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ω-转氨酶的筛选和异源表达用于制备S-甲氧基异丙胺
1
作者 张涛 周海胜 +1 位作者 徐佳琪 杨立荣 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期8-15,56,共9页
根据转氨酶家族进化分类和底物特异性,构建一个包含36个ω-转氨酶的酶库;将酶库中的基因克隆进大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中进行异源重组表达,考察酶蛋白表达水平并测定相应的酶活以及对映体选择性。通过筛选,获得最佳的ω-转氨酶为来... 根据转氨酶家族进化分类和底物特异性,构建一个包含36个ω-转氨酶的酶库;将酶库中的基因克隆进大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中进行异源重组表达,考察酶蛋白表达水平并测定相应的酶活以及对映体选择性。通过筛选,获得最佳的ω-转氨酶为来源于巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的ω-转氨酶BmeTA,其重组表达粗酶活为2.0 U/mL,纯酶比活为9.5 U/mg蛋白;酶学性质表征发现其最适温度为35℃,最适pH为8.0。在此基础上进一步优化其催化反应工艺条件,在20 g/L加酶量、0.5 mmol/L辅酶添加量以及1.4的氨基供体/氨基受体比例条件下,反应18 h获得450 mmol/L的S-甲氧基异丙胺,原料转化率达到90%,为实现生物催化制备S-甲氧基异丙胺的工业化奠定基础。 展开更多
关键词 S-甲氧基异丙胺 ω-转氨酶 异源表达 氨基转移 生物催化
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高产莫能菌素肉桂地链霉菌的透明颤菌vgb基因异源表达 被引量：1
2
作者 李欣颖 张善飞 +2 位作者 刘旻炜 黄子瑄 孙付保 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1-9,共9页
肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)发酵产生的聚醚类抗生素莫能菌素(Monensin)因其环保且高效的特性而被广泛应用在医药、农业等领域,但莫能菌素实际生产中普遍的低氧条件严格限制了肉桂地链霉菌发酵莫能菌素水平。该文在前期... 肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)发酵产生的聚醚类抗生素莫能菌素(Monensin)因其环保且高效的特性而被广泛应用在医药、农业等领域,但莫能菌素实际生产中普遍的低氧条件严格限制了肉桂地链霉菌发酵莫能菌素水平。该文在前期整合表达莫能菌素生物合成基因簇中途径特异性正向调控基因(monH、monRⅡ)基础上,尝试通过异源整合表达透明颤菌血红蛋白基因vgb,以期通过改善菌株摄取溶氧能力来提高莫能菌素产量。结果显示,在40 mmol/L Ca^(2+)、供受体菌比例100∶1和培养18 h覆盖抗生素条件下,接合转移效率提高3倍;成功将基因vgb与莫能菌素生物合成途径特异性调控基因monH/monRⅡ进行串联整合,得到工程菌2110-monH-vgb和2110-monH-monRⅡ-vgb,其摇瓶生物量在高限氧条件下稍有提高(6%),但发酵效价分别较异源表达前提高18.0%和21.3%;后者在5 L罐水平生物量较异源表达前略有提高,发酵效价高达11.5 kU/mL,较出发菌提高47.3%。通过优化遗传操作系统并用于肉桂地链霉菌发酵产莫能菌素基因工程改造,成功获得有效提高莫能菌素发酵效价的vgb异源串联整合表达菌,为其后续的工业应用奠定基础。 展开更多
关键词 肉桂地链霉菌 莫能菌素 接合转移 异源表达 透明颤菌血红蛋白基因vgb
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不同来源胰蛋白酶的基因挖掘、在Komagataella phaffii GS115的异源表达及其酶学性质分析
3
作者 何林曼 钮成拓 +4 位作者 刘国正 郑飞云 刘春凤 王金晶 李崎 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期100-105,共6页
胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,广泛应用于皮革、食品加工、生化检测和制药行业。该文旨在挖掘不同来源的胰蛋白酶,并在Komagataella phaffii GS115进行异源表达,最终分析并比较其酶学性质。通过基因挖掘手段分别克隆了人源胰蛋白酶(homo ... 胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶,广泛应用于皮革、食品加工、生化检测和制药行业。该文旨在挖掘不同来源的胰蛋白酶,并在Komagataella phaffii GS115进行异源表达,最终分析并比较其酶学性质。通过基因挖掘手段分别克隆了人源胰蛋白酶(homo spanies trypsin,HST)、牛源胰蛋白酶(bos taurus trypsin,BTT)、虾源胰蛋白酶(penaeus vannamei trypsin,PVT)和弗氏链霉菌源胰蛋白酶(Streptomyces fradiae trypsin,SFT),以pPIC9k为载体构建重组质粒,并在Komagataella phaffii GS115中成功实现异源表达。经纯化激活后,HST,BTT,PVT,SFT的酰胺酶活性分别为18.6、12.3、44.7、13.8 U/mL;4种来源胰蛋白酶的最适温度分别为20、35、40、45℃,而其最适pH值分别为9、8.5、8.5、9,其中SFT在pH 9~11的稳定性更优。 展开更多
关键词 胰蛋白酶 基因挖掘 异源表达 毕赤酵母 酶学性质
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低温β-1,4-内切葡聚糖酶的基因挖掘、异源表达及其酶学性质表征
4
作者 圣弟青 钮成拓 +4 位作者 闫亚楠 郑飞云 刘春凤 王金晶 李崎 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期17-24,共8页
β-1,4-内切葡聚糖酶在洗涤行业有着广泛的应用价值,其中具有较好的低温和碱性耐受能力是其实现工业应用的重要前提。该论文通过基因挖掘获得一株具有低温耐受能力的Deinococcus cellulosilyticus来源新型β-1,4-内切葡聚糖酶基因EgDC,... β-1,4-内切葡聚糖酶在洗涤行业有着广泛的应用价值,其中具有较好的低温和碱性耐受能力是其实现工业应用的重要前提。该论文通过基因挖掘获得一株具有低温耐受能力的Deinococcus cellulosilyticus来源新型β-1,4-内切葡聚糖酶基因EgDC,并将其在大肠杆菌中实现了可溶性表达,其中大部分存在于周质空间,少部分分泌至胞外。对EgDC酶的酶学性质进行了表征,发现该酶的最适温度和最适pH值分别为40℃和pH 6.5,其在20℃能保持70%以上活力,且在pH 8.0和pH 9.0的半衰期分别达到83.43 min和53.79 min。EgDC酶具有较好的催化性质,其比酶活力k_(cat)/K_(m)值分别为(26.38±1.43)U/mg和(520.03±17.07)s^(-1)/mg,且对于金属离子以及表面活性剂均具有较强耐受能力。由此可见,新型β-1,4-内切葡聚糖酶EgDC具有较好的催化能力,且在低温、碱性以及存在表面活性剂环境下较为稳定,因此具有潜在的工业应用价值。 展开更多
关键词 基因挖掘 β-1 4-内切葡聚糖酶 异源表达 酶学性质 低温 耐碱性
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长双歧杆菌蔗糖磷酸化酶的异源表达及其酶学性质
5
作者 项蓉 杨金山 +6 位作者 娄婷婷 吴子健 张宏宇 赵彦巧 王丹芸 张得光 马兴 《食品研究与开发》 CAS 2024年第5期196-204,共9页
为挖掘来源于长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶(Bifidobacterium longum sucrose phosphorylase,BloSPase)合成2⁃O⁃α⁃D⁃吡喃葡糖基⁃L⁃抗坏血酸(2⁃O⁃α⁃D⁃glucopyranosyl⁃L⁃ascorbic acid,AA⁃2G)的潜力,该研究将BloSPase基因在大肠杆菌中异源表... 为挖掘来源于长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶(Bifidobacterium longum sucrose phosphorylase,BloSPase)合成2⁃O⁃α⁃D⁃吡喃葡糖基⁃L⁃抗坏血酸(2⁃O⁃α⁃D⁃glucopyranosyl⁃L⁃ascorbic acid,AA⁃2G)的潜力,该研究将BloSPase基因在大肠杆菌中异源表达,以BloSPase的水解酶活力为指标,通过单因素试验和响应面法对其表达条件进行优化;并通过镍柱纯化后对其转糖基化活力进行研究。结果表明,BloSPase的最佳表达条件为诱导时间10 h、异丙基⁃β⁃D⁃硫代半乳糖苷(isopropylthio⁃β⁃D⁃galactoside,IPTG)浓度0.47 mmol/L、诱导温度23℃。在该条件下,水解酶活力可达到(730.35±0.58)U/mL,比酶活达到(95.22±2.45)U/mg。酶学性质研究显示,BloSPase转糖基化活力的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5.2,在40、50℃时表现出较强的热稳定性。其动力学参数Km值为(266.80±23.76)mmol/L,Vmax值为(0.2350±0.0099)mmol/(L·min)。 展开更多
