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Ghrelin基因敲除对小鼠黑质区多巴胺能神经元突触后电位的影响
1
作者 刘静 李焕焕 +3 位作者 焦倩 陈曦 姜宏 杜希恂 《精准医学杂志》 2024年第3期199-202,208,共5页
目的探讨胃饥饿素(ghrelin)基因敲除对小鼠黑质多巴胺能神经元突触后电位的影响。方法分别选取10周龄雄性ghrelin基因敲除小鼠(ghrelin^(-/-)组)及其同窝雄性野生型(WT)小鼠(WT组)的黑质组织,采用转录组学测序(RNA-seq)技术筛选差异表... 目的探讨胃饥饿素(ghrelin)基因敲除对小鼠黑质多巴胺能神经元突触后电位的影响。方法分别选取10周龄雄性ghrelin基因敲除小鼠(ghrelin^(-/-)组)及其同窝雄性野生型(WT)小鼠(WT组)的黑质组织,采用转录组学测序(RNA-seq)技术筛选差异表达基因(DEGs),通过KEGG通路富集分析DEGs可能参与的神经元突触活动相关信号通路,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法对筛选出的DEGs进行验证,并应用蛋白免疫印迹(Western blotting)方法检测神经元突触活动相关基因的蛋白表达情况。结果与WT组相比,ghrelin^(-/-)组小鼠多巴胺能神经元突触传递信号通路上的23个基因水平发生了显著性变化,其中谷氨酸促离子型受体α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸型亚基3(GluA3)和糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)分别调控神经元突触后膜上的α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸受体和N-甲基-D-天冬氨酸受体;在ghrelin^(-/-)组小鼠黑质组织中,GluA 3和GSK-3β基因表达出现明显的下调。RT-qPCR方法检测结果显示,与WT组相比,ghrelin^(-/-)组小鼠黑质组织当中GluA 3和GSK-3βmRNA水平明显下调(t=2.408、2.740,P<0.05)。Western blotting方法检测结果显示,与WT组相比,ghrelin^(-/-)组小鼠黑质组织中GluA3蛋白的表达水平明显上调(t=2.530,P<0.05),GSK-3β蛋白的表达明显下调(t=3.469,P<0.05)。结论Ghrelin基因敲除可能通过使小鼠黑质多巴胺能神经元突触后电位长时程增强,从而增强兴奋性突触传递活动,参与运动调控。 展开更多
关键词 胃促生长素 基因敲除技术 黑质 多巴胺能神经元 长时程增强 受体 离子型谷氨酸
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利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系 被引量：1
2
作者 吕丹 陈宇 +4 位作者 谭志霞 李永青 吴秀山 江志钢 叶湘漓 《生命科学研究》 CAS 2024年第1期18-25,共8页
蛋白激酶D1 (protein kinase D1, PKD1;也称作PRKD1)是蛋白激酶家族成员之一,该家族由3种结构相关的应激激活酶组成,可调节机体多种生物学功能,主要涉及细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节、心脏收缩、血管生成和癌症等,其中PRKD1与心脏肥... 蛋白激酶D1 (protein kinase D1, PKD1;也称作PRKD1)是蛋白激酶家族成员之一,该家族由3种结构相关的应激激活酶组成,可调节机体多种生物学功能,主要涉及细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节、心脏收缩、血管生成和癌症等,其中PRKD1与心脏肥大、收缩和缺血再灌注损伤的底物磷酸化有关。相关研究报道,先天性心脏病患者存在PRKD1基因突变,但其在心脏中的特异性功能和分子机制并未阐明。为了便于后期研究PRKD1基因在人类早期心脏发育的作用机制,本文拟利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系。首先,通过生物信息学网站筛选出两个最佳的基因敲除靶位点,合成相应靶位点的单链向导RNA (single guide RNA,sg RNA)和引物;然后,将两个靶位点的sg RNA进行体外转录,并将其与Cas9蛋白混合后共同注射到斑马鱼的1-细胞期;最后,对基因敲除后的F0、F1、F2及F3代斑马鱼的胚胎和成鱼进行有效性鉴定及表型观察。结果显示,靶位点附近出现了不同程度的碱基缺失;成功构建了F1代能够稳定遗传的prkd1基因敲除的3个亚系;与野生型相比, F3代纯合子胚胎表现出不同程度的心腔膨大、环化异常及心管线性化等畸形现象。综上可知,本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了斑马鱼prkd1基因敲除品系,为进一步研究该基因在人类心脏发育中的特异性功能提供了有益参考,并为后期的先天性心脏病筛查和精准医疗提供了重要依据。 展开更多
关键词 prkd1基因 CRISPR/Cas9技术 基因敲除 先天性心脏病(CHD)
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肝细胞特异性Sirt3基因敲除小鼠模型的构建 被引量：1
3
作者 许雅萍 王语涵 +5 位作者 陈婷婷 李南 高萍萍 李玲 王华 孙妩弋 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第3期384-390,共7页
