用于慢病毒包装的高纯度质粒DNA的大量制备和应用 被引量：1

1

作者 方红 杨文理 何涛 《泸州医学院学报》 2014年第3期257-260,共4页

目的:建立简便易行、成本低廉和安全可靠的高纯度质粒大量制备方法,探讨其在分子生物学研究中的应用。方法:培养含目的质粒的菌株,运用改良后的碱裂解法大量提取质粒DNA并进行纯化,微量核酸仪测定质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电... 目的:建立简便易行、成本低廉和安全可靠的高纯度质粒大量制备方法,探讨其在分子生物学研究中的应用。方法:培养含目的质粒的菌株,运用改良后的碱裂解法大量提取质粒DNA并进行纯化,微量核酸仪测定质粒DNA的产量及纯度;采用琼脂糖凝胶电泳、限制性核酸内切酶酶切、转染哺乳动物细胞和慢病毒包装,鉴定质粒DNA的质量及转染效率。结果:本质粒提取方法获得质粒DNA产量为2.5 mg/L菌液,OD260/OD280=1.91;以超螺旋质粒DNA为主;限制性核酸内切酶可完全酶切;哺乳动物细胞转染效率在85%以上;可用于慢病毒包装。结论:本方法抽提质粒DNA操作简单、经济实用,可替代质粒大量提取试剂盒获得高产优质的质粒DNA,充分满足了分子生物学实验的要求。 展开更多

关键词 质粒DNA 制备 酶切 转染 慢病毒包装

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靶向TIPE2基因的shRNA慢病毒载体构建及病毒包装 被引量：1

2

作者 王耀辉 王明丽 +2 位作者 陈九格 张晶 马远方 《河南大学学报（医学版）》 CAS 2014年第2期120-122,134,共4页

目的包装表达TIPE2-shRNA的慢病毒颗粒。方法查询并合成7对针对TIPE2的shRNA序列,将其克隆入pLK0.1载体,经酶切及测序正确后,将构建好的7种pLKO.1-TIPE2-shRNA质粒分别与pCDNA3.1/3×FLAG-TIPE2共转染293T细胞,Western blot鉴定干... 目的包装表达TIPE2-shRNA的慢病毒颗粒。方法查询并合成7对针对TIPE2的shRNA序列,将其克隆入pLK0.1载体,经酶切及测序正确后,将构建好的7种pLKO.1-TIPE2-shRNA质粒分别与pCDNA3.1/3×FLAG-TIPE2共转染293T细胞,Western blot鉴定干扰效率并进行后续的病毒包装。结果 4号质粒沉默效果最好,将其与Non-target-shRNA质粒分别进行病毒包装,Western blot和免疫荧光证实病毒具有良好的感染效率和沉默效果。结论 TIPE2-shRNA的慢病毒载体构建及病毒包装成功。 展开更多

关键词 TIPE2 SHRNA 慢病毒包装 基因

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CRISPR敲减猪CMAH基因的质粒构建及慢病毒的包装

3

作者 牟丽莎 王蕾 +1 位作者 谢崇伟 蔡志明 《深圳中西医结合杂志》 2015年第19期1-3,F0003,共4页

目的:构建靶向猪CMAH基因的慢病毒CRISPR-Cas9敲减质粒及进行慢病毒的包装。方法:设计并合成CMAH基因gRNA的靶序列并将其与Lenti CRISPR-v2载体连接;连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出重组子后酶切鉴定与测序;制备VSV-G、Rev、Gag/Pol等... 目的:构建靶向猪CMAH基因的慢病毒CRISPR-Cas9敲减质粒及进行慢病毒的包装。方法:设计并合成CMAH基因gRNA的靶序列并将其与Lenti CRISPR-v2载体连接;连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出重组子后酶切鉴定与测序;制备VSV-G、Rev、Gag/Pol等质粒用于包装慢病毒。结果:成功构建猪CMAH基因CRISPR-Cas9敲减质粒并包装出相应慢病毒。结论:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术能够构建敲减猪CMAH基因的质粒并能够使用其包装出病毒,为后续感染猪动脉内皮细胞(porcine aorta endothelial cell,PAEC)细胞敲减CMAH基因及功能验证奠定基础。 展开更多

关键词 慢病毒包装 基因敲减 CMAH基因 CRISPR-Cas9

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不同转染方法包装慢病毒感染人白血病细胞的比较研究 被引量：6