关键词 蔗糖磷酸化酶 大肠杆菌 异源表达 转糖基化活力 酶学性质
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麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶D246A异源表达及性质表征
6
作者 高雨晴 董钢印 +3 位作者 张洪瑞 马占山 方丽 詹冬玲 《吉林大学学报（理学版）》 CAS 北大核心 2024年第3期742-749,共8页
以大型真菌灵芝中的麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶(MGAM)为研究对象,采用同源序列比对、同源模建、底物对接和定点突变等方法成功构建酶活力显著降低的突变体D246A.酶学性质表征结果表明:最适反应温度由野生型(wild type,WT)的65℃减少至60℃,... 以大型真菌灵芝中的麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶(MGAM)为研究对象,采用同源序列比对、同源模建、底物对接和定点突变等方法成功构建酶活力显著降低的突变体D246A.酶学性质表征结果表明:最适反应温度由野生型(wild type,WT)的65℃减少至60℃,突变体耐热能力下降;最适pH值由WT的6.0升高至7.0,有利于工程菌生长;半衰期由WT的2.0 h下降至1.5 h,酶稳定性降低.酶动力学结果表明:突变体D246A酶动力学曲线符合Michaelis方程,与WT相比,K_(m)值变大,表明酶与底物亲和力下降;V_(max)约降低至原来的1/4. 展开更多
关键词 定点突变 异源表达 性质表征 麦芽糖酶-葡萄糖淀粉酶
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异源表达甜菜BvHSP18.2基因增强拟南芥对镉胁迫的耐受性研究
7
作者 仲维婷 张琼 +1 位作者 兴旺 刘大丽 《中国农学通报》 2024年第29期14-20,共7页
为进一步分析和验证甜菜BvHSP18.2基因(LOC104903994)受镉胁迫调控的功能,本研究用RTPCR技术克隆了甜菜BvHSP18.2基因,并通过植物表达载体构建以及拟南芥的遗传转化,测得异源表达目的基因的拟南芥植株在不同浓度镉胁迫下的表型及生理变... 为进一步分析和验证甜菜BvHSP18.2基因(LOC104903994)受镉胁迫调控的功能,本研究用RTPCR技术克隆了甜菜BvHSP18.2基因,并通过植物表达载体构建以及拟南芥的遗传转化,测得异源表达目的基因的拟南芥植株在不同浓度镉胁迫下的表型及生理变化数据。研究结果表明,随着镉胁迫浓度的增加,异源表达BvHSP18.2基因的拟南芥无论在根长还是鲜重方面均具有优势:50μmol/L镉胁迫下平均根长相差最大,为1.1 cm,600μmol/L镉胁迫下平均鲜重相差最大,为0.015 g。同时,BvHSP18.2基因的过表达可有效提高拟南芥体内SOD和POD活性,300μmol/L镉胁迫下SOD活性最高,为657.7266953 U/g;600μmol/L镉胁迫下POD活性最高,为野生型拟南芥的1.91倍。BvHSP18.2基因的过表达增强了拟南芥在镉胁迫下的耐受性,推测该基因在植物对镉胁迫的适应机制中具有重要的作用。 展开更多
关键词 甜菜 拟南芥 BvHSP18.2基因 异源表达 镉胁迫 功能分析 基因克隆 SOD活性 POD活性 耐受性 遗传转化
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海洋黄杆菌来源岩藻多糖酶Fcn1的异源表达及酶学性质
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作者 王立平 武俊义 +3 位作者 王莹 秦敏 陈芊汝 陈铁军 《食品科学技术学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第4期135-144,共10页