目的运用Cre-loxP技术构建肝细胞特异性沉默信息调节因子3(silence information regulator 3,Sirt3)基因敲除(Sirt3^(Δhep))小鼠,为研究肝细胞Sirt3基因在疾病中的生物学功能提供重要动物模型。方法将loxP标记的Sirt3 ^(flox/flox)小鼠... 目的运用Cre-loxP技术构建肝细胞特异性沉默信息调节因子3(silence information regulator 3,Sirt3)基因敲除(Sirt3^(Δhep))小鼠,为研究肝细胞Sirt3基因在疾病中的生物学功能提供重要动物模型。方法将loxP标记的Sirt3 ^(flox/flox)小鼠与Alb-Cre纯合子(Alb-Cre^(+/+))小鼠进行交配,F1代Sirt3^(flox/-)/Alb-Cre^(+/-)小鼠再与Sirt3^(flox/flox)小鼠进行交配并鉴定,F2代基因型为Sirt3 ^(flox/flox)/Alb-Cre^(+/-)的小鼠即为本实验所构建的Sirt3^(Δhep)小鼠,Sirt3 ^(flox/flox)/Alb-Cre^(-/-)小鼠即为对照小鼠Sirt3 ^(flox/flox)小鼠。提取鼠尾DNA,通过PCR鉴定子代小鼠的基因型;免疫荧光双染观察Sirt3在小鼠肝细胞中的表达;提取Sirt3^(Δhep)小鼠原代肝细胞及心脏、脾脏、肾脏、肺组织蛋白,Western blot法验证Sirt3在小鼠肝细胞及其他组织中的表达水平;HE染色观察小鼠肝脏及心脏、脾脏、肺等组织结构。结果成功鉴定出Sirt3^(Δhep)小鼠;免疫荧光及Western blot结果显示,小鼠肝细胞中Sirt3蛋白表达水平低于对照组小鼠(P<0.01),而Sirt3^(Δhep)小鼠的心脏、脾脏、肾脏和肺组织中Sirt3表达与对照组相比无明显变化(P>0.05);HE染色结果显示Sirt3^(Δhep)小鼠肝脏、心脏、脾脏、肺、肾脏的组织学特征与对照组小鼠相比无明显变化。结论成功构建肝细胞特异性Sirt3基因敲除小鼠,为进一步研究肝细胞Sirt3基因在相关疾病中的调控作用机制奠定了基础。 展开更多
关键词 肝细胞 Sirt3 基因敲除 Sirt3^(Δhep)小鼠 CRE-LOXP 基因型鉴定
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CXCR2基因敲除HeLa细胞株构建及转录组测序分析
4
作者 刁思雨 王家银 +3 位作者 高春海 王言言 訾臣 关向宏 《生殖医学杂志》 CAS 2024年第1期73-82,共10页
目的通过基因敲除和转录组测序探究CXCR2相关功能基因及信号通路,揭示其在宫颈癌中的分子作用。方法设计构建靶向CXCR2基因的CRISPR-Cas9敲除质粒载体,转染HeLa细胞并筛选获得CXCR2基因敲除的细胞株。转录组测序分析差异表达基因,并进... 目的通过基因敲除和转录组测序探究CXCR2相关功能基因及信号通路,揭示其在宫颈癌中的分子作用。方法设计构建靶向CXCR2基因的CRISPR-Cas9敲除质粒载体,转染HeLa细胞并筛选获得CXCR2基因敲除的细胞株。转录组测序分析差异表达基因,并进行基因本体(GO)分类富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析筛选信号通路和重要差异表达基因,差异表达基因经实时荧光定量PCR方法验证。结果成功构建了CXCR2基因敲除细胞株,转录组测序获得1519个差异表达基因,其中上调表达基因428个,下调表达基因1091个。GO富集分析显示了细胞组分、生物学过程、分子功能方面富集量前20的条目;KEGG信号通路富集分析显示,富集基因最多的为肿瘤相关通路,其次为PI3K-Akt信号通路和HPV感染信号通路。通过韦恩图分析获得了7个共同差异表达基因:EGF、FN1、ITGA2B、CCND3、PIK3CD、PDGFRB、CDKN1A,其中前6个基因表达显著下调,CDKN1A表达显著上调。结论转录组测序分析结果进一步提示CXCR2在宫颈癌中发挥作用,并初步确定了与其相关的信号通路和关键功能基因,为宫颈癌的分子机制和临床研究提供了理论基础。 展开更多
关键词 宫颈癌 CXCR2 基因敲除 转录组
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基于CRISPR/Cas9技术构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株及其表型研究
5
作者 李雪银 吴传新 +3 位作者 刘慧玲 李丽 程莎 孙航 《免疫学杂志》 CAS CSCD 2024年第1期87-95,共9页
目的 采用CRISPR/Cas9技术构建吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)基因敲除的THP-1细胞株,为研究IDO1在巨噬细胞中的作用提供细胞模型。方法 设计靶向IDO1基因的3条向导RNA(guide RNA,gRNA),分别构建IDO1-gRNA重组质粒,酶切及测序鉴定后,包装成... 目的 采用CRISPR/Cas9技术构建吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)基因敲除的THP-1细胞株,为研究IDO1在巨噬细胞中的作用提供细胞模型。方法 设计靶向IDO1基因的3条向导RNA(guide RNA,gRNA),分别构建IDO1-gRNA重组质粒,酶切及测序鉴定后,包装成Lenti-IDO1-gRNA慢病毒。利用Cas9慢病毒感染THP-1细胞获得稳定表达Cas9蛋白的细胞株,再经Lenti-IDO1-gRNA慢病毒感染敲除IDO1基因,有限稀释法获得单克隆细胞株。T7E1酶切检测gRNA打靶效率,PCR产物测序和Western blot鉴定IDO1基因敲除效果。CCK8法检测IDO1基因敲除对THP-1细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测对巨噬细胞标志物CD11b、CD68和CD14表达的影响,中性红法检测巨噬细胞吞噬功能。结果 成功构建了3种IDO1-gRNA重组质粒,3条gRNA均能有效编辑IDO1基因,以gRNA2编辑效率最高。经PCR产物测序和Western blot验证获得了3株THP-1 IDO1-KO单克隆细胞株,并发现IDO1基因敲除可抑制THP-1细胞增殖,下调THP-1巨噬细胞CD11b、CD68表达,上调CD14表达,增强THP-1巨噬细胞吞噬功能。结论 成功构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株;IDO1对THP-1细胞增殖活性、分化调节以及THP-1巨噬细胞吞噬功能调节有重要作用,为后续进一步探讨IDO1基因在巨噬细胞中的功能及机制研究奠定基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 吲哚胺-2 3-双加氧酶1 基因敲除 THP-1细胞 巨噬细胞