4

作者 张明英 袁佳佳 +3 位作者 张晓茹 邢文 白洁 周圆 《生物技术进展》 2019年第3期262-270,共9页

白血病研究中常需要在细胞中进行慢病毒介导的基因过表达或者敲降,但慢病毒生产方法存在成本高、对悬浮细胞感染效率低等问题。为解决这些问题,通过比较利用线性聚乙烯亚胺(linear polyethylenimine,LPEI)和脂质体两种转染方法包装成的... 白血病研究中常需要在细胞中进行慢病毒介导的基因过表达或者敲降,但慢病毒生产方法存在成本高、对悬浮细胞感染效率低等问题。为解决这些问题,通过比较利用线性聚乙烯亚胺(linear polyethylenimine,LPEI)和脂质体两种转染方法包装成的慢病毒对白血病细胞的感染能力,以及感染后对细胞生物学特性的影响,确定不同转染方法在白血病实验研究中的有效性和安全性。在相同条件下利用LPEI和脂质体产生慢病毒颗粒,比较发现用LPEI转染法包装的慢病毒滴度略高。根据病毒感染复数和慢病毒滴度分别感染3种白血病细胞系(K562、HL60和HEL),两种方法间感染白血病细胞系效率无差别。在感染不同细胞系时两种不同转染方法对细胞增殖略有影响,但对其他生物学特性比如细胞诱导分化和克隆形成能力的影响是一致的。因此在白血病相关研究中,转染试剂LPEI包装慢病毒方法可以成为更加经济实用的选择。 展开更多

关键词 LPEI 脂质体 慢病毒包装 白血病细胞系

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SP110基因过表达慢病毒载体的构建与包装

5

作者 贾鹏霞 刘丙雨 +4 位作者 李新月 张万江 程江 吴江东 马雅静 《转化医学杂志》 2020年第2期75-78,共4页

目的构建核体蛋白SP110基因过表达慢病毒载体,并进行慢病毒包装,为研究SP110在结核病中的作用机制奠定基础。方法利用PCR技术获得SP110基因序列并将其插入到慢病毒穿梭质粒LV5中,获得重组慢病毒质粒V-SP110,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,... 目的构建核体蛋白SP110基因过表达慢病毒载体,并进行慢病毒包装,为研究SP110在结核病中的作用机制奠定基础。方法利用PCR技术获得SP110基因序列并将其插入到慢病毒穿梭质粒LV5中,获得重组慢病毒质粒V-SP110,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,用RNAi-Mate将重组质粒和慢病毒包装质粒系统(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)包装成重组慢病毒颗粒,共转染293T细胞,包装产生慢病毒。通过荧光显微镜或FACS计数荧光细胞,结合稀释倍数计算病毒滴度。结果酶切鉴定结果显示产生约1650 bp的片段,片段大小与SP110基因cDNA大小一致。DNA测序比对测序结果与预期SP110基因序列完全一致,说明SP110基因正确插入载体中,成功构建了SP110基因过表达载体。经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为1.0×10^8 TU/mL的重组慢病毒LV5-SP110。结论SP110基因过表达慢病毒载体构建与包装成功完成,为进一步探讨SP110基因在结核病发生发展中的作用提供工具。 展开更多

关键词 SP110基因 慢病毒构建 慢病毒包装

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针对前列腺癌的PSMA-CAR慢病毒表达载体的构建及病毒包装 被引量：1

6

作者 王丙萍 段金凯 高维实 《现代肿瘤医学》 CAS 北大核心 2021年第16期2774-2779,共6页

目的:构建针对前列腺特异性膜抗原(PSMA)的CAR慢病毒表达载体,并包装病毒颗粒。方法:设计并合成针对PSMA的CAR基因序列,将设计的CAR片段连入pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-puro载体中,经酶切、PCR及测序鉴定构建是否成功。应用慢病毒三... 目的:构建针对前列腺特异性膜抗原(PSMA)的CAR慢病毒表达载体,并包装病毒颗粒。方法:设计并合成针对PSMA的CAR基因序列,将设计的CAR片段连入pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-puro载体中,经酶切、PCR及测序鉴定构建是否成功。应用慢病毒三质粒包装系统将PSMA-CAR载体进行包装,通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测GFP鉴定包装结果及包装时的转染效率。通过超速离心方法浓缩病毒颗粒。结果:成功构建了PSMA-CAR慢病毒表达载体,成功包装了PSMA-CAR慢病毒颗粒且包装时的转染效率为70.43%,经测定获得的PSMA-CAR慢病毒滴度为5×105TU/mL。结论:PSMA-CAR慢病毒表达载体的成功构建及病毒颗粒的包装为应用CAR技术治疗前列腺癌奠定了基础。 展开更多