为了寻找和挖掘降解岩藻多糖的新型酶,以从海带中筛选获得的一株可以降解岩藻多糖的海洋黄杆菌Flavobacterium sp.RC2-3为研究对象,对其进行了全基因组测序。通过与已报道的岩藻多糖酶氨基酸序列比对,并进行转录组学分析及实时荧光定量... 为了寻找和挖掘降解岩藻多糖的新型酶,以从海带中筛选获得的一株可以降解岩藻多糖的海洋黄杆菌Flavobacterium sp.RC2-3为研究对象,对其进行了全基因组测序。通过与已报道的岩藻多糖酶氨基酸序列比对,并进行转录组学分析及实时荧光定量PCR验证,挖掘了1个可能的岩藻多糖酶基因,并将其命名为Fcn1。Fcn1基因全长1221 bp,编码406个氨基酸,蛋白分子质量约为46.8 kDa。通过引物设计、PCR扩增,将Fcn1基因克隆,进一步构建了Fcn1基因异源表达载体Fcn1-pET-28a(+),并将其成功地在大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主中进行了诱导表达。所得重组酶Fcn1通过带有His标签的镍柱进行分离纯化,采用铁氰化钾法测定纯化酶酶解岩藻多糖的比酶活(332 U/mg),纯化倍数为2.25。酶学性质研究表明,重组酶Fcn1最适反应温度为50℃,最适反应pH值为8.0,在20~30℃和pH值为7.0~8.0时表现出较好的稳定性。结合酶学性质研究结果,确定酶的最适反应条件为30℃,pH值为8.0,并测定了岩藻多糖酶水解反应的动力学参数,K m为1.17 mg/mL,V_(max)为10.53 g·L^(-1)·min^(-1)。该酶降解岩藻多糖的酶活力较高,在岩藻多糖资源的开发领域具有较大应用潜力。 展开更多
关键词 海洋黄杆菌 岩藻多糖酶 基因克隆 异源表达 蛋白纯化 酶学性质
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基于麦芽糖诱导型启动子在枯草芽胞杆菌中异源表达麦芽四糖淀粉酶及其酶学性质的研究
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作者 丛贵龙 李明玉 +4 位作者 姜梦彤 国丹 刘羽欣 王从纲 李宪臻 《微生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期23-31,共9页
麦芽四糖淀粉酶(Maltotetraose amylase,Mta)可以从淀粉的非还原末端特异性依次切割第4个α-1,4糖苷键形成麦芽四糖,目前在食品、医疗保健和造纸等领域具有重要应用。构建安全、高效的表达系统强化麦芽四糖淀粉酶的重组表达,进而降低以... 麦芽四糖淀粉酶(Maltotetraose amylase,Mta)可以从淀粉的非还原末端特异性依次切割第4个α-1,4糖苷键形成麦芽四糖,目前在食品、医疗保健和造纸等领域具有重要应用。构建安全、高效的表达系统强化麦芽四糖淀粉酶的重组表达,进而降低以其为核心酶的麦芽四糖生物转化过程的生产成本具有迫切的现实需求。本研究将源自Pseudomonas saccharophila(DSM 654)的麦芽四糖淀粉酶基因mta在枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis中重组表达,利用麦芽糖诱导型启动子实现其安全高效表达,之后对重组酶进行分离纯化和酶学性质表征。结果显示,将携带麦芽糖诱导型启动子Pglv的表达载体转入B.subtilis WB800N中,成功构建工程菌后进行诱导表达,并且利用金属离子螯合层析技术成功获得了Mta纯酶。酶学性质研究结果显示其最适反应温度为55℃,最适反应pH为7.5。动力学常数Km为(1.26±0.17)g/L、kcat/Km为(2275.07±32.83)L/s·g,纯酶在4℃储存14 d后保留40%的酶活力。本研究成功构建出安全、高效表达重组麦芽四糖淀粉酶的表达系统,为其规模化制备和应用提供了新策略。 展开更多
关键词 麦芽四糖 麦芽四糖淀粉酶 枯草芽胞杆菌 异源表达 启动子 酶学性质
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嗜热脂肪地芽孢杆菌木聚糖酶XynA的异源表达、酶学表征及低聚木糖的抗氧化性研究
10
作者 舒玉凤 严鹤松 +5 位作者 魏凯峯 薛颖 胡悦 李婵娟 卢静静 杜勇辉 《饲料研究》 CAS 北大核心 2024年第17期109-114,共6页
试验旨在开发木聚糖酶XynA,为饲用木聚糖酶提供新的资源。研究毕赤酵母中异源表达嗜热脂肪地芽孢杆菌XynA的最佳发酵条件、酶学性质及水解产物低聚木糖(xylo-oligosaccharide,XOS)的抗氧化性。结果显示,1.0%的甲醇诱导96 h,即可产生酶... 试验旨在开发木聚糖酶XynA,为饲用木聚糖酶提供新的资源。研究毕赤酵母中异源表达嗜热脂肪地芽孢杆菌XynA的最佳发酵条件、酶学性质及水解产物低聚木糖(xylo-oligosaccharide,XOS)的抗氧化性。结果显示,1.0%的甲醇诱导96 h,即可产生酶活约为33.7 U/mL的XynA粗酶液。XynA最适反应pH值为9.0,最适反应温度为65℃,在pH值5.0~10.5、45~75℃时能发挥80%以上活性。薄层层析(TLC)分析发现,XynA水解甘蔗渣木聚糖的主要产物为木三糖-木六糖,1000 mg/L的XOS对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除率达到72.04%,对羟自由基的清除率达到99.16%。研究表明,异源表达后的XynA具有较好的酶活和稳定性,能够高效水解木聚糖产生XOS,有助于其在饲料工业中的应用。 展开更多
