反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)快速检测基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒 被引量：1

1

作者 陈耀 仲欣雨 +8 位作者 吴陈雨 丁雪 黄璟 王欢莉 范忠军 孙静 陈星逸 余树培 夏文龙 《中国动物检疫》 CAS 2023年第1期121-127,共7页

为建立一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速检测方法,根据其ORF6基因保守序列设计了3对特异性引物,通过引物筛选及条件优化,建立了基因2型PRRSV的反转录-重组酶介导... 为建立一种基因2型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的快速检测方法,根据其ORF6基因保守序列设计了3对特异性引物,通过引物筛选及条件优化,建立了基因2型PRRSV的反转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA)快速检测方法。结果显示:该方法在40℃恒温孵育25 min即可完成靶序列扩增;特异性强,和猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒均无交叉反应;灵敏度高,最低检出限为2×10^(0)TCID_(50)/μL,是常规RT-PCR方法的10倍;应用该方法对39份疑似PRRSV感染的临床样品进行检测,检出阳性样品25份,和实验室前期建立的荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。以上结果说明,本研究建立的RT-RAA检测方法简便快速、特异性强、灵敏度高、临床适用性好,为PRRSV感染的快速诊断提供了新的技术手段。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 基因2型 反转录-重组酶介导等温扩增 快速检测

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双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

2

作者 邓迎春 郭旭光 +3 位作者 牛会敏 任宝红 韩小改 郭瑞 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第12期151-157,共7页

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型... 目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。 展开更多

关键词 荧光逆转录-聚合酶链式反应 恒温荧光逆转录-重组酶介导等温扩增 GⅠ型诺如病毒 GⅡ型诺如病毒

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反转录-环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测马铃薯病毒 被引量：2

3

作者 陈恩发 李其义 +2 位作者 邓宽平 卢扬 彭慧元 《贵州农业科学》 CAS 2015年第3期74-77,共4页

为寻求低成本快速准确灵敏度高的马铃薯病毒检测方法,根据马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的外壳蛋白基因序列设计4条特异引物,建立LAMP检测技术。结... 为寻求低成本快速准确灵敏度高的马铃薯病毒检测方法,根据马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的外壳蛋白基因序列设计4条特异引物,建立LAMP检测技术。结果表明:LAMP检测方法灵敏度下限是10个拷贝的病毒量,该方法检测PVX、PVY和PLRV特异性好,灵敏度高,1h可完成检测,且检测成本低。 展开更多

关键词 马铃薯X病毒 马铃薯Y病毒 马铃薯卷叶病毒 反转录-环介导等温扩增技术 (RT-LAMP) 病毒检测

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基于反转录环介导等温扩增技术检测大肠杆菌O157 被引量：4

4

作者 梁玉林 刘秀 +2 位作者 周鹏飞 周振森 尹建军 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期59-65,共7页

建立反转录环介导等温扩增(Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification RT-LAMP)方法特异性检测大肠杆菌O157。针对大肠杆菌O157的特异性保守rfb E基因设计多组引物,通过对引物筛选和反应条件优化,建立了检测大肠杆... 建立反转录环介导等温扩增(Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification RT-LAMP)方法特异性检测大肠杆菌O157。针对大肠杆菌O157的特异性保守rfb E基因设计多组引物,通过对引物筛选和反应条件优化,建立了检测大肠杆菌O157的实时荧光RT-LAMP方法。利用大肠杆菌O157及其人工污染脱脂乳样品,研究了方法的特异性和灵敏度,并与r RTPCR(Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)方法的灵敏度进行比较。结果显示,等温65℃条件下,30 min内能完成RT-LAMP扩增反应。所建立的实时荧光RT-LAMP方法特异性强,除了2株大肠杆菌O157以外其余菌株均未产生特异性扩增反应。同时该方法灵敏度高,对人工污染脱脂乳样品检测灵敏度能达到20 CFU/g,比r RT-PCR方法高10倍。建立的实时荧光RT-LAMP方法将为大肠杆菌O157现场快速检测提供有力手段。 展开更多