关键词 前列腺特异性膜抗原 慢病毒表达载体 嵌合抗原受体 慢病毒包装

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miR-31慢病毒载体质粒构建及其对宫颈癌HeLa细胞增殖和迁移能力的影响

7

作者 王琳琳 胡晓霞 刘斐 《山东医药》 CAS 北大核心 2017年第28期1-4,共4页

目的构建微小核糖核酸31(miR-31)慢病毒载体质粒,并观察其对宫颈癌HeLa细胞增殖和迁移能力的影响。方法以包含miR-31基因的序列为目的片段,设计末端含有相应酶切位点的引物,PCR扩增目的片段,产物双酶切后插入线性化慢病毒载体中,构建miR... 目的构建微小核糖核酸31(miR-31)慢病毒载体质粒,并观察其对宫颈癌HeLa细胞增殖和迁移能力的影响。方法以包含miR-31基因的序列为目的片段,设计末端含有相应酶切位点的引物,PCR扩增目的片段,产物双酶切后插入线性化慢病毒载体中,构建miR-31慢病毒载体质粒并鉴定。将miR-31慢病毒载体质粒与包装质粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G共转染宫颈癌HeLa细胞,并进行慢病毒包装,检测miR-31慢病毒载体质粒滴度。取对数生长期HeLa细胞,随机分为空白对照组、miR-31组、空载体组,空白对照组不做任何处理,miR-31组予miR-31慢病毒载体质粒处理,空载体组予空载体慢病毒质粒处理。采用实时荧光定量PCR法检测各组miR-31 mRNA表达;MTT法和细胞克隆实验检测各组细胞增殖能力,Transwell小室法检测各组细胞迁移能力。结果成功构建重组慢病毒表达质粒,其病毒滴度为3×107TU/m L。miR-31组miR-31 mRNA相对表达量明显高于空白对照组、空载体组(P均<0.05),而空白对照组与空载体组比较P>0.05。miR-31组细胞增殖和迁移能力均高于空白对照组、空载体组(P均<0.05),而空白对照组与空载体组比较P均>0.05。结论成功构建了miR-31慢病毒载体质粒,建立了稳定过表达miR-31的宫颈癌HeLa细胞。稳定过表达miR-31的宫颈癌HeLa细胞增殖和迁移能力明显增强。 展开更多

关键词 宫颈癌 微小核糖核酸31 慢病毒包装 细胞增殖 细胞迁移

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含EGFP报告基因的慢病毒载体的构建及有感染能力病毒的制备

8

作者 武瑞琴 朱旭东 +1 位作者 周晓巍 黄培堂 《生物技术通讯》 CAS 2015年第1期88-90,共3页

目的:构建含EGFP报告基因的慢病毒表达载体,包装成病毒并测定病毒感染效率。方法:以pEGFP-C1为模板扩增EGFP基因,经PstⅠ和XhoⅠ酶切后与载体连接,得到慢病毒表达载体pLenti6/v5-EGFP;将此载体与包装质粒共转染包装细胞制备病毒,测定不... 目的:构建含EGFP报告基因的慢病毒表达载体,包装成病毒并测定病毒感染效率。方法:以pEGFP-C1为模板扩增EGFP基因,经PstⅠ和XhoⅠ酶切后与载体连接,得到慢病毒表达载体pLenti6/v5-EGFP;将此载体与包装质粒共转染包装细胞制备病毒,测定不同感染复数(MOI)下病毒的感染效率。结果与结论:构建了含EGFP报告基因的慢病毒表达载体,制备了有感染能力的慢病毒。 展开更多

关键词 慢病毒载体 报告基因 慢病毒包装

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慢病毒介导TFF3基因转染A549细胞对NF-κB表达的影响 被引量：2

