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DLL4蛋白真核表达及多克隆抗体制备
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作者 金巧 甘志凯 +1 位作者 周鹏 刘霞 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期175-180,共6页
该研究旨为克隆、表达和纯化出人源DLL4蛋白,并制备出相对应的多克隆抗体。采用搭桥PCR,构建带有t PA信号肽的DLL4基因,并克隆到p GZX表达载体上,经过酶切和测序鉴定后,瞬时转染到HEK293F细胞中,转染48 h后对发酵上清液进行镍柱亲和纯... 该研究旨为克隆、表达和纯化出人源DLL4蛋白,并制备出相对应的多克隆抗体。采用搭桥PCR,构建带有t PA信号肽的DLL4基因,并克隆到p GZX表达载体上,经过酶切和测序鉴定后,瞬时转染到HEK293F细胞中,转染48 h后对发酵上清液进行镍柱亲和纯化。利用Dot blotting、Western blotting和Fortebio大分子互作仪检测DLL4的生物活性;免疫兔子制备DLL4多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价,Western blotting检测抗体特异性。PCR扩增出1.6 kb的t PA-DLL4-6His目的片段,测序结果表明,与NCBI数据库中的DLL4序列(NM_019074.3)相同。一步亲和纯化后,得到纯度为95%的DLL4蛋白,Dot blotting和Western blotting检测到发酵上清液中含有DLL4蛋白,DLL4蛋白和DLL4抗体之间的亲和力在1.848E-10,R2=0.999,ELISA法获得DDL4抗体效价为1∶12 800,Western blotting检测DLL4抗体具有良好的特异性。成功制备出具有免疫原性的DLL4蛋白及其多克隆抗体。 展开更多
关键词 DLL4 真核表达 亲和纯化 多克隆抗体 大分子互作
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绵马酚抑制多粘菌素耐药关键蛋白MCR-1的机制研究 被引量:2
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作者 贾月 华欣 刘思国 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期427-433,共7页
mcr-1是近几年发现的一种多粘菌素耐药基因,该基因可随质粒在不同菌株间快速传播,目前已在多个国家及地区被检出,本研究团队前期筛选发现联合使用绵马酚与多粘菌素时可以抑制mcr-1阳性大肠杆菌的生长。为了评价两者联合使用时的抑菌效果... mcr-1是近几年发现的一种多粘菌素耐药基因,该基因可随质粒在不同菌株间快速传播,目前已在多个国家及地区被检出,本研究团队前期筛选发现联合使用绵马酚与多粘菌素时可以抑制mcr-1阳性大肠杆菌的生长。为了评价两者联合使用时的抑菌效果,本研究采用棋盘稀释法对mcr-1阳性大肠杆菌进行了绵马酚与多粘菌素联合药敏实验,结果显示,当联合使用绵马酚与多粘菌素时相比单独使用多粘菌素时,多粘菌素的MIC由8μg/m L降低至1μg/m L,FIC指数小于0.5,二者属于协同作用。以终浓度为32μg/m L绵马酚与10μg/m L多粘菌素联合使用,进一步通过平板计数和透射电镜检测其杀菌效果和大肠杆菌菌体的破损程度,结果显示,当联合使用绵马酚与多粘菌素时,大肠杆菌在2 h^8 h逐渐全部死亡,大肠杆菌菌体破损最严重;但不管是单独使用绵马酚还是多粘菌素,大肠杆菌均不能被彻底杀灭。采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法分别提取mcr-1阳性大肠杆菌JD08菌株和含有16μg/m L的绵马酚的mcr-1阳性大肠杆菌JD08菌株中类脂A,利用质谱仪检测类脂A的结构,结果显示在绵马酚存在的情况下,MCR-1蛋白的作用受到抑制,发生转移的酰基键含量大大减少。采用双酶切法构建PET-28a-mcr-1重组表达载体,经诱导表达后通过镍柱亲和层析纯化得到MCR-1蛋白,利用Biacore大分子作用仪验证绵马酚与重组MCR-1蛋白的相互作用,结果显示绵马酚与MCR-1蛋白之间的亲和力为1.47μmol/L,属于直接结合。表明单独使用绵马酚对mcr-1阳性大肠杆菌无效,但其与多粘菌素联合时则产生了良好的抑菌及杀菌效果,绵马酚是MCR-1的小分子抑制剂。本研究首次确认了绵马酚是MCR-1的小分子抑制剂,对于开发新型抗多粘菌素耐药菌的药物具有重要意义。 展开更多
关键词 大肠杆菌 多粘菌素耐药关键蛋白MCR-1 绵马酚 抑制剂 大分子互作
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多肽构象稳定方法学研究进展
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作者 叶喜阳 赵辉 李予刚 《世界中医药》 CAS 2016年第B06期1616-1618,1046,共3页
利用多肽干预生物分子互作有特定的优势,但是天然多肽具有穿透性差,稳定性差的特点。将多肽稳定在活性构象是一种提高多肽成药性的有效方法。本文总结了近年稳定多肽构象的策略,包括各种策略的特点和应用范围。最后本文尝试性的提出... 利用多肽干预生物分子互作有特定的优势,但是天然多肽具有穿透性差,稳定性差的特点。将多肽稳定在活性构象是一种提高多肽成药性的有效方法。本文总结了近年稳定多肽构象的策略,包括各种策略的特点和应用范围。最后本文尝试性的提出了稳定多肽方法学领域的发展方向。本文可以为稳定多肽新方法的开发提供依据。 展开更多
关键词 多肽药物 方法学 多肽构象 生物大分子互作
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Understanding enzyme catalysis by means of supramolecular artificial enzymes 被引量:2
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作者 DONG ZeYuan ZHU JunYan +1 位作者 LUO Quan LIU JunQiu 《Science China Chemistry》 SCIE EI CAS 2013年第8期1067-1074,共8页
Enzymes are biomacromolecules responsible for the abundant chemical biotransformations that sustain life. Recently, biochemists have discovered that multiple conformations and numerous parallel paths are involved duri... Enzymes are biomacromolecules responsible for the abundant chemical biotransformations that sustain life. Recently, biochemists have discovered that multiple conformations and numerous parallel paths are involved during the processes catalyzed by enzymes. It is plausible that the entire macromolecular scaffold is involved in catalysis via cooperative motions that result in incredible catalytic efficiency. Moreover, some enzymes can very strongly bind the transition state with an association constant of up to 1024 M-1, suggesting that covalent bond formation is a possible process during the conversion of the transition state in enzyme catalysis, in addition to the concatenation of noncovalent interactions. Supramolecular chemistry provides fundamental knowledge about the relationships between the dynamic structures and functions of organized molecules. By tak-ing advantage of supramolecular concepts, numerous supramolecular enzyme mimics with complex and hierarchical structures have been designed and investigated. Through the study of supramolecular enzyme models, a great deal of information to aid our understanding of the mechanism of catalysis by natural enzymes has been acquired. With the development of supramolec-ular artificial enzymes, it is possible to replicate the features of natural enzymes with regards to their constitutional complexity and cooperative motions, and eventually decipher the conformation-based catalytic mystery of natural enzymes. 展开更多
关键词 artificial enzymes cooperative motions catalytic mechanism substrate recognition supramolecular chemistry
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