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TRPC1基因敲除小鼠心肌梗死组织纤维化指标表达变化
6
作者 陈天苗 王联发 +3 位作者 童全秀 侯勇 张现格 黄猛珣 《山东医药》 CAS 2024年第20期39-42,共4页
目的 观察瞬时受体电位通道C1(TRPC1)敲除的心肌梗死小鼠心肌纤维化指标变化。方法 野生型小鼠与TRPC1基因缺陷(TRPC1^(-/-))小鼠各20只,分为野生对照组、野生实验组、TRPC1^(-/-)对照组、TRPC1^(-/-)实验组,每组10只。野生实验组和TRPC... 目的 观察瞬时受体电位通道C1(TRPC1)敲除的心肌梗死小鼠心肌纤维化指标变化。方法 野生型小鼠与TRPC1基因缺陷(TRPC1^(-/-))小鼠各20只,分为野生对照组、野生实验组、TRPC1^(-/-)对照组、TRPC1^(-/-)实验组,每组10只。野生实验组和TRPC1^(-/-)实验组结扎冠状动脉左前降支并缝合,制作心肌梗死模型;野生对照组和TRPC1^(-/-)对照组只穿线,不结扎。24 h后处死小鼠,获取心脏,对照组小鼠取左心室正常组织,实验组取左心室前壁梗死组织,采用RT-PCR法检测TRPC1 mRNA,采用Western blotting法检测TRPC1蛋白及纤维化指标Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。结果 野生实验组TRPC1 mRNA表达高于TRPC1^(-/-)实验组,野生对照组TRPC1 mRNA表达高于TRPC1^(-/-)对照组(P均<0.05);野生实验组TRPC1蛋白表达高于野生对照组和TRPC1^(-/-)实验组,TRPC1^(-/-)实验组TRPC1蛋白表达高于TRPC1^(-/-)对照组(P均<0.05)。野生实验组Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表达高于野生对照组和TRPC1^(-/-)实验组,野生对照组Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表达高于TRPC1^(-/-)对照组,TRPC1^(-/-)实验组Col-Ⅰ、α-SMA表达高于TRPC1^(-/-)对照组(P均<0.05)。结论 敲低TRPC1基因表达可下调心肌梗死小鼠心肌纤维化指标的表达。 展开更多
关键词 瞬时受体电位通道C1 心肌纤维化 心肌梗死 基因敲除
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Mex3c基因敲除对小鼠胚胎神经管发育的影响及其机制
7
作者 路志国 吴晓婷 +3 位作者 王凯 张波 汪涌 杜勇 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期1029-1037,共9页
目的研究Mex3c基因敲除对小鼠胚胎神经管发育的影响及其可能的机制。方法利用NCBI数据库分析Mex3c基因在小鼠各个组织中的表达情况,荧光原位杂交技术(FISH)检测Mex3c在Mex3c+/+小鼠不同发育时期(E12.5 d、E14.5 d)神经管中的表达情况。... 目的研究Mex3c基因敲除对小鼠胚胎神经管发育的影响及其可能的机制。方法利用NCBI数据库分析Mex3c基因在小鼠各个组织中的表达情况,荧光原位杂交技术(FISH)检测Mex3c在Mex3c+/+小鼠不同发育时期(E12.5 d、E14.5 d)神经管中的表达情况。将性发育成熟的小鼠按照Mex3c+/-雄∶雌(1∶1)的比例进行合笼繁殖,取繁殖的胚胎,采用PCR鉴定小鼠基因型,按照基因型分为3组:野生型组(Mex3c+/+,WT组)、纯合子敲除组(Mex3c-/-,KO组)与杂合子敲除组(Mex3c+/-),采用HE染色观察3组胚胎神经管的发育情况;免疫荧光染色及Western blotting检测WT组、KO组的胚胎神经干细胞增殖及凋亡情况;透射电镜观察WT组、KO组神经管发育及线粒体的超微结构。提取WT组、KO组神经管的RNA,进行RNA-seq测序,利用R.3.6.3对差异表达基因进行KEGG信号通路富集分析,并采用RT-qPCR验证测序结果。结果NCBI数据库分析及FISH检测结果显示,Mex3c基因主要表达于胚胎的中枢神经系统。HE染色结果显示,在E12.5 d、E13.5 d,胚胎神经管的发育在KO组、WT组及杂合子敲除组无明显差异;而在E14.5 d,KO组较WT组的胚胎神经管发育迟缓,表型明显异常,据此选择E14.5 d的KO组及WT组胚胎神经管组织进行后续实验。免疫荧光染色结果显示,KO组PCNA阳性细胞率明显低于WT组(P<0.001)。Western blotting检测结果显示,KO组Bax/Bcl-2比值高于WT组(P<0.01)。透射电镜观察显示,与WT组比较,KO组突触间隙消失,胚胎神经管的线粒体水肿,线粒体嵴断裂,结构明显异常。RNA-seq测序分析结果显示,共获得377个差异基因,其中表达上调101个,表达下调276个。KEGG信号通路富集分析发现,差异基因的主要信号通路富集于神经活性配体受体相互作用信号通路。RT-qPCR验证结果显示该信号通路中的Avpr1a、Drd1、Htr7、Sstr1、Oxtr、Gabra5 mRNA表达水平下调(P<0.05或P<0.01),与RNA-seq结果一致。结论Mex3c在小鼠胚胎神经管发育过程中起着重要作用,可能通过神经活性配体受体相互作用信号通路,参与调控神经干细胞的增殖及凋亡过程,进而影响神经管的发育。 展开更多