关键词 低聚木糖 木聚糖酶 异源表达 酶学性质 抗氧化
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米曲霉异源表达合成虫草素
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作者 闫欢欢 尚怡彤 +4 位作者 王丽红 田学琴 廖海艳 曾斌 胡志宏 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期290-298,共9页
【目的】通过米曲霉中异源表达虫草素合成关键基因,构建米曲霉工程菌株合成虫草素。【方法】以米曲霉尿苷/尿嘧啶和组氨酸双营养缺陷型菌株AoΔpyrGΔHisB为背景菌株,利用农杆菌介导的转化方法对虫草素合成关键基因CmCns1-CmCns3进行过... 【目的】通过米曲霉中异源表达虫草素合成关键基因,构建米曲霉工程菌株合成虫草素。【方法】以米曲霉尿苷/尿嘧啶和组氨酸双营养缺陷型菌株AoΔpyrGΔHisB为背景菌株,利用农杆菌介导的转化方法对虫草素合成关键基因CmCns1-CmCns3进行过表达;通过荧光显微镜观察CmCns1和CmCns2在米曲霉中的亚细胞定位;利用高效液相色谱法(HPLC)测定转基因米曲霉虫草素含量,同时对米曲霉发酵液添加合成虫草素的前体甘氨酸和腺嘌呤,探究其在米曲霉中对合成虫草素的影响。【结果】蛹虫草CmCns1和CmCns2在米曲霉中定位于脂滴;并且米曲霉中单独过表达CmCns1、共表达CmCns1和CmCns2以及共表达CmCns1-CmCns3均能合成虫草素,发酵48 h虫草素胞外产量最高达到37.74 μg/mL;向米曲霉发酵液添加甘氨酸和腺嘌呤,不能有效提升虫草素的含量。【结论】成功在米曲霉异源表达合成虫草素。 展开更多
关键词 虫草素 米曲霉 异源表达 亚细胞定位 腺嘌呤 甘氨酸
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来源于Pseudomonas多巴脱羧酶的异源表达、纯化及酶学性质研究
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作者 周耀林 孙登岳 +1 位作者 曾志雄 李霞 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期14-19,共6页
将来源于Pseudomonas的多巴脱羧酶(DOPA decarboxylase,DODC)基因序列经过PCR扩增,双酶切,连接到载体CV6-pGEX-6P-1上,经验证、测序成功构建表达载体CV6-pGEX-6P-1-DODC。转入大肠杆菌BL21(DE3)重组表达,表达条件为OD值达到0.6~0.8,异... 将来源于Pseudomonas的多巴脱羧酶(DOPA decarboxylase,DODC)基因序列经过PCR扩增,双酶切,连接到载体CV6-pGEX-6P-1上,经验证、测序成功构建表达载体CV6-pGEX-6P-1-DODC。转入大肠杆菌BL21(DE3)重组表达,表达条件为OD值达到0.6~0.8,异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.1 mmol/L,16℃过夜培养12~16 h。结果表明:在BL21(DE3)大肠杆菌中经诱导表达得到较高表达量的DODC融合蛋白;经过GST-亲和层析、3C蛋白酶切、离子交换层析得到纯度95%以上的DODC纯化蛋白;对DODC的酶学性质进行研究,该酶的最适反应温度为40℃,对温度的影响比较敏感,在20~30℃酶活在80%以上,超过30℃酶活大幅度降低,最适缓冲液为PBS缓冲液,最适反应pH值为7.5,最适底物为左旋多巴(L-DOPA),金属阳离子Ca^(2+)对酶活力有促进作用。序列同源性分析表明,来源于Pseudomonas的DODC属于AAT-Ι超家族,并且预测出该酶的保守催化活性位点为Thr 241。 展开更多
关键词 多巴脱羧酶(DODC) 异源表达 蛋白纯化 酶学性质 底物特异性
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托高土病毒核蛋白的异源表达、纯化与结晶
13
作者 马林 鞠金鑫 +2 位作者 李琳 秦晓春 董士尚 《济南大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第6期707-712,共6页
