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2019-nCoV N蛋白在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及纯化
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作者 海毕瑞 杨扬 +2 位作者 刘世火 吴峻 徐家萍 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期333-339,共7页
核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白是新型冠状病毒的结构蛋白,与病毒RNA的转录和复制有关。目前,N蛋白已被广泛应用于新型冠状病毒肺炎的检测诊断及治疗。本研究克隆的2019-nCoV-n基因CDS由1257个碱基构成,编码419个氨基酸。将该基因连接到昆... 核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白是新型冠状病毒的结构蛋白,与病毒RNA的转录和复制有关。目前,N蛋白已被广泛应用于新型冠状病毒肺炎的检测诊断及治疗。本研究克隆的2019-nCoV-n基因CDS由1257个碱基构成,编码419个氨基酸。将该基因连接到昆虫表达载体pFastBacTMHTB构建重组Bacmid,转染至BmN细胞中获得重组病毒,将重组病毒注射家蚕蛹体内,收集发病家蚕蛹血淋巴,通过镍柱亲和纯化,SDS-PAGE和Western blot检测表明获得一定纯度具有活性的重组2019-nCoV-N蛋白,为后期进一步开发抗体检测试剂盒鉴定了基础。 展开更多
关键词 杆状病毒表达系统 家蚕 2019-nCoV 核衣壳蛋白 蛋白质纯化
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O型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达 被引量:4
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作者 张韵 易咏竹 +2 位作者 李志勇 张志芳 柳纪省 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期148-153,共6页
口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并... 口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示O型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。 展开更多
关键词 O型口蹄疫病毒 基因工程疫苗 P1-2A3C基因 家蚕杆状病毒表达系统
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A组轮状病毒结构蛋白VP6在家蚕杆状病毒表达系统中的表达 被引量:2
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作者 李司 钟云平 +3 位作者 张海花 应慧慧 于威 张耀洲 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期1024-1028,共5页
A组轮状病毒(rotavirus,RV)是婴幼儿严重病毒性腹泻的主要病原,VP6为轮状病毒的主要结构蛋白之一,天然VP6具有很强的抗原性和免疫原性。通过基因重组技术将A组轮状病毒T114中国地方株VP6基因克隆入转移载体质粒pBacPAK8中,并将重组质粒p... A组轮状病毒(rotavirus,RV)是婴幼儿严重病毒性腹泻的主要病原,VP6为轮状病毒的主要结构蛋白之一,天然VP6具有很强的抗原性和免疫原性。通过基因重组技术将A组轮状病毒T114中国地方株VP6基因克隆入转移载体质粒pBacPAK8中,并将重组质粒pBacPAK8-VP6与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6DNA共转染BmN细胞,获得重组病毒BmNPV-VP6。用BmNPV-VP6感染BmN细胞和家蚕5龄幼虫,Western blotting检测表明在BmN细胞和家蚕5龄幼虫的血淋巴中均可检测到120 kD的特异性条带,提示重组VP6蛋白在家蚕中获得表达,与VP6三体形式的大小相符合。ELISA检测结果显示,重组VP6蛋白在BmN细胞和家蚕5龄幼虫血淋巴中的表达分别在感染后第4天和第6天达到最高水平。VP6在家蚕杆状病毒表达系统中的成功表达可为新型轮状病毒疫苗的研制提供新的途径。 展开更多
关键词 A组轮状病毒 VP6蛋白 家蚕杆状病毒表达系统
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家蚕杆状病毒表达系统及其在口蹄疫疫苗研究中的应用 被引量:1