9

作者 赵如华 宋佳悦 +4 位作者 赵晓蕊 赵柠 房涛 张静 吴靖芳 《中国老年学杂志》 CAS 北大核心 2020年第20期4389-4392,共4页

目的探讨核因子(NF)-κB在慢病毒转染过表达及沉默三叶因子(TFF)3基因的人非小细胞肺癌A549细胞中的表达意义。方法慢病毒包装TFF3基因全长片断及TFF3短发卡RNA质粒,病毒液转染A549细胞,获得稳定过表达及沉默TFF3表达的A549细胞株,实时... 目的探讨核因子(NF)-κB在慢病毒转染过表达及沉默三叶因子(TFF)3基因的人非小细胞肺癌A549细胞中的表达意义。方法慢病毒包装TFF3基因全长片断及TFF3短发卡RNA质粒,病毒液转染A549细胞,获得稳定过表达及沉默TFF3表达的A549细胞株,实时荧光定量PCR(qPCR)和Western印迹法检测TFF3、NF-κB、B细胞淋巴瘤基因(Bcl)-2、细胞周期蛋白(Cyclin)D1基因及蛋白的表达水平。结果过表达TFF3的A549细胞(TFF3)中TFF3基因较对照组增高(655±135)倍,蛋白水平较Vec组显著增高;沉默TFF3基因的A549细胞(shTFF3)沉默TFF3效率约为75%,蛋白水平也较shCK组明显降低(均P<0.01)。TFF3组NF-κB、Bcl-2、CyclinD1 mRNA及蛋白表达水平明显高于Vec组(P<0.05),shTFF3组NF-κB、Bcl-2、CyclinD1 mRNA及蛋白水平较shCK组明显降低(P<0.01)。结论TFF3的表达与NF-κB密切相关,过表达TFF3能够激活NF-κB,促进CyclinD1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,抑制了细胞凋亡,促进肺癌细胞恶性发展。 展开更多

关键词 三叶因子3 非小细胞肺癌 慢病毒包装 核因子κB 细胞周期蛋白D1 细胞凋亡

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HIF-1α过表达慢病毒载体的构建及对心肌细胞Notch配体Jagged1表达的影响 被引量：4

10

作者 王振良 丁然然 +5 位作者 哈艳平 雷洪 王可可 申志华 姜汉国 揭伟 《临床与实验病理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期416-420,共5页

目的 构建低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）过表达重组慢病毒质粒并包装病毒,将病毒感染乳鼠心肌细胞,分析其对Notch配体Jagged1表达的影响。方法 从cDNA文库中PCR扩增人HIF-1α编码序列并克隆入酶切线性化慢... 目的 构建低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）过表达重组慢病毒质粒并包装病毒,将病毒感染乳鼠心肌细胞,分析其对Notch配体Jagged1表达的影响。方法 从cDNA文库中PCR扩增人HIF-1α编码序列并克隆入酶切线性化慢病毒载体GV218,转化感受态大肠杆菌细胞筛选出阳性克隆并测序鉴定。将HIF-1α过表达慢病毒质粒与病毒包装辅助质粒共转染工具细胞HEK293T,包装出慢病毒颗粒。原代分离SD乳大鼠心肌细胞,将HIF-1α过表达慢病毒感染心肌细胞,定量PCR分析Jagged1mRNA水平的变化。结果 成功扩增HIF-1α编码序列并正确连接入线性化载体GV218,获得阳性转化子并测序无误。将转化子质粒与病毒包装辅助质粒共转染HEK293T后,获得滴度为1×108TU/ml的慢病毒颗粒,Western blot法检测到HIF-1α-GFP融合蛋白。重组慢病毒感染乳鼠心肌细胞后,胞核中见GFP信号。与对照组相比,HIF-1α过表达5天后显著上调Jagged1mRNA的水平。结论 心肌细胞中HIF-1α可诱导Jagged1的表达。HIF-1α过表达重组慢病毒载体的成功构建,为研究缺血缺氧性心肌损伤反应的分子机制奠定了基础。 展开更多

关键词 质粒构建 慢病毒包装 心肌细胞 NOTCH信号 低氧诱导因子1Α

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含鸡生殖细胞标志基因DAZL的慢病毒表达载体构建

11

作者 张廉 莫国东 廖玉英 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第13期125-127,共3页

为了构建含目的基因的慢病毒表达载体,包装成病毒并检测病毒感染情况,试验采用PCR技术和Multi Site Gateway技术构建含DAZL基因的慢病毒表达载体p Lenti6.4/EF1α/V5/DAZL并制备慢病毒。结果表明：试验成功构建了含目的基因DAZL的慢病... 为了构建含目的基因的慢病毒表达载体,包装成病毒并检测病毒感染情况,试验采用PCR技术和Multi Site Gateway技术构建含DAZL基因的慢病毒表达载体p Lenti6.4/EF1α/V5/DAZL并制备慢病毒。结果表明：试验成功构建了含目的基因DAZL的慢病毒表达载体,并制备出有感染能力的慢病毒。说明试验构建的慢病毒表达载体适用于含目的基因DAZL的慢病毒生产。 展开更多