为了获得托高土病毒核蛋白氮端结构域的蛋白(THOV-NP_(N))晶体,进一步探究其结构和功能,依次采用镍亲和层析、肝素亲和层析方法纯化大肠杆菌异源表达获得的THOV-NP_(N),利用凝胶过滤层析及十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测THOV-... 为了获得托高土病毒核蛋白氮端结构域的蛋白(THOV-NP_(N))晶体,进一步探究其结构和功能,依次采用镍亲和层析、肝素亲和层析方法纯化大肠杆菌异源表达获得的THOV-NP_(N),利用凝胶过滤层析及十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法检测THOV-NP_(N)的均一性和纯度,分别用坐滴法和悬滴法筛选和优化THOV-NP_(N)结晶条件,采用质谱法验证所得的晶体。结果表明:所使用的提取方法可以获得纯度较高、性质均一的THOV-NP_(N),在培养温度16℃,THOV-NP_(N)的质量浓度为25.0 g/L,池液中磷酸氢二铵、柠檬酸钠、氯化钠的浓度分别为0.8、0.1、0.2 mol/L及pH=5.0的条件下可以获得粒径为0.05 mm、形状近似正方体的THOV-NP_(N)晶体。 展开更多
关键词 托高土病毒 核蛋白 异源表达 纯化 结晶
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大理牛街热泉来源嗜热纤维素酶基因的克隆、异源表达及其酶学性质研究
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作者 饶孟迪 李文孟 +3 位作者 李蕾 普孝英 阿周存 尹以瑞 《中国饲料》 北大核心 2024年第3期28-33,共6页
纤维素作为自然界储量较大且廉价的可再生资源,其能被纤维素酶有效分解。由于工业生产常在高温下进行,所以嗜热纤维素酶成为研究重点。本研究从大理牛街热泉宏基因组测序数据中获得一个纤维素酶基因,命名为njcel6。将该基因在大肠杆菌... 纤维素作为自然界储量较大且廉价的可再生资源,其能被纤维素酶有效分解。由于工业生产常在高温下进行,所以嗜热纤维素酶成为研究重点。本研究从大理牛街热泉宏基因组测序数据中获得一个纤维素酶基因,命名为njcel6。将该基因在大肠杆菌中进行异源表达,并对其酶学性质进行研究。结果表明:该纤维素酶的最适pH为5.0,最适温度为50℃;50℃孵育120 min保持100%的相对活性,pH 3~10缓冲液中,孵育24 h仍能保持80%以上相对活性。该酶在K^(+)、Mg^(2+)、Fe^(3+)、Ni^(2+)和Co^(2+)等11种金属离子存在下均能保持85%以上相对活性。浓度为0.1%和1%的SDS抑制剂对酶活力抑制作用明显,抑制率达80%。综上所述,njcel6是一种具有良好热稳定性和酸碱稳定性的嗜热纤维素酶,该酶在食品加工和饲料生产等行业具有广泛的运用价值。 展开更多
关键词 热泉 纤维素酶 异源表达 酶学性质 嗜热
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黄色瘤胃球菌木聚糖酶基因xynB的异源表达与酶学性质研究
15
作者 毕海红 胡馨元 +5 位作者 王玉洁 翟圣君 张竞月 孙丽萍 王琴 夏呈强 《现代畜牧科技》 2024年第2期1-5,共5页
该试验以黄色瘤胃球菌基因组为模板,通过PCR扩增获得目的基因xynB,将xynB与表达载体PET28a连接,获得重组载体PET28a-xynB。用IPTG对含有重组载体的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,镍离子层析柱纯化后检测其酶学性质。生物信息学分析表明... 该试验以黄色瘤胃球菌基因组为模板,通过PCR扩增获得目的基因xynB,将xynB与表达载体PET28a连接,获得重组载体PET28a-xynB。用IPTG对含有重组载体的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,镍离子层析柱纯化后检测其酶学性质。生物信息学分析表明,XynB理论大小为47 kDa,预测等电点为4.49,不含信号肽,含有1个糖苷水解酶11家族结构域和1个碳水化合物结合结构域。酶学性质研究结果表明,该酶的最适pH值为5.0,最适反应温度为40℃,金属离子Mg^(2+)、Na^(+)、K^(+)和Ba^(2+)对木聚糖酶XynB有较好的激活效果。综上可知,黄色瘤胃球菌木聚糖酶XynB属于GH11家族,最适pH值为5.0,最适温度为40℃,酶比活力为62.94 U/mg。 展开更多
关键词 黄色瘤胃球菌 木聚糖酶 XYNB 异源表达 酶学性质
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β-半乳糖苷酶的来源、改造、异源表达及其在食品中的应用