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作者 关洪鑫 李志勇 +1 位作者 白银梅 柳纪省 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期776-778,共3页
口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是由FMD病毒(FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性人兽共患传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的动物传染病,我国将其列为一类动物传染病。该病传播途径多,传播... 口蹄疫(Foot and mouth disease, FMD)是由FMD病毒(FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性人兽共患传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的动物传染病,我国将其列为一类动物传染病。该病传播途径多,传播速度快。目前除了北美、澳洲等地区外,世界范围内多次暴发流行。最近几年,一些已经消灭FMD的国家又再次爆发,FMD防制形势依然严峻。在FMD防制中,加强流行病学监测和采取疫苗免疫是防制其发生的主要措施和关键环节。因此,特异性诊断抗原的制备和新型疫苗的开发就显得尤为重要。 展开更多
关键词 口蹄疫疫苗 家蚕杆状病毒表达系统 FMD病毒 世界动物卫生组织 人兽共患传染病 动物传染病 应用 流行病学监测
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应用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕培养细胞和幼虫体内表达β-淀粉样蛋白 被引量:1
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作者 李司 张海花 +1 位作者 陆玲鸿 张文平 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期850-855,共6页
作为阿尔茨海默症(AD)重要神经病理学特征之一的脑内老年斑主要由β-淀粉样蛋白Aβ40和Aβ42聚集而成,Aβ42是其中的毒性成分。Aβ的特异性主动免疫对不同的转基因AD模型小鼠均有治疗作用,但临床试验中以注射方式给药容易诱发炎症反应... 作为阿尔茨海默症(AD)重要神经病理学特征之一的脑内老年斑主要由β-淀粉样蛋白Aβ40和Aβ42聚集而成,Aβ42是其中的毒性成分。Aβ的特异性主动免疫对不同的转基因AD模型小鼠均有治疗作用,但临床试验中以注射方式给药容易诱发炎症反应。为了能够更好、更安全地采用主动的Aβ免疫疗法达到预防和治疗AD的目的,尝试用家蚕杆状病毒表达系统表达Aβ42蛋白。将Aβ42基因克隆入转移载体质粒pB acP AK8中,并使该重组质粒和家蚕杆状病毒Bm-BacP AK6线性化的DNA共转染家蚕卵巢培养细胞BmN,经筛选、纯化获得的重组病毒命名为BmN PV-Aβ42。用BmN PV-Aβ42感染BmN细胞和家蚕5龄起蚕后,利用Western blotting在BmN细胞和5龄幼虫血淋巴中均可检测到5 kD左右的特异性条带,证明重组Aβ42蛋白表达成功。ELISA检测显示,重组Aβ42肽在感染后第4天的BmN细胞和感染后第6天的5龄幼虫血淋巴中的表达量分别达到1.1 pg/个、2μg/mL。进一步提高Aβ42在家蚕杆状病毒表达系统中的表达效率,有望为研发预防和治疗阿尔茨海默症的可食性疫苗提供新型原料。 展开更多
关键词 阿尔茨海默症 Β-淀粉样蛋白 免疫 家蚕杆状病毒表达系统 培养细胞 幼虫血淋巴
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鸡κ干扰素在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及其抗病毒活性检测 被引量:1
6
作者 杨鑫 宋浩志 +2 位作者 刘兴健 李轶女 张志芳 《生物技术进展》 2020年第3期251-255,共5页
干扰素(interferon,IFN)是宿主先天免疫系统的重要组成部分,它是抵抗病原体的第一道防御。为了利用家蚕杆状病毒表达系统表达鸡κ干扰素,根据已报道的序列对鸡κ干扰素的基因序列进行家蚕密码子优化,并利用共转染技术成功构建了表达用... 干扰素(interferon,IFN)是宿主先天免疫系统的重要组成部分,它是抵抗病原体的第一道防御。为了利用家蚕杆状病毒表达系统表达鸡κ干扰素,根据已报道的序列对鸡κ干扰素的基因序列进行家蚕密码子优化,并利用共转染技术成功构建了表达用重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染家蚕,成功获得了大量鸡κ干扰素的表达产物,并通过Western blot技术对产物进行了检测鉴定。用细胞病变抑制法对干扰素κ抑制VSV-GFP感染鸡成纤维细胞(CEF)的效果进行检测,结果显示鸡干扰素κ的抗病毒效价可以达到(1.04±0.23)×107 IU·mL-1以上。高效价鸡κ干扰素的成功表达为其在抗家禽疫病等方面提供了重要的试验数据。 展开更多