关键词 基因 Mex3c 神经管 发育异常 基因敲除
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肝特异性Rbp4基因敲除小鼠的建立及糖代谢特征分析
8
作者 卢婉贤 马琦 +2 位作者 王黎 刘梦迪 郭宝平 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期493-502,共10页
目的 建立肝特异性Rbp4基因敲除小鼠模型,并初步探索肝特异性Rbp4基因缺失对糖代谢的影响。方法 利用Cre-LoxP技术,使用C57/BL6J小鼠和Alb-Cre小鼠构建肝特异性Rbp4基因敲除小鼠模型。利用PCR及琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型。选取10只1... 目的 建立肝特异性Rbp4基因敲除小鼠模型,并初步探索肝特异性Rbp4基因缺失对糖代谢的影响。方法 利用Cre-LoxP技术,使用C57/BL6J小鼠和Alb-Cre小鼠构建肝特异性Rbp4基因敲除小鼠模型。利用PCR及琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型。选取10只18周龄C57/BL6J雄性小鼠为野生对照组(WT),10只同周龄flox纯合且Alb-Cre阴性小鼠为实验对照组(Rbp4~(flox/flox):Cre~-),10只同周龄flox纯合且Alb-Cre阳性小鼠为实验组(Rbp4~(flox/flox):Cre~+)。分别利用Western Blot及qRT-PCR验证小鼠肝中RBP4蛋白及Rbp4 mRNA表达水平。利用qRT-PCR检测其他组织中Rbp4 mRNA表达水平。采用苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织形态。利用血糖仪检测小鼠尾静脉血液标本血糖值,进行葡萄糖耐量及胰岛素耐量实验。利用qRT-PCR检测肝糖代谢基因磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Pepck)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6pase)表达水平。结果 成功繁育并鉴定出肝特异性Rbp4基因敲除小鼠。Rbp4~(flox/flox):Cre~+组小鼠肝中RBP4蛋白表达显著减少(P<0.05),Rbp4 mRNA表达显著减少(P<0.05)。三组小鼠脂肪、肾、胰、脾、心脏和肌肉组织中Rbp4 mRNA的相对表达量差异无显著性(P>0.05)。HE染色、葡萄糖耐量及胰岛素耐量实验结果表明肝特异性Rbp4基因敲除对肝组织形态、葡萄糖耐量及胰岛素耐量无显著影响(P>0.05)。三组小鼠肝中Pepck mRNA表达差异具有显著性(P<0.05),两两比较显示,Rbp4~(flox/flox):Cre~+组小鼠肝中Pepck mRNA相对表达量较Rbp4~(flox/flox):Cre~-组小鼠降低(P<0.05)。三组小鼠肝中G6pase mRNA表达差异无显著性(P>0.05)。结论 成功构建了肝特异性Rbp4基因敲除小鼠模型,基因缺失可抑制小鼠肝Pepck mRNA表达,为进一步探索该基因在小鼠糖代谢中的作用提供依据。 展开更多
关键词 2型糖尿病 视黄醇结合蛋白4 基因敲除 糖代谢 胰岛素抵抗
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巨噬细胞特异性TDO2基因敲除小鼠的构建
9
作者 董伟波 陈悦兰 +3 位作者 王燚 程梦 魏伟 常艳 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第6期994-1000,共7页
目的构建巨噬细胞特异性色氨酸2,3-双加氧酶(TDO2)基因敲除小鼠,为研究TDO2调控巨噬细胞功能影响疾病发生发展提供动物模型。方法基于Cre-Loxp系统构建巨噬细胞特异性TDO2基因敲除(TDO2^(flox/flox)Lyz2-iCre^(+))小鼠。采用PCR和琼脂... 目的构建巨噬细胞特异性色氨酸2,3-双加氧酶(TDO2)基因敲除小鼠,为研究TDO2调控巨噬细胞功能影响疾病发生发展提供动物模型。方法基于Cre-Loxp系统构建巨噬细胞特异性TDO2基因敲除(TDO2^(flox/flox)Lyz2-iCre^(+))小鼠。采用PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型;采用Western blot和免疫荧光验证小鼠巨噬细胞中TDO2敲除效果;通过苏木精-伊红(HE)染色,观察主要组织器官是否存在自发病变。结果基因型鉴定结果表明,flox扩增产物长度在407 bp或408 bp处仅有一条条带且Cre扩增产物长度在543 bp处有一条条带的小鼠即为TDO2^(flox/flox)Lyz2-iCre^(+)小鼠。Western blot结果显示,与TDO2^(flox/flox)小鼠相比,TDO2^(flox/flox)Lyz2-iCre^(+)小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)中TDO2表达降低(P<0.01)。免疫荧光结果显示,与TDO2^(flox/flox)小鼠相比,TDO2^(flox/flox)Lyz2-iCre^(+)小鼠腹腔巨噬细胞和BMDMs中TDO2表达降低。HE染色结果显示,与TDO2^(flox/flox)小鼠相比,TDO2^(flox/flox)Lyz2-iCre^(+)小鼠肝脏、脑、肾脏和脾脏组织内细胞形态无明显差异。结论成功构建TDO2^(flox/flox)Lyz2-iCre^(+)小鼠,为后续深入研究TDO2调控巨噬细胞活化在疾病中的作用和机制提供更加精准的实验动物模型。 展开更多
