分析 基因编码蛋白 蛋白编码基因
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新基因XTP3反式激活基因TPA的克隆化研究 被引量：1
2
作者 杨艳杰 成军 +4 位作者 陈东风 张黎颖 王春花 吴煜 王建军 《中西医结合肝病杂志》 CAS 2005年第5期277-279,283,共4页
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减文库,克隆XTP3反式激活相关基因。方法:依据我室构建的HBV X蛋白反式激活基因XTP3差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技... 目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减文库,克隆XTP3反式激活相关基因。方法:依据我室构建的HBV X蛋白反式激活基因XTP3差异表达的cDNA消减文库,利用生物信息学技术获得新基因XTP3TPA的编码序列,对其可能的氨基酸序列进行分析比较,并对其进行克隆化研究。结果:发现了HBV XTP3反式激活作用的新的靶基因,命名为XTP3TPA。结论:这一发现为阐明HBV XTP3蛋白的反式激活作用及其机制开辟了新的研究方向。 展开更多
关键词 抑制性消减杂交 克隆 XTP3 反式激活 反式激活基因 克隆化研究 XTP3 新基因 乙型肝炎病毒(HBV) CDNA消减文库 TPA 反式激活相关基因 HBVX蛋白
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应用抑制性消减杂交技术克隆HBV全S蛋白反式激活蛋白1的反式激活基因
3
作者 白桂芹 成军 +3 位作者 张树林 刘妍 刘蔚 张黎颖 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2005年第15期1897-1900,共4页
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白反式激活蛋白1(CSTP1)的反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBVCSTP1反式激活相关基因.方法:以HBVCSTP1表达质粒pcDNA3.1(-)-CSTP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1... 目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白反式激活蛋白1(CSTP1)的反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆HBVCSTP1反式激活相关基因.方法:以HBVCSTP1表达质粒pcDNA3.1(-)-CSTP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,从中提取mKNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建入HBVCSTPl反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到86个白色克隆,进行菌落PCK分析,均得到100-1000bp插入片段.挑取25个含有插入片段的阳性克隆测序分析,获得23个已知基因序列和2个未知基因.未知基因的功能还正在研究中.结论:应用SSH技术成功构建了HBVCSTP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明HBVCSTP1反式调节的靶基因及致肝病发生的分子生物学机制提供理论依据. 展开更多
关键词 抑制性消减杂交技术 反式激活基因 反式激活蛋白1 阳性克隆 S蛋白 CDNA消减文库 HBV 基因差异表达 反式激活相关基因
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因6的反式激活基因的筛选 被引量：5
4
作者 王建军 刘妍 +4 位作者 成军 杨倩 纪冬 党晓燕 王春花 《世界华人消化杂志》 CAS 2004年第1期54-57,共4页
目的:筛选与克隆:NS5A反式激活的新型靶基因NS5ATP6 的反式激活基因,探讨其可能存在的调节功能. 方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin- formatics)技术筛选并克隆NS5ATP6反式激活的新型靶基因.以NS5ATP6表达质粒pcDNA3.... 目的:筛选与克隆:NS5A反式激活的新型靶基因NS5ATP6 的反式激活基因,探讨其可能存在的调节功能. 方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin- formatics)技术筛选并克隆NS5ATP6反式激活的新型靶基因.以NS5ATP6表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP6转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接, 构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建人NS5ATP6反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库.文库扩增后得到33个阳性克隆,进行菌落PCR 分析,均得到200-2 000 bp插入片段.对插入片段测序, 并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得26种编码基因,包括24种已知基因和2种未知基因. 结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了NS5ATP6可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明. 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 非结构蛋白5A反式激活基因6 反式激活基因 筛选
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应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-X蛋白反式激活基因 被引量：1
5
作者 杨倩 张黎颖 +5 位作者 成军 洪源 刘妍 王琳 董菁 张树林 《世界华人消化杂志》 CAS 北大核心 2005年第13期1609-1611,共3页