关键词 鸡κ干扰素 家蚕杆状病毒表达系统 病毒活性检测
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低分子量尿激酶与Annexin V的融合基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达
7
作者 王丽鸳 金勇丰 +1 位作者 朱成钢 张耀洲 《蚕业科学》 CAS CSCD 2003年第3期246-250,共5页
将低分子量尿激酶与膜联蛋白 (AnnexinV)的融合基因重组到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK UKAV ,并与线性化的病毒Bm PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK UKAV。将重组病毒BacPAK UKAV感染家蚕培养细... 将低分子量尿激酶与膜联蛋白 (AnnexinV)的融合基因重组到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK UKAV ,并与线性化的病毒Bm PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK UKAV。将重组病毒BacPAK UKAV感染家蚕培养细胞 (MOI=10 )和 5龄幼虫 (10 5pfu/头 ) ,Western印迹方法表明表达产物大小约为 6 9kD。用纤维蛋白平板溶圈法测定表达产物的纤溶活性 ,其融合蛋白具有明显的纤溶活性 ,约为 5× 10 -5U/个细胞。用APTT法测定表达产物的抗凝活性 ,比野生病毒Bm PAK6感染表达产物的APTT时间延长了 1倍以上 ,表现出明显的抗凝活性。体外实验表明 ,家蚕培养细胞和幼虫表达的重组低分子量尿激酶与AnnexinV融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。研究结果为今后进一步探索具有溶栓抗栓功能的血栓药物提供了新的方向。 展开更多
关键词 低分子量尿激酶 ANNEXINV 膜联蛋白V 融合基因 家蚕杆状病毒表达系统 基因表达 溶栓药物
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RNA干扰技术和家蚕杆状病毒表达系统在纤维素酶研究中的应用前景
8
作者 李兴华 杨华军 +4 位作者 B.Roy E.Y.Park 江丽军 王丹 缪云根 《蚕桑通报》 2009年第2期5-10,共6页
植物通过光合作用产生的纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。纤维素酶是糖苷水解酶的一种,能有效地将农作物秸杆等富含纤维素的物质水解为葡萄糖,进而发酵产生生物乙醇,从而解决农业、再生能源以及环境污染等问题。随着生物化... 植物通过光合作用产生的纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。纤维素酶是糖苷水解酶的一种,能有效地将农作物秸杆等富含纤维素的物质水解为葡萄糖,进而发酵产生生物乙醇,从而解决农业、再生能源以及环境污染等问题。随着生物化学、分子生物学以及基因工程等多种交叉学科的快速发展,获得适合工业化的高活力的纤维素酶指日可待。RNA干扰是利用双链RNA特异性地降解相应序列的mRNA,从而特异性地阻断相应基因的表达,是后基因组时代的一种强有力的调控目的基因表达的实验工具。家蚕杆状病毒表达系统是一种快速、高效表达外源基因的技术手段,目前该系统的发展和应用已经非常成熟。本文综述了纤维素酶的特性以及近年来国内外对纤维素酶、RNA干扰和家蚕杆状病毒表达系统的研究进展,并对该两种实验技术手段在今后纤维素酶研究中的应用前景作了预测和展望。 展开更多
关键词 纤维素酶 RNA干扰 家蚕杆状病毒表达系统
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犬α干扰素在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及其抗病毒活性的测定 被引量:2
9
作者 李皓洋 胡小元 +3 位作者 易咏竹 杨鑫 张志芳 李轶女 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期216-220,共5页