关键词 反转录-环介导等温扩增 大肠杆菌O157 检测 脱脂乳

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重组酶介导的等温扩增法检测H7N9禽流感病毒 被引量：7

5

作者 赵康辰 崔仑标 +6 位作者 葛以跃 陈银 朱小娟 刘宾 史智扬 朱凤才 周明浩 《江苏预防医学》 CAS 2016年第5期524-526,530,共4页

目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成... 目的建立H7N9禽流感病毒一步法逆转录重组酶介导的等温扩增的检测方法(RT-RAA)。方法根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物、探针,建立RT-RAA方法,研究其特异性、敏感性,并与Realtime RT-PCR方法进行比较。结果成功建立了H7N9禽流感病毒RT-RAA检测方法,H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10copy/μL和100copy/μL,且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高,Kappa检验u系数为0.933。结论建立的RT-RAA检测方法具有快速、特异及灵敏的特点,为H7N9禽流感病毒的快速检测提供了新的分子工具。 展开更多

关键词 H7N9禽流感病毒 逆转录-重组酶介导的等温扩增技术 快速检测

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用重组酶介导等温核酸扩增技术检测烟曲霉 被引量：5

6

作者 廖新辉 易浔飞 +1 位作者 崔智慧 兰小鹏 《临床检验杂志》 CAS CSCD 2015年第3期214-218,共5页

目的建立检测烟曲霉的重组酶介导等温核酸扩增技术（RPA）方法。方法筛选针对烟曲霉ITS1-2靶DNA序列的特异性引物。建立RPA快速检测烟曲霉方法并进行条件优化。分析RPA特异性和敏感性并与Taq PCR结果进行比较。结果RPA检测烟曲霉的优化... 目的建立检测烟曲霉的重组酶介导等温核酸扩增技术（RPA）方法。方法筛选针对烟曲霉ITS1-2靶DNA序列的特异性引物。建立RPA快速检测烟曲霉方法并进行条件优化。分析RPA特异性和敏感性并与Taq PCR结果进行比较。结果RPA检测烟曲霉的优化条件为：引物长度：18-30 bp;产物长度：200-700 bp;扩增温度：37-42℃,最低在27℃也可实现扩增;扩增时间：15-40 min,15 min即可达到凝胶电泳可检测的产物量;只需简单的恒温加热设备。RPA和Taq PCR可检测到的最低DNA浓度均为100 ng/m L。RPA仅对烟曲霉有特异性扩增,对黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、中国红酵母均无交叉扩增反应。结论建立的针对烟曲霉ITS1-ITS2靶DNA序列的RPA检测方法,可以快速、特异、灵敏地鉴定和检测烟曲霉。 展开更多

关键词 重组酶介导等温核酸扩增技术 转录间隔区1-2 烟曲霉

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单增李斯特菌反转录环介导等温扩增检测方法的建立 被引量：10

7

作者 徐匆 罗华建 +5 位作者 黄皓 梁卫驱 胡珊 李艳芳 胡楚维 罗鸿斌 《现代食品科技》 EI CAS 北大核心 2020年第6期297-302,共6页

本研究针对单增李斯特菌的快速检测方法进行开发,首先根据单增李斯特菌hly A基因序列保守区设计2对引物,在同一体系中对单增李斯特菌的RNA进行反转录及环介导等温扩增,同时使用羟基萘酚蓝(终浓度200μM)作为反转录环介导等温扩增产物的... 本研究针对单增李斯特菌的快速检测方法进行开发,首先根据单增李斯特菌hly A基因序列保守区设计2对引物,在同一体系中对单增李斯特菌的RNA进行反转录及环介导等温扩增,同时使用羟基萘酚蓝(终浓度200μM)作为反转录环介导等温扩增产物的指示剂,在不开盖进行凝胶电泳检测的情况下,可直接根据体系颜色变化判读结果,能够在20 h内(包括增菌时间)检测出样本中是否存在单增李斯特菌的RNA。本研究建立的RT-LAMP-HNB检测方法对单增李斯特菌RNA的检出限为5.8×10^-3μg/m L,起始接种浓度检出限为10 CFU/10 mL,灵敏度是RT-PCR的10倍,且能够检测出是牛奶中否存在的单增李斯特活菌,具有实际应用价值。本研究开发的检测方法具有快速、准确、便捷、灵敏度高等特点,适用于在基层或不便利地区推广使用。 展开更多