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆前-X反式激活相关基因,了解该段基因的可能生物学功能. 方法:构建表达质粒pcDNA3.1(-)-前-X,转染HepG2 细胞,以空载体pcDNA3.1... 目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,克隆前-X反式激活相关基因,了解该段基因的可能生物学功能. 方法:构建表达质粒pcDNA3.1(-)-前-X,转染HepG2 细胞,以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照;提取转染后细胞的mRNA,反转录为cDNA.cDNA经RsaI 酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR),将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库.文库扩增后得到45个白色克隆,进行茵落PCR 分析,均得到200-1000 bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得13种已知功能基因序列. 结论:应用SSH技术成功构建了前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明该基因生物学功能提供理论依据. 展开更多
关键词 抑制性消减杂交技术 反式激活基因 克隆 CDNA消减文库 乙型肝炎病毒(HBV) HepG2细胞 X蛋白 基因差异表达 反式激活相关基因 前-X基因 生物信息学分析 生物学功能 pcDNA3 多聚酶链反应 文库扩增 插入片段 同源性分析 PCR扩增
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丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的克隆化研究
6
作者 郭江 成军 +6 位作者 纪冬 赵龙凤 杨瑗 高学松 刘妍 吴顺华 戴久增 《中西医结合肝病杂志》 CAS 2005年第4期209-211,共3页
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法:以HCVF蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1... 目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法:以HCVF蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCVF蛋白反式激活作用的新的靶基因。结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RTPCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCVFTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522。HCVFTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成。结论:HCVF蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌。HCVF反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCVF蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础。 展开更多
关键词 肝炎病毒 丙型 F蛋白 反式激活 基因克隆化 反式激活基因2 丙型肝炎病毒 克隆化研究 抑制性消减杂交分析 HepG2细胞 生物信息学技术
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乙型肝炎病毒X基因异质性及对其反式激活功能的影响 被引量：38
7
作者 刘妍 董菁 +4 位作者 皇甫竞坤 成军 王琳 王刚 李莉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期125-127,共3页
从慢性乙型肝炎病毒 (HBV)感染患者外周血中扩增X基因序列 ,克隆入pGEM Teasy质粒 ,随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果提示 ,HBV长期携带者体内有HBV准种共存 ,X区内存在热点缺失突变区。为了进一步探讨X区突变对X蛋... 从慢性乙型肝炎病毒 (HBV)感染患者外周血中扩增X基因序列 ,克隆入pGEM Teasy质粒 ,随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果提示 ,HBV长期携带者体内有HBV准种共存 ,X区内存在热点缺失突变区。为了进一步探讨X区突变对X蛋白反式激活功能的影响 ,将野生株及不同缺失突变的X基因片段克隆入pcDNA3 1( )载体的EcoRI位点 ,构建重组表达质粒 ,并分别与报告质粒pSV lacZ共转染HepG2细胞 ,提取细胞裂解液 ,检测SV40启动子调控下的 β 半乳糖苷酶表达活性。共转染结果显示 :野生株X蛋白能够反式激活SV40病毒早期启动子。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 X基因 异质性 反式激活 HBV
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究 被引量：43
8
作者 刘妍 陆荫英 +3 位作者 成军 王建军 李莉 张玲霞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期40-43,共4页
应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5A蛋白反式激活相关基因。以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(- ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ,制备转染... 应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5A蛋白反式激活相关基因。以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(- ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到 12 1个阳性克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 115个 2 0 0～10 0 0bp的插入片段 ,对其中的 90个片段测序 ,并进行同源性分析 ,显示 31种已知基因编码蛋白和 15种未知功能基因序列 ,包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示 ,成功构建了HCVNS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,该文库的建立为进一步阐明HCVNS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 非结构蛋白NS5A 反式激活 基因 克隆化