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作者 李云亮 谢鹏飞 +4 位作者 刘晓霜 晁嘉品 赵晓雪 王晓静 马海乐 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2023年第23期387-393,共7页
β-半乳糖苷酶作为一种安全无毒的酶制剂,不仅广泛应用于食品工业领域中,而且在酶工程、蛋白质工程等生物技术领域也有着很大的应用潜力。微生物发酵法作为生产β-半乳糖苷酶的主流生产方法,仍存在发酵时间较长、提取率低等问题;而利用... β-半乳糖苷酶作为一种安全无毒的酶制剂,不仅广泛应用于食品工业领域中,而且在酶工程、蛋白质工程等生物技术领域也有着很大的应用潜力。微生物发酵法作为生产β-半乳糖苷酶的主流生产方法,仍存在发酵时间较长、提取率低等问题;而利用工程菌的异源表达系统生产β-半乳糖苷酶的方式具有表达量高、成本低等优点。本文对β-半乳糖苷酶异源表达系统的基因来源、表达宿主菌、表达方式以及β-半乳糖苷酶应用价值等进行阐述,旨在为新型β-半乳糖苷酶产品的开发利用提供科学依据与理论参考。 展开更多
关键词 Β-半乳糖苷酶 应用价值 基因改造 固定化 异源表达
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高山被孢霉NADP^(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶的异源表达与活性分析 被引量：1
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作者 王旭旭 孙晓琪 +3 位作者 陈海琴 赵建新 陈卫 唐鑫 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期13-19,共7页
产油真菌胞质中NADP^(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)能够为脂肪酸合成提供还原力,前期研究表明高山被孢霉的异柠檬酸脱氢酶4(Mortierella alpina isocitrate dehydrogenase4,MaIDH4)对脂质积累有积极的影响。... 产油真菌胞质中NADP^(+)依赖型异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)能够为脂肪酸合成提供还原力,前期研究表明高山被孢霉的异柠檬酸脱氢酶4(Mortierella alpina isocitrate dehydrogenase4,MaIDH4)对脂质积累有积极的影响。为了深入研究MaIDH4的性质,该文将其在大肠杆菌和毕赤酵母系统中分别进行异源表达并纯化,均成功获得纯酶,并考察了不同表达系统对酶活性和产量的影响。首先克隆MaIDH4至表达载体pET28a(+)和pPink-HC-3CZHEK构建重组质粒,然后分别转化至Escherichia coli BL21(DE3)和PichiaPink TM Strain 2进行诱导表达,最后采用镍柱纯化获得携带10×His标签的MaIDH4重组酶,检测纯酶的比活力分别是34.10 U/mg和43.00 U/mg,酶产量分别为10.28 U/L和159.12 U/L。通过纯酶比活力和酶产量分析表明相比于大肠杆菌表达系统,毕赤酵母宿主更适合MaIDH4的异源表达。 展开更多
关键词 高山被孢霉 异柠檬酸脱氢酶 异源表达 酶活性 酶产量
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具有辅助降解纤维素功能的大斑刚毛座腔菌糖苷水解酶GH61的鉴定、异源表达及功能分析 被引量：2
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作者 马玉倩 孙东辉 +3 位作者 岳浩峰 辛佳瑜 刘宁 曹志艳 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期124-135,共12页
糖苷水解酶61家族(GH61)属于一类同时具有氧化作用和水解作用的纤维素降解酶类,既具有微弱的纤维素内切酶活性,也可通过氧化作用破坏纤维素晶体结构促进纤维素酶对木质纤维素的降解,在生物质资源的利用方面具有潜在的应用价值。对大斑... 糖苷水解酶61家族(GH61)属于一类同时具有氧化作用和水解作用的纤维素降解酶类,既具有微弱的纤维素内切酶活性,也可通过氧化作用破坏纤维素晶体结构促进纤维素酶对木质纤维素的降解,在生物质资源的利用方面具有潜在的应用价值。对大斑刚毛座腔菌Setosphaeria turcica的GH61家族基因进行鉴定及生物信息学分析,通过转录组数据分析及荧光定量PCR验证,筛选出受玉米秸秆木质纤维素底物诱导表达的GH61家族基因StGH61-11。将StGH61-11进行重组表达,使用2,6-二甲氧基苯酚氧化反应测定其酶活力并优化诱导条件,表征其酶学性质并检测其对纤维素酶水解木质纤维素的促进作用。结果表明,在S.turcica基因组中存在21个GH61家族基因,且S.turcica在玉米秸秆的诱导下滤纸酶活明显增加,对其进行转录组分析发现,在以玉米秸秆为碳源时GH61家族基因中有11个基因的表达量增加。将其中StGH61-11基因在大肠杆菌中诱导表达,最佳诱导条件为25℃、1 mmol/L IPTG诱导9 h,此时获得的蛋白比活力可达到(54.08±1.67)U/g。重组蛋白StGH61-11的最佳催化条件为温度50℃、pH 5,在最佳催化条件下可以显著提高纤维素酶水解玉米秸秆的活性,协同度最高可达2.5,糖化率最高可达46.5%。 展开更多