关键词 单增李斯特菌 反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP) 羟基萘酚蓝(HNB) hlyA基因 快速检测

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环介导等温扩增技术在SARS-CoV-2核酸检测中的应用研究 被引量：1

8

作者 何祯硕 高盼 +1 位作者 张丽月(综述) 刘万红(审校) 《国际检验医学杂志》 CAS 2022年第24期3064-3069,共6页

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的高度传染性导致全球SARS-CoV-2感染病例迅速增加。寻找一种较传统实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术更加准确、快速的检测方法对疾病确诊及疫情防控尤为重要。环介导等温扩增技术(LAMP... 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的高度传染性导致全球SARS-CoV-2感染病例迅速增加。寻找一种较传统实时反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术更加准确、快速的检测方法对疾病确诊及疫情防控尤为重要。环介导等温扩增技术(LAMP)与反转录酶相结合(RT-LAMP)已成功应用于SARS与中东呼吸综合征的检测,在SARS-CoV-2检测中亦表现出潜在优势。该文对SARS-CoV-2的结构特点、人类感染机制、LAMP的检测原理及其在SARS-CoV-2检测中的应用研究进展进行详细综述,以期为临床提供一种较RT-PCR更加快速、特异且具有明显成本-效益的SARS-CoV-2核酸检测方法。 展开更多

关键词 反转录环介导等温扩增 实时反转录荧光定量聚合酶链反应 严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2

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环介导等温扩增技术检测菊花中番茄不孕病毒 被引量：14

9

作者 刘佳 黄丛林 +2 位作者 吴忠义 张秀海 王永勤 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期1288-1294,共7页

【目的】环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术。本研究拟用该技术建立菊花中番茄不孕病毒(TAV)的检测方法。【方法】设计能识别TAV CP序列6个特定区域的4种LAMP特异... 【目的】环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术。本研究拟用该技术建立菊花中番茄不孕病毒(TAV)的检测方法。【方法】设计能识别TAV CP序列6个特定区域的4种LAMP特异引物,对MgCl2、dNTPs、甜菜碱等LAMP反应条件进行优化,利用新建的LAMP法检测TAV,比较LAMP和RT-PCR2种不同方法的检测灵敏度。【结果】建立了检测番茄不孕病毒的LAMP技术;LAMP比RT-PCR具有灵敏度更高、快速、简便等优点。【结论】建立的LAMP技术能快速、准确、简便地检测出菊花中的番茄不孕病毒。 展开更多

关键词 菊花 番茄不孕病毒 反转录聚合酶链式反应 环介导等温核酸扩增技术 检测

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环介导等温扩增技术检测建兰花叶病毒 被引量：9

10

作者 许春英 李逢慧 罗超 《现代农业科技》 2009年第8期11-12,14,共3页

为了建立检测建兰花叶病毒的快速实用分子生物学技术,该研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——体外等温扩增检测方法。设计了4条针对目的基因的6个位点的特异性引物,建立了一套从核酸... 为了建立检测建兰花叶病毒的快速实用分子生物学技术,该研究借助新兴的环介导等温扩增技术,建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——体外等温扩增检测方法。设计了4条针对目的基因的6个位点的特异性引物,建立了一套从核酸抽提到LAMP检测快速检测方法。所建立的检测方法比RT-PCR更灵敏;且具有特异性,操作简单,不需要复杂的仪器,肉眼可直接观察检测结果。适合基层和现场检测。 展开更多