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活SV40病毒早期启动子的研究 被引量：56
9
作者 刘妍 董菁 +6 位作者 成军 钟彦伟 夏小兵 李克 王琳 施双双 段惠娟 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期404-406,共3页
聚合酶链反应 (PCR)扩增HBVX基因 ,克隆至真核表达载体 pVR10 12中 ,构建HBVX基因重组表达载体 pVR10 12 X ;以该质粒转染HepG2细胞 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞X蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pSV lacZ共转染HepG2细胞 ,用试剂盒法... 聚合酶链反应 (PCR)扩增HBVX基因 ,克隆至真核表达载体 pVR10 12中 ,构建HBVX基因重组表达载体 pVR10 12 X ;以该质粒转染HepG2细胞 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞X蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pSV lacZ共转染HepG2细胞 ,用试剂盒法检测 β 半乳糖苷酶表达活性。结果质粒 pVR10 12 X在HepG2细胞瞬时表达X蛋白 ,共转染实验中 pVR10 12 X组 β 半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的 3 2倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达 。 展开更多
关键词 乙肝病毒X基因 真核表达 反式激活 SV40早期启动子 乙型肝炎
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应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因 被引量：58
10
作者 刘妍 成军 +3 位作者 王刚 李克 段惠娟 李莉 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第12期880-883,共4页
应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒 pcDNA3 1( ) core转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1( )为对照 ;制备转染后的细胞裂... 应用抑制性消减杂技术构建丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCV核心蛋白反式激活相关基因。以HCV核心表达质粒 pcDNA3 1( ) core转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1( )为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,从中提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后将实验组cDNA分成 2组 ,分别与 2种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行 2次消减杂交及 2次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果显示 ,成功构建人HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到 2 33个白色克隆 ,进行菌落PCR分析 ,其中 2 13个均得到 10 0～ 10 0 0bp插入片段。挑取 6 3个插入片段测序分析 ,其中 6个cDNA片段为未知序列 ,通过生物信息学分析获得其全长序列 ,已被GenBank收录。提示 6个新的cDNA全长序列 ,可能是HCV核心蛋白反式激活靶基因。 展开更多
关键词 核心蛋白质类 反式激活 消减杂交 丙型肝炎病毒
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3与乙型肝炎病毒X蛋白协同反式激活作用的研究 被引量：15
11
作者 刘妍 成军 +5 位作者 牟劲松 陆荫英 王建军 杨倩 王琳 张玲霞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期47-49,共3页
构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白 3(NS3)的重组表达质粒pcDNA3 1(- ) NS3和表达乙型肝炎病毒 (HBV)X蛋白的重组质粒pcDNA3 1(- ) X ,分别瞬时转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,用免疫印记 (Westernblotting)方法鉴定病毒基因的表达。... 构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白 3(NS3)的重组表达质粒pcDNA3 1(- ) NS3和表达乙型肝炎病毒 (HBV)X蛋白的重组质粒pcDNA3 1(- ) X ,分别瞬时转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,用免疫印记 (Westernblotting)方法鉴定病毒基因的表达。两个表达质粒分别及同时与报告质粒pCAT3 promoter共转染HepG2细胞 ,检测报告基因氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达水平 ,酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV4 0病毒早期启动子功能的影响。结果显示 ,两个重组表达载体pcDNA3 1(- ) NS3及pcDNA3 1(- ) X在HepG2细胞均能瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白 ;单独共转染实验中 pcDNA3 1(- ) NS3、pcDNA3 1(- ) X组的CAT的表达分别是对照的 3 5倍和 4 4倍 ,两种质粒共同转染时酶的表达是对照的 8 5倍 ;表达质粒对CAT酶表达的激活作用呈剂量依赖性。研究表明 ,HepG2细胞中表达的HCVNS3蛋白和HBVX蛋白均具有反式激活SV4 0早期启动子的功能 ,并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性。本实验有助于解释HCV、HBV感染 ,尤其是共同感染的致病 (癌 ) 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 非结构蛋白 NS3 乙型肝炎病毒 X蛋白 协同反式激活 研究