关键词 TDO2 特异性基因敲除 巨噬细胞 基因型鉴定 CRE-LOXP
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FOXN1基因敲除兔嵌合体的建立
10
作者 刘天平 黎桂玲 +3 位作者 刘科 陈傍柱 王刚 顾为望 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2024年第4期35-40,共6页
目的建立F0代FOXN1基因敲除兔嵌合体,以探究普通饲养环境免疫缺陷兔活体保种的方法。方法首先,利用CRISPR/Cas9技术,将构建好的sgRNA和Cas9蛋白注入兔二细胞期胚胎的一个细胞中,以获得FOXN1基因编辑嵌合体胚胎。然后,胚胎移植至代孕母... 目的建立F0代FOXN1基因敲除兔嵌合体,以探究普通饲养环境免疫缺陷兔活体保种的方法。方法首先,利用CRISPR/Cas9技术,将构建好的sgRNA和Cas9蛋白注入兔二细胞期胚胎的一个细胞中,以获得FOXN1基因编辑嵌合体胚胎。然后,胚胎移植至代孕母兔。最后,通过PCR技术以及Sanger测序方法鉴定F0代仔兔基因型,并观察其在普通饲养环境生长发育的情况。结果PCR结合Sanger测序结果表明FOXN1基因敲除兔嵌合体构建成功。经观察,嵌合体在普通环境下生长发育良好,无免疫缺陷表型。结论本研究初步建立了在普通环境下可正常生长发育的FOXN1基因敲除兔嵌合体,为后续进一步繁育FOXN1免疫缺陷兔奠定了研究基础。 展开更多
关键词 FOXN1 基因敲除兔 免疫缺陷 嵌合体
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半乳糖凝集素-3基因敲除对MRSA感染小鼠皮肤模型中脓肿发展的影响
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作者 王淑君 张丁 +7 位作者 李一鸣 张思怡 周静 陈紫涵 程美琦 韩珊珊 王德成 晁金 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期992-1000,共9页
目的探讨半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal3)在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)感染小鼠皮肤模型中对皮肤脓肿发展以及肥大细胞(mast cell,MC)激活的影响。方法将6~8周龄的野生型小鼠和Gal3... 目的探讨半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal3)在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)感染小鼠皮肤模型中对皮肤脓肿发展以及肥大细胞(mast cell,MC)激活的影响。方法将6~8周龄的野生型小鼠和Gal3基因敲除(Gal3^(-/-))小鼠分为4组:野生型小鼠+PBS组、野生型小鼠+MRSA组、Gal3^(-/-)小鼠+PBS组、Gal3^(-/-)小鼠+MRSA组,分别皮下注射MRSA或PBS,每组5只。观察记录小鼠皮肤脓肿发展和病理学变化,比较皮肤组织中的载菌量,并分析相关炎性细胞因子、MC脱颗粒及活化标志物5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)的差异。结果感染MRSA后,野生型小鼠皮肤出现渐进性脓肿,而Gal3^(-/-)小鼠脓肿体积较小。与野生型小鼠+MRSA组相比,Gal3^(-/-)小鼠+MRSA组皮肤载菌量显著降低(P<0.01),且组织病理学观察显示较少的炎症细胞浸润。Gal3^(-/-)小鼠皮肤中的细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-33、TGF-β和IL-10均显著低于野生型小鼠(P<0.05)。甲苯胺蓝染色显示,野生型小鼠+MRSA组皮肤组织中大量MC释放颗粒物质,而Gal3^(-/-)小鼠+MRSA组仅发现少量脱颗粒的MC。免疫组化染色进一步发现,Gal3^(-/-)小鼠+MRSA组中5-HT的表达显著低于野生型小鼠+MRSA组。结论Gal3缺失降低MRSA感染导致的小鼠皮肤中MC的活化与脱颗粒,改变炎症反应,减轻了皮肤组织的脓肿发生。 展开更多
关键词 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 半乳糖凝集素-3 基因敲除 肥大细胞 活化
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AKR7A5基因敲除对雄性小鼠生殖的影响
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作者 刘庆玲 赵振军 +6 位作者 徐文秀 孔令英 刘笑含 许文达 董思琳 李岩 石慧 《烟台大学学报（自然科学与工程版）》 2024年第1期102-106,共5页
通过分析野生型和AKR7A5基因敲除型雄性小鼠的睾丸、附睾系数及其组织形态、精子活力和生育力,探讨AKR7A5基因对雄性生殖系统的影响。结果发现:AKR7A5基因敲除型与野生型小鼠睾丸、附睾系数及其组织形态无明显差异;AKR7A5基因敲除型小... 通过分析野生型和AKR7A5基因敲除型雄性小鼠的睾丸、附睾系数及其组织形态、精子活力和生育力,探讨AKR7A5基因对雄性生殖系统的影响。结果发现:AKR7A5基因敲除型与野生型小鼠睾丸、附睾系数及其组织形态无明显差异;AKR7A5基因敲除型小鼠与野生型小鼠相比,其精子浓度、直线前游总数、直线运动精子、前向运动精子、平均路径运动速度和平均曲线运动速度显著降低,不运动精子显著增加(P<0.01);总产仔数显著降低(P<0.01)。综上,AKR7A5基因敲除影响小鼠成熟精子的数量和活力,降低总产仔数。 展开更多