关键词 建兰花叶病毒 反转录聚合酶链反应 环介导等温扩增技术

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逆转录环介导等温扩增技术

11

《中国猪业》 2010年第12期45-45,共1页

逆转录环介导等温扩增技术（Reverse Transcription Loop,Mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP）是一种新颖的RNA扩增方法。其基本原理是采用4到6条特异引物（针对基因的6到8个区域）及一种具有链置换活性的DNA聚合酶和AMV反转... 逆转录环介导等温扩增技术（Reverse Transcription Loop,Mediated Isothermal Amplification, RT-LAMP）是一种新颖的RNA扩增方法。其基本原理是采用4到6条特异引物（针对基因的6到8个区域）及一种具有链置换活性的DNA聚合酶和AMV反转录酶． 展开更多

关键词 扩增技术 逆转录 等温 介导 DNA聚合酶 Loop 扩增方法 反转录酶

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基于ORF7基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-RAA检测方法的建立

12

作者 于娜 马佳镁 +6 位作者 张紫薇 黄春媛 范悦轩 郑佳馨 张艳 刘光亮 曹宗喜 《动物医学进展》 北大核心 2024年第8期117-119,共3页

根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)... 根据GenBank公布的ORF7基因保守序列设计了特异性引物,建立了PRRSVORF7基因反转录-重组酶介导等温扩增(RT-RAA)荧光法快速检测方法。结果表明,RT-RAA荧光法在42℃、20min内即可检测到PRRSV特异性扩增曲线,最低检测浓度为9.9×10^(6)copies/μL;与PRVBartha-K61、PCV、CSFV、PRRSVGD、PRRSVXH-GD、PRRSVGM2、PRRSVCH-1a病毒均无交叉反应。分别对157份样品进行荧光RT-RAA法与PCR方法的检测进行比对,结果显示,荧光RT-RAA法敏感性为94.0%,特异性为100%。建立的PRRSV荧光RT-RAA法操作简便,特异性强,灵敏度高。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF7基因 反转录-重组酶介导等温扩增 特异性 灵敏度

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烟草番茄斑萎病毒RT-LAMP检测体系的建立及优化

13

作者 张俊蕾 盖晓彤 +4 位作者 赵正婷 刘弟 王金凤 姜宁 刘雅婷 《中国农业科技导报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期140-150,共11页

为快速检测烟草番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV),基于TSWV核外壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)保守序列设计5组引物进行筛选,采用单一变量法对反应温度、时间及反应体系中dNTPs、Mg^(2+)、甜菜碱的含量和内外引物比等参... 为快速检测烟草番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV),基于TSWV核外壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)保守序列设计5组引物进行筛选,采用单一变量法对反应温度、时间及反应体系中dNTPs、Mg^(2+)、甜菜碱的含量和内外引物比等参数进行优化,建立烟草TSWV反转录环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测体系,并采用RT-PCR(revers transcription-polymerase chain reaction)检测方法进行平行比对试验,验证优化后RT-LAMP的特异性、灵敏性及实用性。结果表明,烟草TSWV RT-LAMP检测体系最佳引物组为TS-N-4,在25μL的反应体系中各组分最佳加入量为缓冲液2.5μL、100 mmol·L^(-1) MgSO40.5μL、10 mmol·L^(-1) dNTPs 0.5μL、10 mmol·L^(-1) FIP/BIP 1.5μL、10 mmol·L^(-1) F3/B30.5μL、10 mmol·L^(-1) LF/LB 1.5μL、5 mmol·L^(-1) Betaine 6μL、Bst 2.0 WarmStar DNA Polymerase(8000 U·mL-1)0.5μL、M-MLV酶(10000 U·mL^(-1))0.125μL、RNA(≥64.7 fg)1μL,DEPC H2O补至25μL;最佳反应温度和时间分别为58℃、60 min。优化后的RT-LAMP灵敏度是RT-PCR的1000倍,且田间样品检测结果与RT-PCR相符。建立的RT-LAMP方法特异性强、灵敏度高、操作简单,对于烟草TSWV的检测及监控有重要意义。 展开更多

