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小檗碱桥酶高效原核表达及生物合成l-SLR的研究
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作者 梅欢 李玥 +1 位作者 刘可蒙 刘吉华 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期277-287,共11页
左旋金黄紫堇碱(l-Scoulerine,l-SLR)是苄基异喹啉类生物碱(benzylisoquinoline alkaloids,BIAs)的关键中间体,由小檗碱桥酶(berberine bridge enzyme,BBE)催化左旋网状番荔枝碱(l-Reticuline,l-RL)合成。基于前期首次实现加州罂粟小檗... 左旋金黄紫堇碱(l-Scoulerine,l-SLR)是苄基异喹啉类生物碱(benzylisoquinoline alkaloids,BIAs)的关键中间体,由小檗碱桥酶(berberine bridge enzyme,BBE)催化左旋网状番荔枝碱(l-Reticuline,l-RL)合成。基于前期首次实现加州罂粟小檗碱桥酶(Eschscholzia californcia berberine bridge enzyme,EcBBE,EcBO)的原核表达,通过更换原核表达载体及共表达分子伴侣,构建高效表达EcBO的大肠杆菌工程菌株,实现l-RL向l-SLR的高效转化。结果表明,EcBO与分子伴侣pGro7共表达的工程菌株A的酶活力达到194.14 U/L,较原始酶活力提高了9.22倍。进一步对菌株A生物合成l-SLR的培养条件进行优化,在TB培养基中,当异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度为0.04 mmol/L,L-阿拉伯糖浓度为4 mg/mL,16℃下诱导18 h,0.2 mg/mL l-RL,37℃转化18 h,l-SLR产量为144.19 mg/L,较初始菌株提高4.72倍。综上,通过在原核系统中共表达分子伴侣pGro7与EcBO实现了EcBO高活性表达,显著提高了l-SLR的生物合成效率,为高效生物合成l-SLR及其他BIAs类生物碱提供了新的策略。 展开更多
关键词 小檗碱桥酶 左旋金黄紫堇碱 生物转化 分子伴侣 原核表达
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唐松草小檗碱桥酶的序列分析与结构建模研究
2
作者 刘祖碧 朱乾坤 +4 位作者 李娟娟 宋涛 周嘉裕 王万军 廖海 《生物技术》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期42-46,共5页
目的:分析唐松草小檗碱桥酶(TfBBE)序列特征、结构和活性位点。方法:从NCBI蛋白质数据库获取TfBBE蛋白序列,通过生物信息学软件进行序列分析;通过分子建模和对接研究TfBBE的结构和活性位点。结果:TfBBE序列全长535个氨基酸;是偏酸性、... 目的:分析唐松草小檗碱桥酶(TfBBE)序列特征、结构和活性位点。方法:从NCBI蛋白质数据库获取TfBBE蛋白序列,通过生物信息学软件进行序列分析;通过分子建模和对接研究TfBBE的结构和活性位点。结果:TfBBE序列全长535个氨基酸;是偏酸性、亲水性的稳定蛋白;N末端含有18个氨基酸的信号肽;有两个功能域,分别为FAD结合域和番荔枝碱结合域。三维结构包括27个α螺旋、19个β折叠,其余为无规则卷曲。TfBBE通过FAD结合域的14个氨基酸、番荔枝碱结合域的8个氨基酸分别与FAD、番荔枝碱直接作用,从而催化番荔枝碱环化形成金黄紫堇碱。结论:获得了TfBBE的序列特征、结构和活性位点,对研究酶的催化活性以及基因改造增加小檗碱产量具有重要意义。 展开更多
关键词 小檗碱桥酶 唐松草 生物信息学 分子建模
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拟南芥基因组中注释为小檗碱桥环酶基因的分子克隆及异源表达 被引量：1
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作者 张翔 马磊 +2 位作者 田永强 张国林 罗应刚 《世界科技研究与发展》 CSCD 2012年第5期807-811,共5页
小檗碱桥环酶(BBE)催化(S)-牛心果碱((S)-reticuline)中N-CH_3与分子内苄基部分中羟基的邻位芳香碳之间C-C键的形成,该酶属于双共价黄素蛋白家族,是苄基异喹啉类生物碱向小檗碱类生物碱转化的关键酶。迄今,在拟南芥(Arabidopsis thalia... 小檗碱桥环酶(BBE)催化(S)-牛心果碱((S)-reticuline)中N-CH_3与分子内苄基部分中羟基的邻位芳香碳之间C-C键的形成,该酶属于双共价黄素蛋白家族,是苄基异喹啉类生物碱向小檗碱类生物碱转化的关键酶。迄今,在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中尚未发现复杂生物碱,但其基因组测序结果表明拟南芥含有众多可能与复杂生物碱生物合成相关的基因,其中与BBE类似的基因有12个。基于与已知功能的BBE及拟南芥中BBE序列的分析,选定拟南芥中4个注释为BBE的编码基因为目的基因,设计特异引物,从拟南芥cDNA中扩增并克隆到pGM-T载体中,筛选重组子,测序并分析,获得了4个BBE目的基因,分别为AT2G34810、AT5G44400、AT5G44410和AT5G44440。将上述基因克隆至表达载体pET-28a或pET-30a中,分别转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,IPTG诱导实现了上述基因的异源表达。 展开更多
关键词 拟南芥 小檗碱桥环酶 生物信息学分析 RT—PCR TA克隆 异源表达
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