犬α干扰素(Ca IFNα)在犬病防治过程中应用广泛。旨在开发一种高效的Ca IFNα表达方法。首先按家蚕密码子的偏好性对Gen Bank中的一个Ca IFNα基因进行了优化与合成,将其克隆到杆状病毒转移载体p VL1393中,并与亲本病毒Bm Bacmid共转... 犬α干扰素(Ca IFNα)在犬病防治过程中应用广泛。旨在开发一种高效的Ca IFNα表达方法。首先按家蚕密码子的偏好性对Gen Bank中的一个Ca IFNα基因进行了优化与合成,将其克隆到杆状病毒转移载体p VL1393中,并与亲本病毒Bm Bacmid共转染家蚕细胞进行细胞内重组。得到的重组病毒用于感染家蚕幼虫,收集发病幼虫的蚕血淋巴用于Ca IFNα检测。采用细胞病变抑制法在MDCK-VSV*GFP系统中测定其抗病毒活性。结果显示家蚕表达的Ca IFNα能有效抑制VSV*GFP在细胞内的复制,其抗病毒活性不低于1.78×106U/m L。 展开更多
关键词 犬α干扰素 家蚕杆状病毒表达系统 病毒活性检测
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间日疟疾传播阻断疫苗候选抗原Pvs25在家蚕杆状病毒表达系统中的表达 被引量:1
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作者 盛稳稳 郭庆拓 +5 位作者 陈剑清 崔立旺 张耀洲 于威 舒特俊 盛清 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期672-680,共9页
间日疟疾传播阻断疫苗候选抗原Pvs25是间日疟原虫有性生殖期表达的表面蛋白,可以抑制疟原虫在媒介按蚊体内的有性生殖及孢子增殖,有效地阻断疟疾病原从按蚊向人体的传播。为了探索该疫苗高效、低成本生产的新途径,进行了Pvs25在家蚕杆... 间日疟疾传播阻断疫苗候选抗原Pvs25是间日疟原虫有性生殖期表达的表面蛋白,可以抑制疟原虫在媒介按蚊体内的有性生殖及孢子增殖,有效地阻断疟疾病原从按蚊向人体的传播。为了探索该疫苗高效、低成本生产的新途径,进行了Pvs25在家蚕杆状病毒表达系统中表面展示表达的初步试验。首先将经过非功能区去除和密码子优化的间日疟原虫Pvs25基因克隆至转移载体pFastBacHTb,构建重组质粒pET32a-Pvs25并转化E.coli Rosetta菌株,诱导后成功表达了Pvs25蛋白,利用Ni-NTA亲和层析的方法纯化重组Pvs25蛋白,免疫BALB/c雌鼠制备多克隆抗体,利用Protein A抗体纯化柱纯化后的抗体经间接ELISA法测定其效价为1∶12 800;利用Bac-to-Bac系统构建含Pvs25基因的重组杆状病毒vBmPvs25,接种BmN细胞和家蚕5龄幼虫,经SDS-PAGE与Western blotting分析表明Pvs25在BmN细胞和幼虫中均成功表达;构建vBmgp64-CMV-Pvs25表面展示重组病毒,检测到Pvs25在BmN细胞中表达并展示于细胞和杆状病毒囊膜上。研究结果为利用家蚕杆状病毒表达系统生产间日疟疾传播阻断候选疫苗奠定了一定的试验基础。 展开更多
关键词 间日疟原虫 Pvs25蛋白 传播阻断疫苗 家蚕杆状病毒表达系统 表面展示 多克隆抗体
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半胱氨酸蛋白酶基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达 被引量:1
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作者 林旭瑷 李卫国 +3 位作者 陈寅 易咏竹 张志芳 何家禄 《蚕业科学》 CAS CSCD 2003年第3期241-245,共5页
为了探讨杆状病毒的致病机理、改善杆状病毒表达系统的表达效率 ,将来源于家蚕核型多角体病毒ZJ8株的半胱氨酸蛋白酶 (cystenineprotease,CP)基因克隆到转移载体pVL 1393上 ,获得重组转移载体pVL cp ,与线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转... 为了探讨杆状病毒的致病机理、改善杆状病毒表达系统的表达效率 ,将来源于家蚕核型多角体病毒ZJ8株的半胱氨酸蛋白酶 (cystenineprotease,CP)基因克隆到转移载体pVL 1393上 ,获得重组转移载体pVL cp ,与线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转染家蚕Bm 5贴壁细胞。通过蓝白斑筛选、纯化后得到的重组病毒经PCR鉴定证明 ,cp基因已被正确导入 ,注射感染家蚕 5龄幼虫 12 0h后表达产物活性达到最高。对表达产物进行SDS PAGE及酶活力分析 ,检测到半胱氨酸蛋白酶在家蚕生物反应器中的表达 ,其表达量约为 16 0 0U/mL。 展开更多
关键词 半胱氨酸蛋白酶 家蚕杆状病毒表达系统 基因表达 致病机理 生物反应器 生物杀虫剂