关键词 番茄斑萎病毒 NP基因 反转录-环介导等温扩增 快速检测

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基于单一基因的反转录-环介导等温核酸扩增技术快速检测甲型副伤寒沙门菌 被引量：3

14

作者 王鸣柳 闫梅英 +1 位作者 阚飙 樊粉霞 《疾病监测》 CAS 2014年第9期752-757,共6页

目的建立反转录-环介导等温核酸扩增（RT-LAMP）方法特异检测甲型副伤寒沙门菌。方法针对甲型副伤寒沙门菌特异保守hsdM基因设计引物,通过优化反应条件,建立检测该靶基因的RT-LAMP体系。利用多种血清型沙门菌及非沙门菌菌株DNA评价该方... 目的建立反转录-环介导等温核酸扩增（RT-LAMP）方法特异检测甲型副伤寒沙门菌。方法针对甲型副伤寒沙门菌特异保守hsdM基因设计引物,通过优化反应条件,建立检测该靶基因的RT-LAMP体系。利用多种血清型沙门菌及非沙门菌菌株DNA评价该方法的特异性及敏感性。同时对甲型副伤寒沙门菌全血模拟标本及粪便模拟标本进行敏感性检测,并利用临床样本进行初步验证。结果等温65℃条件下,30～60 min内完成RTLAMP反应,利用该方法检测130株甲型副伤寒沙门菌均为阳性,其他非甲型副伤寒沙门菌均扩增阴性。对纯菌RNA检测中检测下限为50 pg/反应,约为19 000个拷贝/反应。在以全血模拟样本的检测中,敏感性达80 cfu/ml,略高于PCR检测低限。对粪便模拟标本的检测中,对原始样品检测下限为500 cfu/g;增菌后样品检测下限为0.8 cfu/g,比PCR检测低限高2～10倍。临床样本中甲型副伤寒患者血液标本检测均阳性,而伤寒样本检测均阴性。结论建立了敏感性高、特异性好的检测甲型副伤寒沙门菌的RT-LAMP方法,为甲型副伤寒沙门菌感染的快速诊断提供了简易手段,可试用于甲型副伤寒的早期诊断。 展开更多

关键词 甲型副伤寒沙门菌 反转录-环介导等温核酸扩增技术 甲型副伤寒

原文传递

基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒快速检测方法的建立

15

作者 于晶雪 韦珊珊 +9 位作者 覃绍敏 吴健敏 杨丽华 陈凤莲 许力士 秦树英 华俊 韦珏 方芳 刘金凤 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3237-3246,共10页

[目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]... [目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3′-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×10^(6)、5.62×10^(3)、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。[结果]本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。[结论]本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA) CRISPR/Cas12系统

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基于反转录-环介导等温扩增技术检测沙门氏菌 被引量：9

16

作者 梁玉林 刘秀 +2 位作者 周振森 周鹏飞 尹建军 《微生物学通报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期2293-2300,共8页

【背景】沙门氏菌是世界上最常见的食源性致病菌之一,全球每年沙门氏菌中毒事件居细菌性中毒事件首位。【目的】建立反转录-环介导等温扩增(Reversetranscriptaseloop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术特异性检测沙门氏... 【背景】沙门氏菌是世界上最常见的食源性致病菌之一,全球每年沙门氏菌中毒事件居细菌性中毒事件首位。【目的】建立反转录-环介导等温扩增(Reversetranscriptaseloop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术特异性检测沙门氏菌。【方法】针对沙门氏菌特异保守invA基因设计多组引物,通过对引物筛选和反应条件优化,建立了检测沙门氏菌的实时荧光RT-LAMP方法。利用沙门氏菌及其人工污染脱脂乳样品,研究了方法的特异性和灵敏性,并与RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain)方法的灵敏度进行比较。【结果】等温65°C条件下30min内可完成RT-LAMP反应。利用该方法检测5株沙门氏菌均为阳性,其余21种检测菌株为阴性。在人工污染脱脂乳样品的检测中,灵敏度达到60 CFU/g,比RT-PCR方法高100倍。【结论】建立的实时荧光RT-LAMP方法将为沙门氏菌现场快速检测提供有力手段。 展开更多

