由食源性致病菌引发的食品安全问题是威胁人类健康的重要因素。因此,研究食源性致病菌的感染机理对于控制病原菌危害具有重要意义。【目的】以常见的食源性致病菌——鼠伤寒沙门氏菌为研究对象,以其发挥重要致病性的转录调控因子SlyA为...由食源性致病菌引发的食品安全问题是威胁人类健康的重要因素。因此,研究食源性致病菌的感染机理对于控制病原菌危害具有重要意义。【目的】以常见的食源性致病菌——鼠伤寒沙门氏菌为研究对象,以其发挥重要致病性的转录调控因子SlyA为靶标,比较胞嘧啶单碱基编辑技术(CRISPR/Cas9-guided-Cytidine Base Editor,CBE)和λ-Red同源重组技术在构建鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株方面的方法差异,为鼠伤寒沙门氏菌的基因编辑技术应用提供数据。同时,也为其他类型病原菌的基因编辑技术开发提供有力参考。【方法】采用PCR、GoldenGate、Sanger测序等方法完成CBE系统以及λ-Red系统的构建以及敲除结果的验证,采用Editor-R软件分析CBE系统的单碱基编辑效率,采用Western blotting在蛋白表达层面对敲除结果进行验证。此外,本研究还结合了表型鉴定的方法验证了基因敲除结果。【结果】经PCR产物测序鉴定、Western blotting分析及溶血素活性鉴定等结果表明,本研究成功将CBE系统应用于鼠伤寒沙门氏菌slyA的单碱基编辑中,应用前述两种方法构建了鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株。【结论】CBE系统虽然以其操作的简便性在基因编辑中优势明显,但同λ-Red系统相比,该方法需要设立特定的gRNA及PAM位点,在非模式菌株中的普适性较低,且在进行编辑时,CBE系统存在不稳定的问题。尽管如此,但CBE系统在鼠伤寒沙门氏菌中的成功建立,为进一步拓展与完善该菌的基因编辑系统提供了基础。展开更多
文摘研究者在上个月宣布的结果表明同源重组将成为基因疗法和培育转基因动物的关键技术,培育这种动物的某家公司已经从大学转获同源重组技术.明确地说,GenPharm Inter-national 公司正从犹他研究基金大学和斯坦福大学转获这项技术.在将外源 DNA 结合到染色体特定位置方面,同源重组(即基因定靶)比微注射更有效、更专一.
文摘由食源性致病菌引发的食品安全问题是威胁人类健康的重要因素。因此,研究食源性致病菌的感染机理对于控制病原菌危害具有重要意义。【目的】以常见的食源性致病菌——鼠伤寒沙门氏菌为研究对象,以其发挥重要致病性的转录调控因子SlyA为靶标,比较胞嘧啶单碱基编辑技术(CRISPR/Cas9-guided-Cytidine Base Editor,CBE)和λ-Red同源重组技术在构建鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株方面的方法差异,为鼠伤寒沙门氏菌的基因编辑技术应用提供数据。同时,也为其他类型病原菌的基因编辑技术开发提供有力参考。【方法】采用PCR、GoldenGate、Sanger测序等方法完成CBE系统以及λ-Red系统的构建以及敲除结果的验证,采用Editor-R软件分析CBE系统的单碱基编辑效率,采用Western blotting在蛋白表达层面对敲除结果进行验证。此外,本研究还结合了表型鉴定的方法验证了基因敲除结果。【结果】经PCR产物测序鉴定、Western blotting分析及溶血素活性鉴定等结果表明,本研究成功将CBE系统应用于鼠伤寒沙门氏菌slyA的单碱基编辑中,应用前述两种方法构建了鼠伤寒沙门氏菌SlyA敲除菌株。【结论】CBE系统虽然以其操作的简便性在基因编辑中优势明显,但同λ-Red系统相比,该方法需要设立特定的gRNA及PAM位点,在非模式菌株中的普适性较低,且在进行编辑时,CBE系统存在不稳定的问题。尽管如此,但CBE系统在鼠伤寒沙门氏菌中的成功建立,为进一步拓展与完善该菌的基因编辑系统提供了基础。