关键词 GH61糖苷水解酶家族 多糖单加氧酶 纤维素酶 AA9 大斑刚毛座腔菌 协同降解 异源表达
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蛋白质谷氨酰胺酶在毕赤酵母中的异源表达 被引量：1
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作者 郭瑞琪 向康铭 +3 位作者 张峥宇 黄静 邹春静 金明飞 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期26-31,共6页
蛋白质谷氨酰胺酶(protein glutaminase,PG)可水解蛋白质侧链的谷氨酰胺残基,生成氨和蛋白质-L-谷氨酸,从而增加负电荷、降低蛋白等电点,进而改善蛋白质的功能特性。但其生产菌株解朊金黄杆菌的产酶量较低,仅有0.258 U/mL,且基因操作效... 蛋白质谷氨酰胺酶(protein glutaminase,PG)可水解蛋白质侧链的谷氨酰胺残基,生成氨和蛋白质-L-谷氨酸,从而增加负电荷、降低蛋白等电点,进而改善蛋白质的功能特性。但其生产菌株解朊金黄杆菌的产酶量较低,仅有0.258 U/mL,且基因操作效率低,故近年来多采用异源表达的方法,以提高其产量。该实验成功实现蛋白质谷氨酰胺酶酶原(Pro-PG)在毕赤酵母GS115中异源表达,还进行了培养基优化及重组酶学性质的研究。结果表明:重组毕赤酵母pPIC9K-Pro-PG/GS115在摇瓶水平经1%(体积分数)甲醇诱导120 h,表达出的Pro-PG经胰蛋白酶加工后,PG酶活力达到0.878 U/mL。酶学性质研究发现,重组的PG最适作用温度为60℃,在不超过60℃时孵育1 h其相对酶活力可保持在80%以上;该酶作用的最适pH为6.0,在pH 3.0~8.0条件下孵育1 h其相对酶活力可保持在70%以上。 展开更多
关键词 毕赤酵母 蛋白质谷氨酰胺酶 异源表达 发酵条件优化
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草酸青霉16β-葡萄糖苷酶的异源表达 被引量：1
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作者 张念 林颖颖 +3 位作者 祁可丹 王国平 欧阳蓓 赵喜华 《江西师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2023年第3期237-241,共5页
为探究真核菌株草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶(16BGL)在不同宿主中的异源表达情况,该文通过基因克隆技术,将16BGL基因分别与pPIC9K、pET-28a、pGAPZαA载体进行连接,转化到毕氏酵母GS115或大肠杆菌Rosetta(DE3)上,筛选阳性克隆子,比较并分... 为探究真核菌株草酸青霉16的β-葡萄糖苷酶(16BGL)在不同宿主中的异源表达情况,该文通过基因克隆技术,将16BGL基因分别与pPIC9K、pET-28a、pGAPZαA载体进行连接,转化到毕氏酵母GS115或大肠杆菌Rosetta(DE3)上,筛选阳性克隆子,比较并分析其表达情况.结果表明:16BGL-9K未能成功电转到毕氏酵母GS115上;将16BGL-28a转化到大肠杆菌Rosetta上,使用最终物质的量浓度为50μmol·L^(-1)的IPTG和质量分数为1.7%的乳糖在22℃下诱导可实现高水平表达,但极易形成包涵体且无活性.为了消除包涵体的影响,在相同条件下将16BGL的N端加入DsbA分泌信号肽,经SDS-PAGE检验,16BGL有高水平可溶性表达,但无活性;将16BGL-ZαA电转到GS115上,筛选阳性克隆子并接种到含YPG培养基的摇瓶中,结果表明:上清液蛋白质量浓度达到23.723 mg·mL^(-1),且有活性.真核来源的16BGL基因适合于真核宿主表达. 展开更多
关键词 Β-葡萄糖苷酶 异源表达 酶活
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