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究 被引量：15
12
作者 刘妍 成军 +5 位作者 牟劲松 陆荫英 王建军 李克 王琳 张玲霞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期44-46,共3页
聚合酶链反应(PCR)扩增丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3基因 ,克隆至真核表达载体pcDNA3 1(- )中 ,构建HCV　NS3基因真核表达载体 pcDNA3 1(- ) NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,免疫印迹方法 (Westernblotting)检测转染... 聚合酶链反应(PCR)扩增丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3基因 ,克隆至真核表达载体pcDNA3 1(- )中 ,构建HCV　NS3基因真核表达载体 pcDNA3 1(- ) NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞 ,免疫印迹方法 (Westernblotting)检测转染细胞中HCVNS3蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pCAT3 promoter共转染HepG2细胞 ,用酶联免疫吸附方法 (ELISA)检测细胞中氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。结果显示 ,质粒pcDNA3 1(- ) NS3在HepG2细胞瞬时表达HCVNS3蛋白 ,共转染实验中pcDNA3 1(- ) NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的 4 6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白 ,并能够反式激活SV4 0病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCVNS3蛋白反式激活的靶基因 。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 非结构蛋白NS3 反式激活 SV40病毒 早期启动子
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP4的克隆化研究 被引量：7
13
作者 刘妍 王春花 +5 位作者 成军 杨倩 王建军 纪冬 党晓燕 张玲霞 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期380-382,共3页
目的　筛选并克隆乙型肝炎病毒X蛋白 (HBxAg)反式激活新型靶基因。方法　以HBxAg表达质粒 pcDNA3.1( ) X转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3.1( )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析 ,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进... 目的　筛选并克隆乙型肝炎病毒X蛋白 (HBxAg)反式激活新型靶基因。方法　以HBxAg表达质粒 pcDNA3.1( ) X转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3.1( )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析 ,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3.1( ) X的HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术扩增 ,获得阳性克隆之后 ,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果　该新基因的编码序列全长为 348个核苷酸 (nt) ,编码产物由 116个氨基酸残基 (aa)组成 ,并测序证实 ,命名为XTP4 ,在GenBank中注册 ,注册号为AF4 90 2 5 3。结论　通过分子生物学技术与生物信息学技术的结合 ,发现并鉴定、克隆HBxAg反式激活作用的新型靶基因XTP4 。 展开更多
关键词 肝炎病毒 乙型 X蛋白 反式激活 基因克隆化
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应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因 被引量：20
14
作者 牟劲松 刘妍 +6 位作者 王刚 成军 段惠娟 李克 陆荫英 王琳 王惠芬 《世界华人消化杂志》 CAS 2003年第4期399-403,共5页
目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因。方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后... 目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因。方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1000 b插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因。结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 抑制性消减杂交技术 非结构蛋白3 克隆 细胞裂解液 病毒蛋白 NS3 反式激活 基因
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丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因10的克隆化研究 被引量：13
15
作者 成军 刘妍 +4 位作者 洪源 王琳 钟彦伟 董菁 王刚 《世界华人消化杂志》 CAS 2003年第7期935-938,共4页