关键词 反转录-环介导 等温扩增 沙门氏菌 检测 脱脂乳

原文传递

基于荧光重组酶介导等温扩增技术的利什曼原虫核酸检测方法的建立 被引量：5

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作者 林红 赵松 +3 位作者 刘燕红 邵雷 应清界 杨坤 《中国血吸虫病防治杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期452-456,463,共6页

目的建立一种基于荧光重组酶介导等温扩增(recombinase-aided isothermal amplification,RAA)技术的检测利什曼原虫核酸的方法。方法针对利什曼原虫内转录间隔基因序列1(ITS1)基因设计用于RAA检测的特异性引物和探针,通过引物配对筛选... 目的建立一种基于荧光重组酶介导等温扩增(recombinase-aided isothermal amplification,RAA)技术的检测利什曼原虫核酸的方法。方法针对利什曼原虫内转录间隔基因序列1(ITS1)基因设计用于RAA检测的特异性引物和探针,通过引物配对筛选、引物和探针浓度优化,建立检测利什曼原虫核酸的荧光RAA法。分别以构建的含利什曼原虫ITS1基因序列的不同拷贝数重组质粒和不同浓度利什曼原虫基因组DNA为模板进行RAA扩增,评估其检测灵敏度;以田鼠巴贝西虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫等其他经输血传播的寄生虫基因组DNA为模板进行RAA扩增,评价其检测特异度。结果从9对引物组合中筛选出1对最佳引物对后,引物和探针终浓度经优化分别确定为0.3μmol/L和0.08μmol/L。所建立的荧光RAA法在39℃等温条件下20 min内可完成样本核酸检测。采用建立的RAA法对田鼠巴贝西虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫、杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫等8种寄生虫基因组DNA进行检测,杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫基因组DNA在5 min内即出现明显荧光信号,与田鼠巴贝西虫、刚地弓形虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、恶性疟原虫、三日疟原虫无交叉反应。以含利什曼原虫ITS1基因序列的重组质粒为模板,荧光RAA法最低检测限为10拷贝/μL;以利什曼原虫基因组DNA为模板,荧光RAA法最低检测限为1 fg/μL。结论成功建立了一种基于荧光RAA法的利什曼原虫核酸检测技术,该方法反应快速、操作简便、灵敏度和特异度均较高,可用于利什曼原虫病流行区现场筛查。 展开更多

关键词 杜氏利什曼原虫 婴儿利什曼原虫 荧光重组酶介导的等温扩增 核酸检测 内转录间隔基因序列1 检测效果

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利用反转录环介导等温扩增技术检测麻疹病毒 被引量：1

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作者 李淑华 刘岩 曹广文 《中华流行病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期186-189,共4页

目的建立一种快速检测麻疹病毒的方法。方法以分离到的麻疹病毒RNA为模板，利用环介导等温扩增技术（LAMP）原理，设计合成3套引物，特异型识别病毒基因的8个位点，在反转录酶作用下，63℃扩增60min，80℃2min终止反应，最终产物分别经... 目的建立一种快速检测麻疹病毒的方法。方法以分离到的麻疹病毒RNA为模板，利用环介导等温扩增技术（LAMP）原理，设计合成3套引物，特异型识别病毒基因的8个位点，在反转录酶作用下，63℃扩增60min，80℃2min终止反应，最终产物分别经凝胶电泳和荧光目视观察。通过real—time仪实时监测反应过程，同时将该方法的灵敏度、特异度与常规RT-PCR、real-timeRT-PCR进行比较。结果RT-LAMP反应约1h即可完成，最终产物经电泳观察可见大小片段不等的呈梯度的扩增条带，目视显示反应液颜色由黄色变为绿色。灵敏性是常规RT-PCR和real—timeRT-PCR的100倍。结论RT-LAMP方法具有灵敏、特异、快速、简便、成本低等特点，适用于基层和现场使用。 展开更多