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牛λ3干扰素在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及其抗病毒活性检测 被引量:3
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作者 赵璐璐 赵泽 +4 位作者 杨鑫 刘兴健 胡小元 张志芳 李轶女 《生物技术进展》 2018年第5期420-425,466,共7页
牛λ3干扰素(BoIFN-λ3)是一种新型干扰素,可应用于牛传染性疾病的防治。在家蚕杆状病毒表达系统中可实现BoIFN-λ3的高效表达。首先在优化合成的BoIFNλ3基因起始密码子上游引入Kozak序列,将其克隆至转移载体pVL1393,获得pVL1393-BoIFN... 牛λ3干扰素(BoIFN-λ3)是一种新型干扰素,可应用于牛传染性疾病的防治。在家蚕杆状病毒表达系统中可实现BoIFN-λ3的高效表达。首先在优化合成的BoIFNλ3基因起始密码子上游引入Kozak序列,将其克隆至转移载体pVL1393,获得pVL1393-BoIFN-λ3重组质粒。利用本实验室构建的家蚕杆状病毒表达系统,获得整合BoIFN-λ3基因的重组家蚕杆状病毒,将重组病毒感染五龄起蚕,在蚕血淋巴中得到表达产物BoIFN-λ3。采用微量细胞病变抑制法在MDBK/VSV*GFP系统检测蚕体中表达BoIFN-λ3的效价可达(2.7±0.12)×10~5U/m L,利用空斑筛选法筛选重组病毒,测得最高表达量的重组病毒表达的BoIFN-λ3的效价可达(8.1±0.52)×10~5U/m L,表达量提高3倍。家蚕杆状病毒表达系统为优质高效的牛λ3干扰素产品的生产提供了一种新方法。 展开更多
关键词 牛λ3干扰素 家蚕杆状病毒表达系统 病毒活性检测
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猫ω型干扰素在家蚕杆状病毒表达系统的表达及活性检测 被引量:1
13
作者 陈晓妍 李皓洋 +4 位作者 胡小元 吕言娜 李轶女 张志芳 易咏竹 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期682-687,共6页
将优化合成的猫ω型干扰素基因Fe IFN-ω2和Fe IFN-ω9克隆到杆状病毒转移载体p VL1393的多角体蛋白基因启动子下游,与orf1629基因缺损的家蚕杆状病毒Bm-Bacmid DNA共转染Bm N细胞进行同源重组,将获得的重组病毒感染家蚕5龄幼虫,利用家... 将优化合成的猫ω型干扰素基因Fe IFN-ω2和Fe IFN-ω9克隆到杆状病毒转移载体p VL1393的多角体蛋白基因启动子下游,与orf1629基因缺损的家蚕杆状病毒Bm-Bacmid DNA共转染Bm N细胞进行同源重组,将获得的重组病毒感染家蚕5龄幼虫,利用家蚕生物反应器表达猫ω型干扰素。采用微量细胞病变抑制法在CRFK细胞/VSV*GFP系统上检测家蚕幼虫血淋巴中表达的重组猫ω型干扰素具有抗病毒活性,其中表达产物重组Fe IFN-ω2的抗病毒活性可达6.3×105U/m L,而重组Fe IFN-ω9的抗病毒活性较低。研究结果为利用家蚕生物反应器生产重组猫ω型干扰素生物制剂奠定了一定的试验基础。 展开更多
关键词 猫ω型干扰素 家蚕杆状病毒表达系统 病毒活性
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羊λ3干扰素在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及其抗病毒活性检测 被引量:2
14
作者 王先翔 赵泽 +6 位作者 王朋 刘兴健 胡小元 张志芳 李轶女 房岭丽 叶爱华 《生物技术进展》 2019年第5期502-508,共7页
λ干扰素作为一种多效性细胞因子属于Ⅲ型干扰素,研究表明其能够对Ⅰ型和Ⅱ型干扰素逃逸的病毒起作用。为了利用家蚕杆状病毒表达系统高效表达出具有高抗病毒活性的羊λ3干扰素(OvIFN-λ3),首先将OvIFN-λ3基因优化后合成,将其克隆至转... λ干扰素作为一种多效性细胞因子属于Ⅲ型干扰素,研究表明其能够对Ⅰ型和Ⅱ型干扰素逃逸的病毒起作用。为了利用家蚕杆状病毒表达系统高效表达出具有高抗病毒活性的羊λ3干扰素(OvIFN-λ3),首先将OvIFN-λ3基因优化后合成,将其克隆至转移载体pVL1393中,得到重组质粒pVL1393-OvIFNλ3,再将重组质粒与失活拯救型家蚕杆状病毒穿梭载体reBmBac DNA共转染家蚕卵巢传代细胞Bm-N,得到含OvIFN-λ3基因的重组杆状病毒。随后利用重组杆状病毒感染五龄起蚕,待其发病后收集蚕血淋巴。采用微量细胞病变抑制法在羊肾细胞上进行重组表达绿色荧光蛋白的水疱型口炎病毒(recombinant vesicular stomatitis virus expressing green fluorescent protein,VSV-GFP)的攻毒实验,测定OvIFN-λ3抗病毒活性可达(6.5±0.27)×10^5 U/mL;利用空斑筛选法筛选重组病毒,感染家蚕后,测定其效价最高可达(3.1±0.42)×10^6 U/mL,表达量明显提高。家蚕杆状病毒表达系统为羊λ3干扰素产品的大量生产应用提供了新方法。 展开更多