目的:丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白5A(NS5A)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因,我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析.研究结果... 目的:丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白5A(NS5A)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因,我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析.研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物.以含有全长HCV-H株cDNA的pBRTM-3011质粒DNA作为模板,进行多聚酶链反应(PCR)扩增,将获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A.以pcDNA3.1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术(bioinformatics),克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因.结果:构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.以pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析.应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因,命名为NS5ATP10,新基因的编码基因序列全长为717个核苷酸(nt),编码产物由238个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV NS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白.微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术.发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为阐明HCV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向. 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 非结构蛋白5A 反式激活基因10 克隆 靶基因
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截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的初步研究 被引量：32
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作者 刘妍 成军 +5 位作者 董菁 李克 夏小兵 王刚 杨继珍 王琳 《肝脏》 2001年第1期8-10,共3页
目的　探讨乙型肝炎病毒 (HBV )表面抗原中蛋白羧基末端缺失突变体 (MHBst)的反式激活功能。方法　用聚合酶链反应 (PCR)扩增截短的HBV表面抗原中蛋白 (MHBst167)基因 ,克隆至真核表达载体 pcDNA3 .1(-)中 ,转染COS 7细胞 ,酶联免疫吸附... 目的　探讨乙型肝炎病毒 (HBV )表面抗原中蛋白羧基末端缺失突变体 (MHBst)的反式激活功能。方法　用聚合酶链反应 (PCR)扩增截短的HBV表面抗原中蛋白 (MHBst167)基因 ,克隆至真核表达载体 pcDNA3 .1(-)中 ,转染COS 7细胞 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞MHBst167蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒 pSV lacZ共转染COS 7细胞 ,检测 β 半乳糖苷酶的活性。 结果　构建成含有约 5 0 0bp基因的质粒 pcDNA3 .1(-) Mt ,在COS 7细胞表达出相应蛋白 ,对pSV lacZ的表达具有反式激活作用。 结论　构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达 ,并具有反式激活功能。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 截短 反式激活 表面抗原 MHBs^t
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因10的克隆化研究 被引量：9
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作者 成军 刘妍 +4 位作者 洪源 王琳 钟彦伟 董菁 王刚 《世界华人消化杂志》 CAS 2003年第7期925-929,共5页
目的:乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)是一种具有反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索HBxAg蛋白反式激活作用新的靶基因,利用基因芯片技术(DNA chips)对于表达和不表达HBxAg的hepG2细胞的基因表达谱进行比较,以期发现HBxAg蛋白反式激活作... 目的:乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)是一种具有反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索HBxAg蛋白反式激活作用新的靶基因,利用基因芯片技术(DNA chips)对于表达和不表达HBxAg的hepG2细胞的基因表达谱进行比较,以期发现HBxAg蛋白反式激活作用的新靶点,为阐明HBxAg的反式激活作用分子生物学机制,以及HBV相关的肝细胞癌(HCC)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向.方法:以含有2拷贝头尾连接的HBV DNA的质粒pCP10作为模板,根据ayw亚型的HBV DNA序列设计、合成引物,PCR扩增产物克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,转染肝母细胞瘤细胞系hepG2,提取RNA并进行逆转录.进行基因芯片技术分析.以生物信息学技术,克隆、鉴定新基因.结果:在16种HBxAg上调的靶基因中,其中包括未知功能基因,利用生物信息学技术,获得HBxAg蛋白反式激活作用的新型靶基因,开放读码框架(ORF)长度为1 206个核苷酸(nt),编码产物由401个氨基酸残基(aa)组成,命名为XTP10.结论HBxAg是一种具有反式激活作用的蛋白.基因芯片技术是进行基因表达谱分析的可靠、有效技术.分子克隆技术结合生物信息学技术,是目前鉴定、克隆未知功能新基因的有效技术途径. 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒 X蛋白 反式激活基因10 克隆 基因芯片技术 基因表达谱
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乙型肝炎病毒 X 蛋白反式激活基因6的克隆和鉴定 被引量：8