关键词 小鼠 AKR7A5 基因敲除 生殖能力
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基于CRISPR/Cas9技术构建SLC19A2基因敲除小鼠及其表型验证
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作者 钱晨 向利群 +4 位作者 覃媛媛 闫婕 赵安然 叶玉萍 林发全 《中国医药导报》 CAS 2024年第22期1-5,21,共6页
目的利用CRISPR/Cas9技术构建SLC19A2基因敲除的纯合子小鼠模型,并验证其表型。方法设计gRNA载体,将构建好的gRNA载体和Cas9载体进行体外转录后共注射到受精卵,经胚胎移植后获得6只(雌性3只、雄性3只)阳性F0代小鼠。通过繁育获得12只(雄... 目的利用CRISPR/Cas9技术构建SLC19A2基因敲除的纯合子小鼠模型,并验证其表型。方法设计gRNA载体,将构建好的gRNA载体和Cas9载体进行体外转录后共注射到受精卵,经胚胎移植后获得6只(雌性3只、雄性3只)阳性F0代小鼠。通过繁育获得12只(雄性6只、雌性6只)SLC19A2基因敲除纯合子小鼠[SLC19A2-/-小鼠(C57BL/6)]。8周龄野生型C57BL/6小鼠和SLC19A2-/-小鼠各12只(雄性6只、雌性6只),分别设为野生型组与基因敲除纯合子组。采用PCR扩增凝胶电泳法鉴定小鼠基因型;采用实时荧光定量PCR检测胰腺组织和肝脏组织中SLC19A2 mRNA表达,采用蛋白质印迹法检测胰腺组织和肝脏组织中THTR-1蛋白表达。结果PCR扩增凝胶电泳法成功鉴定出SLC19A2-/-小鼠。基因敲除纯合子组胰腺组织和肝脏组织中SLC19A2 mRNA及THTR-1蛋白表达水平低于野生型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论基于CRISPR/Cas9技术成功构建了SLC19A2基因敲除小鼠。 展开更多
关键词 SLC19A2 基因敲除 CRISPR/Cas9
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小白链霉菌中CRISPR-Cas9基因敲除系统的构建与优化
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作者 开朗 杨昊 +1 位作者 朱道君 陈旭升 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第14期10-17,共8页
小白链霉菌(Streptomyces albulus)是工业上生产ε-聚赖氨酸的主要菌株。为提高S.albulus的ε-聚赖氨酸合成能力,基于诱变和抗性筛选的传统育种方法被普遍应用。然而,由于传统育种存在“疲劳效应”,当前S.albulus的育种陷入了瓶颈。为... 小白链霉菌(Streptomyces albulus)是工业上生产ε-聚赖氨酸的主要菌株。为提高S.albulus的ε-聚赖氨酸合成能力,基于诱变和抗性筛选的传统育种方法被普遍应用。然而,由于传统育种存在“疲劳效应”,当前S.albulus的育种陷入了瓶颈。为利用代谢工程方法进一步提高S.albulus的ε-聚赖氨酸合成能力,亟需建立基于CRISPR-Cas9的基因编辑方法。为此,该文以S.albulus GS114为研究对象,以ε-聚赖氨酸合成酶基因pls为靶基因,构建了CRISPR-Cas9基因敲除系统,成功敲除了pls,编辑效率为100%。为进一步提高获得的敲除株数量,对S.albulus GS114结合转移条件进行了系统优化,获得的最优结合转移条件为:供受体比例1∶1,镁离子浓度30 mmol/L,55℃热激孢子10 min,培养20 h后覆盖抗生素。在最优转移条件下,结合转移效率达到2.5×10^(-8),较优化前提高了78%。该研究结果一方面为后续S.albulus的代谢工程改造提供了重要工具,另一方面为其他工业链霉菌构建CRISPR-Cas系统提供了重要参考。 展开更多
关键词 放线菌 小白链霉菌 CRISPR-Cas9系统 基因敲除
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黄河鲤肌间骨转录组分析及斑马鱼bmp1基因敲除模型构建
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作者 董传举 贾颖颖 +1 位作者 申亚伟 李学军 《河南师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第4期71-79,I0012,共10页
肌间骨(IBs)由肌膈间的肌腱骨化而来,仅存在于低等硬骨鱼类中,研究选取黄河鲤(Cyprinus carpio haematopterus)肌间骨发育前后两个关键阶段进行转录组测序,并对差异表达基因进行功能富集分析.结果表明:测序共获得高质量有效序列12035678... 肌间骨(IBs)由肌膈间的肌腱骨化而来,仅存在于低等硬骨鱼类中,研究选取黄河鲤(Cyprinus carpio haematopterus)肌间骨发育前后两个关键阶段进行转录组测序,并对差异表达基因进行功能富集分析.结果表明:测序共获得高质量有效序列120356780条,共筛选出差异表达基因3454个(上调1283个,下调2171个).GO和KEGG分析显示差异基因主要富集于胞外区域、跨膜运输、氧化还原过程、催化活性、蛋白结合等功能,参与次生代谢物的生物合成、PI3K-Akt信号通路、AMPK信号通路、糖酵解等.经qRT-PCR验证差异基因表达谱与RNA-seq结果基本一致后,为进一步了解其生物功能,选取两阶段中显著上调基因bmp 1,利用CRISPR/Cas9建立bmp 1突变的嵌合体斑马鱼(Danio rerio).测序验证bmp 1突变品系已成功构建,表型观察结果发现突变型明显发育迟缓且尾部出现脊椎畸形. 展开更多