关键词 羊λ3干扰素 家蚕杆状病毒表达系统 病毒活性检测
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轮状病毒结构蛋白VP4在家蚕杆状病毒表达系统中的表达 被引量:1
15
作者 靳洋洋 陈贝妮 李司 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期225-230,共6页
轮状病毒(rotavirus,RV)是引起全球婴幼儿及幼畜非细菌性胃肠炎的主要病原体之一,VP4蛋白是轮状病毒的主要中和抗原。利用载体RD-BmBacmid与重组载体pBacPAK8-VP4共转染家蚕细胞BmN获得重组家蚕杆状病毒BmNPV-VP4,并用该病毒感染BmN细... 轮状病毒(rotavirus,RV)是引起全球婴幼儿及幼畜非细菌性胃肠炎的主要病原体之一,VP4蛋白是轮状病毒的主要中和抗原。利用载体RD-BmBacmid与重组载体pBacPAK8-VP4共转染家蚕细胞BmN获得重组家蚕杆状病毒BmNPV-VP4,并用该病毒感染BmN细胞及家蚕5龄幼虫,从而在BmN细胞及家蚕中表达TB-Chen株轮状病毒的VP4蛋白。Western blotting检测到BmN细胞及家蚕幼虫血淋巴中均出现88 kD的特异性条带,证明VP4蛋白在BmN细胞和家蚕中获得了表达。ELISA检测结果显示,VP4蛋白在BmN细胞和家蚕幼虫血淋巴中的表达分别在感染后4 d和6 d达到最高水平,每个细胞和每mL血淋巴中的表达量分别为4.28 pg和1.61μg。研究结果为轮状病毒口服疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 轮状病毒 VP4蛋白 RD-BmBacmid载体 家蚕杆状病毒表达系统
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家蚕杆状病毒表达系统优化表达人表皮生长因子(hEGF)的研究 被引量:1
16
作者 曾小群 李跃东 吴小锋 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期317-323,共7页
人表皮生长因子(hEGF)因具有促进表皮细胞增殖活性而被广泛用于烧伤、烫伤等医学领域。根据杆状病毒基因密码子偏好性优化hEGF序列,通过串联表达、融合表达以及构建携带双启动子和增强序列的载体等系列优化技术,提高重组hEGF在家蚕细胞... 人表皮生长因子(hEGF)因具有促进表皮细胞增殖活性而被广泛用于烧伤、烫伤等医学领域。根据杆状病毒基因密码子偏好性优化hEGF序列,通过串联表达、融合表达以及构建携带双启动子和增强序列的载体等系列优化技术,提高重组hEGF在家蚕细胞中的表达水平。结果表明,通过上述一系列的优化方式可显著提高hEGF基因在BmN细胞中的转录水平,其中优化后hEGF的转录水平提高了24倍;Western blot分析表明,串联3个hEGF基因序列的蛋白质表达量最高。 展开更多
关键词 家蚕杆状病毒表达系统 人表皮生长因子 优化表达 串联表达 双启动子
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人血清对氧磷酶1在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及活性检测
17
作者 谭淑敏 李杰 +4 位作者 王小飞 舒特俊 陈剑清 张耀洲 于威 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期482-487,共6页
对氧磷酶1(paraoxonase 1,PON1)是生物体内存在的一种广谱的非专一性酯酶,在水解有机磷杀虫剂及降解神经毒剂中发挥重要作用。利用已构建的含人血清pon1基因的原核表达载体pET-28a-pon1,在E.coli中诱导表达人血清PON1,通过Ni-NTA亲和层... 对氧磷酶1(paraoxonase 1,PON1)是生物体内存在的一种广谱的非专一性酯酶,在水解有机磷杀虫剂及降解神经毒剂中发挥重要作用。利用已构建的含人血清pon1基因的原核表达载体pET-28a-pon1,在E.coli中诱导表达人血清PON1,通过Ni-NTA亲和层析纯化后制备兔多克隆抗体;利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒vBm-pon1,并感染家蚕5龄幼虫,经SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定人血清PON1在蚕体内成功表达,并获得了纯度较高的重组人血清PON1。以对氧磷为底物,对2个表达系统获得的重组人血清PON1的酶活性进行检测,结果表明在家蚕幼虫体内表达并纯化的重组人血清PON1的酶活性要明显高于在E.coli中表达的人血清PON1蛋白。推测家蚕杆状病毒表达系统比原核表达系统多了糖基化、磷酸化等蛋白质修饰功能。进一步试验验证家蚕幼虫表达的重组人血清PON1去糖基化后其酶活性丧失,表明糖基修饰对于维持PON1的生物学功能至关重要。 展开更多