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作者 纪冬 成军 +4 位作者 刘妍 王建军 杨倩 党晓燕 王春花 《世界华人消化杂志》 CAS 2003年第12期1874-1877,共4页
目的:乙型肝炎病毒(HBV)X 蛋白(HBxAg)是一种具有反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索 HBxAg 蛋白反式激活作用的新的靶基因,利用抑制性消减杂交(SSH)技术对于表达和不表达 HBxAg 蛋白的 HepG2细胞进行研究,以期发现HBxAg 蛋白反式激活... 目的:乙型肝炎病毒(HBV)X 蛋白(HBxAg)是一种具有反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索 HBxAg 蛋白反式激活作用的新的靶基因,利用抑制性消减杂交(SSH)技术对于表达和不表达 HBxAg 蛋白的 HepG2细胞进行研究,以期发现HBxAg 蛋白反式激活作用的新靶点,为阐明 HBxAg 蛋白的反式激活作用分子生物学机制,以及 HBV 相关的肝细胞癌(HCC)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向.方法:以 HBxAg 表达质粒 pcDNA3.1(-)-HBxAg 转染 HepG2细胞,以空载体 pcDNA3.1(-)为平行对照,提取 mRNA 并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与 GenBank 中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak 规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,克隆、鉴定新型基因.结果:在16种 HBxAg 蛋白上调的靶基因中,其中包括未知功能基因,利用生物信息学技术,获得 HBxAg 蛋白反式激活作用的新型靶基因,开放读码框架(ORF)长度为237个核苷酸(nt),编码产物由78个氨基酸残基(aa)组成,命名为XTP6,在 GenBank 中注册,注册号为 AF490255.结论:HBxAg 蛋白是一种具有反式激活作用的蛋白,应用抑制性消减杂交技术成功筛选与克隆 HBxAg 蛋白反式激活新型靶基因 XTP6,为进一步阐明 HBxAg 蛋白反式调节作用及其在 HBV 感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法. 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒X蛋白 反式激活基因 克隆 鉴定 生物信息学技术
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丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活SV40病毒早期启动子/增强子的研究 被引量：32
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作者 刘妍 成军 +3 位作者 邵得志 王琳 钟彦伟 夏小兵 《军医进修学院学报》 CAS 2001年第3期186-188,共3页
目的 :探讨丙型肝炎病毒核心蛋白的反式激活作用。方法 :以重组质粒pcDNA3 core(含有HCV核心蛋白编码基因 )转染HepG2细胞 ,从转录和翻译水平鉴定核心蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pSV lacZ共转染HepG2细胞 ,检测 β 半乳糖苷酶表达活性 ... 目的 :探讨丙型肝炎病毒核心蛋白的反式激活作用。方法 :以重组质粒pcDNA3 core(含有HCV核心蛋白编码基因 )转染HepG2细胞 ,从转录和翻译水平鉴定核心蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒pSV lacZ共转染HepG2细胞 ,检测 β 半乳糖苷酶表达活性 ,酶的活性反映了表达的核心蛋白对SV40病毒早期启动子 /增强子功能的影响。结果 :质粒pcDNA3 core在HepG2细胞瞬时表达核心蛋白 ,共转染实验中pcDNA3 core组 β 半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的 5 4倍。结论 :HepG2细胞中表达的核心蛋白具有反式激活SV40早期启动子 /增强子的特性 。 展开更多
关键词 反式激活 遗传学 多瘤病毒 猕猴 丙型肝炎病毒核心蛋白 丙型肝炎 启动子/增强子 HCV
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Ⅱ类抗原反式激活因子与HLA-DR抗原的关系及其意义(英文) 被引量：5
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作者 徐开林 李慧 +6 位作者 潘秀英 李振宇 鹿群先 张颖 主鸿鹄 杜冰 曾令宇 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2007年第1期147-151,共5页
本研究探讨Ⅱ类抗原反式激活因子(CIITA)和人类白细胞抗原(HLA-DR)表达时相的关系和差异,及STAT1-α反义寡核苷酸(STAT1-αAS)对CIITA和HLA-DR的抑制作用。分离健康志愿者外周血T淋巴细胞,给予不同剂量干扰素-γ(IFN-γ)后,用RT-PCR法检... 本研究探讨Ⅱ类抗原反式激活因子(CIITA)和人类白细胞抗原(HLA-DR)表达时相的关系和差异,及STAT1-α反义寡核苷酸(STAT1-αAS)对CIITA和HLA-DR的抑制作用。分离健康志愿者外周血T淋巴细胞,给予不同剂量干扰素-γ(IFN-γ)后,用RT-PCR法检测CIITAmRNA,Westernblot分析HLA-DR抗原表达,然后给予不同浓度STAT1-αAS和STAT1-α寡核苷酸有义链(STAT1-αS),再次检测CIITAmRNA和HLA-DR的表达。结果表明:CIITAmRNA在IFN-γ作用后5小时开始表达,14小时达峰值;HLA-DR在28小时后可被检测出,52小时达高峰。5、10和20μmol/LSTAT1-αAS作用于细胞后,CIITAmRNA的表达显著低于对照组(P<0.01),而在S组明显高于AS处理组(P<0.01),S组与对照组间无显著差异;HLA-DR的表达可被STAT1-αAS抑制,AS组仅为对照组的64.3%(P<0.01),S组与对照组间仍无差异;STAT1-αAS作用后,HLA-DR变化同CIITA。结论:CIITAmRNA表达与HLA-DR表达呈正相关且早于后者;STAT1-αAS可特异性抑制CIITA和HLA-DR的表达,并能预防T淋巴细胞激活,CIITA在移植免疫病因中起重要作用。 展开更多
关键词 Ⅱ类抗原反式激活因子 HLA-DR STAT1-α 反义寡核苷酸 干扰素-Γ
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