关键词 肌间骨 黄河鲤 转录组 bmp 1 基因敲除
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基于CRISPR/Cas9技术建立Lepr与eNos双基因敲除的糖尿病肾病小鼠模型
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作者 赵苗妙 李明嘉 +3 位作者 李小亚 段蕊 张静宜 杨金奎 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第3期392-398,共7页
目的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术建立瘦素受体基因(leptin receptor,Lepr)与血管内皮一氧化氮合酶基因(endothelial nitric oxide synthase,eNos)双基因敲除(double-knockout,DKO)小鼠模型,构建晚期糖尿病肾病小鼠模型。方法根据eNos... 目的基于CRISPR/Cas9基因编辑技术建立瘦素受体基因(leptin receptor,Lepr)与血管内皮一氧化氮合酶基因(endothelial nitric oxide synthase,eNos)双基因敲除(double-knockout,DKO)小鼠模型,构建晚期糖尿病肾病小鼠模型。方法根据eNos基因制备对应的gRNA,将CRISPR-Cas9体系显微注射于C57BL/Ks(BKS)背景小鼠的受精卵内。将受精卵转移至有假孕状态雌性小鼠的输卵管内部。幼鼠出生后经聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定及测序分析分选出为eNos^(+/-)基因型的F0代阳性小鼠,获得BKS背景下的Lepr基因杂合小鼠,即基因型为Lepr^(db/m)的Lepr-F0代杂合子小鼠。将eNos-F0与Lepr-F0代小鼠杂交,获得eNos^(+/-)/Lepr^(db/m)双杂合F1代小鼠,将双杂合F1代小鼠进一步交配,筛选得到Lepr与eNos双基因敲除小鼠。采用PCR法鉴定小鼠基因型,按基因鉴定结果分为野生型(wild-type,WT)组与DKO组小鼠。监测各组小鼠体质量、血糖与饮水进食量;采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠尿白蛋白与尿肌酐水平,并计算尿白蛋白排泄率;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)与过碘酸六胺银(periodic acid-silver metheramine,PASM)染色检查各组小鼠肾组织病理改变。结果PCR检测结果显示,成功构建lepr^(db/db)/eNos^(-/-)DKO小鼠。与同窝对照组相比,DKO小鼠的体质量、血糖水平与饮水进食量均显著高于同窝对照小鼠。DKO小鼠的尿白蛋白与尿白蛋白排泄率显著高于WT小鼠。病理学结果显示,DKO小鼠的肾小球体积明显增大,系膜基质增生明显。结论基于CRISPR/Cas9基因编辑技术可成功构建lepr^(db/db)/eNos^(-/-)DKO小鼠,DKO小鼠可反映糖尿病肾病的典型表现,为深入研究糖尿病肾病的作用机制提供动物模型。 展开更多
关键词 基因敲除 CRISPR/Cas9技术 糖尿病肾病 ENOS Lepr
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超声应变技术评估PCSK9基因敲除对肥胖小鼠心肌功能的影响
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作者 王琴 井一淑 +3 位作者 马鑫 潘璐 燕茹 马学平 《中国医学影像学杂志》 CSCD 北大核心 2024年第9期873-877,907,共6页
目的应用超声应变技术评估PCSK9基因敲除对肥胖小鼠心肌功能的影响,并探讨其机制。材料与方法选取6周龄野生型C57BL/6雄性小鼠20只,随机分为正常组和肥胖组,各10只;选取6周龄PCSK9^(-/-)C57BL/6雄性小鼠10只为PCSK9^(-/-)组。肥胖组和PC... 目的应用超声应变技术评估PCSK9基因敲除对肥胖小鼠心肌功能的影响,并探讨其机制。材料与方法选取6周龄野生型C57BL/6雄性小鼠20只,随机分为正常组和肥胖组,各10只;选取6周龄PCSK9^(-/-)C57BL/6雄性小鼠10只为PCSK9^(-/-)组。肥胖组和PCSK9^(-/-)组给予高脂饲料造模,正常组给予普通饲料,12周后从肥胖组和PCSK9^(-/-)组中选取造模成功小鼠,3组小鼠行心脏超声、透射电镜及免疫荧光染色进行观察。结果肥胖组、正常组和PCSK9^(-/-)组小鼠室间隔舒张末期厚度分别为(0.98±0.13)mm、(0.77±0.07)mm、(0.78±0.13)mm,差异有统计学意义(F=5.10,P=0.02),肥胖组较正常组增厚(t=2.73,P<0.05),PCSK9^(-/-)组较肥胖组变薄(t=-2.92,P<0.05)。3组左心室整体纵向应变及整体圆周应变差异有统计学意义(F=7.44、15.40,P<0.05),其中肥胖组较正常组整体纵向应变和整体圆周应变减低(t=3.79、5.50,P<0.05),PCSK9^(-/-)组较肥胖组整体纵向应变和整体圆周应变升高(t=-2.53、-3.37,P<0.05)。电镜及免疫荧光结果显示,肥胖组心肌超微结构受损,NLRP3及Caspase-1表达较正常组增多(t=12.53、-4.73,P<0.05),PCSK9^(-/-)组心肌超微结构受损明显改善,NLRP3及Caspase-1表达较肥胖组减少(t=-6.23、2.05,P<0.05)。结论超声应变技术较常规心脏超声参数能更敏感地发现PCSK9基因敲除肥胖小鼠心肌功能的改变;PCSK9基因敲除后可能通过抑制NLRP3及Caspase-1表达改善肥胖小鼠心肌功能。 展开更多