关键词 家蚕杆状病毒表达系统 人血清对氧磷酶1 酶活性 糖基化
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人白细胞介素-4基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达
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作者 陈蔚青 史锋 +1 位作者 朱成钢 申屠超 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期512-516,共5页
采用RT-PCR法从经LPS诱导刺激的人外周血淋巴细胞中克隆了人白细胞介素-4(human interleukin-4,hIL-4)基因。为高效表达hIL-4,促进其临床应用,将hIL-4插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,构建重组载体pBacPAK-hIL-4,并与线性化... 采用RT-PCR法从经LPS诱导刺激的人外周血淋巴细胞中克隆了人白细胞介素-4(human interleukin-4,hIL-4)基因。为高效表达hIL-4,促进其临床应用,将hIL-4插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,构建重组载体pBacPAK-hIL-4,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒BacPAK-hIL-4。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫和蚕蛹(1×10^5PFU/头),表达产物以ELISA、SDS-PAGE和Western blotting方法检测。用活化的人外周血T淋巴细胞测定表达产物体外生物活性。ELISA法结果表明hIL-4在感染病毒后96h的蚕血淋巴和120h的蚕蛹中表达量最高,分别达到2.3μg/mL蚕血淋巴和10.2μg/mL体液;SDS-PAGE、Western blotting分析表明表达产物分子量约20kD;表达产物对活化的T淋巴细胞增殖具有明显促进作用。 展开更多
关键词 人白细胞介素-4基因 克隆 表达 家蚕杆状病毒表达载体系统
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铜离子对家蚕杆状病毒表达系统外源基因表达量的影响 被引量:3
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作者 林水中 张志芳 +1 位作者 魏兆军 何家禄 《中国蚕业》 2000年第3期24-25,共2页
关键词 铜离子 家蚕杆状病毒 表达
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猪瘟病毒cF114株E_2基因在家蚕杆状病毒表达系统中的融合表达
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作者 郑小坚 贡成良 +4 位作者 曹广力 朱江 薛仁宇 缪竞诚 沈卫德 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期340-344,共5页
为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST... 为进一步利用家蚕杆状病毒表达系统研制猪瘟病毒(CSFV)新型的亚单位疫苗,将猪瘟病毒cF114株囊膜糖蛋白E2基因克隆至带有GST标签的分泌表达杆状病毒转移载体pAcSecG2T的EcoRⅠ和BamHⅡ位点之间,获得了带有杆状病毒囊膜蛋白gp67信号肽-GST-E2元件的重组杆状病毒转移载体pAcSecG2T-E2,与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,筛选重组病毒(Bm-BacPAK6-E2),PCR证实所分离的重组病毒含有目的片段E2基因。SDS-PAGE图谱显示,感染重组病毒后,在细胞培养液上清和家蚕幼虫、蛹的血淋巴中均可检测到一条分子量为63 kD左右的特异性条带;感染Bm-BacPAK6-E2家蚕蛹的血淋巴可检测到GST活性,接种病毒148 h后重组蛋白的表达水平达到17.11μg/mL。 展开更多
关键词 猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因 杆状病毒 家蚕 融合表达
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