关键词 麻疹病毒 反转录环介导等温扩增 反转录-聚合酶链反应

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猪附红细胞体重组酶介导等温扩增技术(RAA)荧光检测方法的建立 被引量：3

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作者 杜秋明 郑秀红 +5 位作者 樊晓旭 赵永刚 乔启波 南文龙 许龙春 吴晓东 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期2181-2185,共5页

为建立一种准确、快速的猪附红细胞体检测方法,根据猪附红细胞体α-烯醇化酶基因保守序列设计特异性引物和探针,经过筛选优化反应条件,建立了重组酶介导的等温扩增(RAA)荧光检测方法。结果显示,建立的方法在39℃恒温条件下20 min内即可... 为建立一种准确、快速的猪附红细胞体检测方法,根据猪附红细胞体α-烯醇化酶基因保守序列设计特异性引物和探针,经过筛选优化反应条件,建立了重组酶介导的等温扩增(RAA)荧光检测方法。结果显示,建立的方法在39℃恒温条件下20 min内即可特异性地检出猪附红细胞体,与猪肺炎支原体、猪链球菌、猪大肠杆菌、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、非洲猪瘟病毒、健康猪血液无交叉反应,方法的最低检出限为1 copy/μL。用该方法对15份临床样本进行检测,结果阳性率为60%,与荧光定量PCR方法检测结果一致。本研究建立的猪附红细胞体荧光RAA检测方法具有较好的敏感性和特异性,操作简便可应用于猪附红细胞体病的临床快速检测。 展开更多

关键词 猪附红细胞体 重组酶介导等温扩增 α-烯醇化酶基因

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双重荧光RT-ERA技术快速检测贝类食品中诺如病毒 被引量：3

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作者 吴占文 王帅 +6 位作者 康婕 李涛 李红娜 蔡杰 张昊 杨艳歌 袁飞 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2023年第18期355-363,共9页

目的:基于逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription-enzymatic recombinase amplification,RTERA)技术,以MS2作为模式过程控制病毒,建立一种贝类食品中GI与GII型诺如病毒(norovirus,NoV)双重荧光RT-ERA快速检测方法。方法:分别... 目的:基于逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription-enzymatic recombinase amplification,RTERA)技术,以MS2作为模式过程控制病毒,建立一种贝类食品中GI与GII型诺如病毒(norovirus,NoV)双重荧光RT-ERA快速检测方法。方法:分别将GI、GII NoV参考靶序列克隆到带有T7启动子的载体中,通过体外转录的方式获得高纯度NoV RNA参考样品。以设计的MS2噬菌体引物探针,与实验室前期筛选的GI、GII NoV引物探针进行双重荧光RT-ERA实验,并对反应体系和反应程序进行优化,分析方法的灵敏度。最后,采用建立的方法开展真实样本检测,以GB 4789.42-2016《食品微生物学检验诺如病毒检验》为参比方法进行检测结果对比,确定方法的准确性和可行性。结果:建立MS2与GI、MS2与GII两组双重荧光RT-ERA检测方法,最佳引物及探针体积分别为4.1μL与1.8μL,检测时间可缩短至10 min左右,且最低可检出102拷贝/μL的NoV核酸样品。应用所建立的方法对29份真实样品进行检测,检测结果与GB 4789.42-2016一致。结论:本研究建立的双重荧光RT-ERA检测方法可实现对MS2、GI和GII NoV的同时检测,且灵敏度高、准确性强,为今后NoV现场快速检测提供一定基础。 展开更多

关键词 诺如病毒 逆转录-酶促重组等温扩增技术 双重荧光 快速检测 贝类

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