关键词 肥胖症 超声检查 心脏 应变 显微镜检查 电子 透射 PCSK9基因 基因敲除技术 心肌功能 小鼠
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基于CRISPR/Cas9技术PCSK9基因敲除小鼠模型的构建及表型验证
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作者 托罗娜依·米吉提 陈小翠 +3 位作者 崔元峰 阿比旦·阿卜杜如苏力 陈邦党 马秀敏 《新疆医科大学学报》 CAS 2024年第2期186-191,共6页
目的基于CRISPR/Cas9技术构建前枯草杆菌蛋白原转换酶9(Preprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式,针对PCSK9基因靶序列设计单链... 目的基于CRISPR/Cas9技术构建前枯草杆菌蛋白原转换酶9(Preprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式,针对PCSK9基因靶序列设计单链向导RNA(sgRNA),将sgRNA和Cas9 mRNA显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵,获得F0代敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得PCSK9基因敲除(PCSK9 KO)纯合子小鼠。采用PCR方法对PCSK9 KO小鼠进行基因鉴定,Western Blot检测肝组织PCSK9及低密度脂蛋白受体(LDL-R)蛋白的表达,同时检测心、脑、肾、脂肪组织中的PCSK9蛋白表达水平,q-PCR检测PCSK9的mRNA表达水平。采用酶法检测血清中总胆固醇(TC)及甘油三酯(TG)水平。结果PCR产物凝胶电泳以及PCSK9蛋白及mRNA表达结果表明成功获得全身性PCSK9基因敲除小鼠,肝组织LDL-R(3.42±0.56)蛋白表达显著增高。与WT组相比,PCSK9小鼠血清TC(90.75±17.81 mg/dL vs 54.19±2.42 mg/dL)、TG(81.26±11.98 mg/dL vs 50.92±11.93 mg/dL)显著降低(P<0.001)。结论基于CRISPR/Cas9技术成功构建获得PCSK9基因敲除小鼠,敲除PCSK9基因通过上调肝脏LDL-R蛋白显著降低血脂水平。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 PCSK9 基因敲除 基因型鉴定 血脂水平
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Cre/loxP条件性基因敲除小鼠在椎间盘退变研究中的应用
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作者 黄龙鳌 陈棣 江华 《中国脊柱脊髓杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期990-997,共8页
椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是一个在生命早期就开始的过程,其与遗传、机械负荷、创伤和营养因素以及衰老密切相关,已证是腰痛的主要原因之一[1]。然而,IDD的分子生物学机制仍然不清楚。椎间盘的不同细胞类型表... 椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是一个在生命早期就开始的过程,其与遗传、机械负荷、创伤和营养因素以及衰老密切相关,已证是腰痛的主要原因之一[1]。然而,IDD的分子生物学机制仍然不清楚。椎间盘的不同细胞类型表达不同的基因,以调控椎间盘的发育和稳态。 展开更多
关键词 条件性基因敲除 椎间盘退变 生命早期 Cre/loxP 分子生物学机制 营养因素 机械负荷 IDD
原文传递
利用CRISPR/Cas9技术构建ACBD3基因敲除Hela细胞系
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作者 冯晓楠 贾天军 《动物医学进展》 北大核心 2024年第12期32-38,共7页
利用CRISPR/Cas9技术敲除Hela细胞的乙酰辅酶A结合结构域3(ACBD3),构建ACBD3基因敲除的Hela细胞系,便于后续研究ACBD3对肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)生长发育的影响及相关信号通路。根据CRISPR/Cas9设计原则,设计向导RNA(sgRNA),将... 利用CRISPR/Cas9技术敲除Hela细胞的乙酰辅酶A结合结构域3(ACBD3),构建ACBD3基因敲除的Hela细胞系,便于后续研究ACBD3对肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)生长发育的影响及相关信号通路。根据CRISPR/Cas9设计原则,设计向导RNA(sgRNA),将sgRNA与Cas9蛋白即RNP复合物通过电转染至Hela细胞,挑取单克隆细胞进行培养鉴定,利用Western blot和免疫荧光法检测ACBD3蛋白表达情况。测序显示成功构建敲除细胞株,Western blot和免疫荧光结果显示ACBD3蛋白不表达。利用CRISPR/Cas9技术成功构建ACBD3基因敲除的Hela细胞系,为进一步研究该基因对Cpn生长发育的作用及相关信号通路奠定了基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9技术 ACBD3基因 HELA细胞 基因敲除 肺炎衣原体
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