关键词 生殖细胞 慢病毒表达载体 Multi SITE GATEWAY技术 DAZL基因 慢病毒包装 鸡

原文传递

山羊circFDXR的鉴定及其在卵巢颗粒细胞中高效表达的研究

12

作者 刘杰 李之瀚 +9 位作者 郭聪慧 冯光杭 薛文哲 刘德武 柳广斌 孙宝丽 郭勇庆 邓铭 邹娴 李耀坤 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期2330-2341,共12页

【目的】鉴定山羊环状RNA(circular RNA,circRNA)铁氧还蛋白还原酶(circFDXR)的表达,建立其在山羊原代卵巢颗粒细胞中的高效表达方式。【方法】利用PCR扩增、DNA测序、RNase R酶消化、实时荧光定量PCR鉴定circFDXR的环状性质。通过核质... 【目的】鉴定山羊环状RNA(circular RNA,circRNA)铁氧还蛋白还原酶(circFDXR)的表达,建立其在山羊原代卵巢颗粒细胞中的高效表达方式。【方法】利用PCR扩增、DNA测序、RNase R酶消化、实时荧光定量PCR鉴定circFDXR的环状性质。通过核质分离、荧光原位杂交(FISH)检测circFDXR亚细胞定位。利用同源重组将circFDXR的线性序列无缝克隆至慢病毒载体pLC5-ciR,转染至293T细胞包装病毒后进行病毒滴度测定,并确定最佳感染复数(MOI),并以最佳MOI感染山羊原代卵巢颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR检测过表达效率,并测序验证circFDXR是否正确环化。【结果】山羊circFDXR主要定位于卵巢颗粒细胞的细胞质中,耐受RNase R酶的消化。成功构建circFDXR慢病毒过表达载体,浓缩病毒滴度为5.49×10~9 TU/mL,感染山羊卵巢颗粒细胞的最佳MOI为100。实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,过表达组circFDXR表达量极显著升高(P<0.01),测序结果显示过表达的circFDXR可以正确环化。【结论】circFDXR主要定位于卵巢颗粒细胞的细胞质中,相比线性RNA具有更高的稳定性。利用慢病毒包装的circFDXR在山羊原代卵巢颗粒细胞中可以正确环化,本试验结果为进一步研究circFDXR在山羊原代卵巢颗粒细胞中的功能奠定了理论基础。 展开更多

关键词 山羊 circFDXR 慢病毒包装 卵巢颗粒细胞

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cGAS稳定表达细胞系的构建及功能鉴定

13

作者 赵呈彦 任豪杰 +2 位作者 万博 魏战勇 何文瑞 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期5317-5324,共8页

天然免疫系统会在病毒入侵机体后的第一时间对其进行识别,并合成分泌I型干扰素和炎症因子等细胞因子参与宿主抗病毒免疫反应。天然免疫应答的启动主要通过机体自身表达的模式识别受体对病毒来源的病原相关分子模式的识别来实现。cGAS是... 天然免疫系统会在病毒入侵机体后的第一时间对其进行识别,并合成分泌I型干扰素和炎症因子等细胞因子参与宿主抗病毒免疫反应。天然免疫应答的启动主要通过机体自身表达的模式识别受体对病毒来源的病原相关分子模式的识别来实现。cGAS是目前最公认的胞质DNA受体,在各种类型的细胞和组织中广泛表达。猪肾细胞PK-15是猪病毒性疾病研究过程中应用十分广泛的工具细胞,然而本研究前期的转录组学数据显示,PK-15细胞中cGAS的转录水平极低,蛋白水平几乎检测不到PK-15细胞系中cGAS的表达,这极大程度的限制了PK-15细胞在猪病毒性疾病感染与免疫机制探究中的应用。本研究旨在构建一株稳定表达cGAS的PK-15细胞系。通过慢病毒包装系统,将cGAS基因整合到靶细胞基因组,经嘌呤霉素加压筛选,获得能够稳定表达cGAS的PK-15细胞系,并以猪伪狂病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)和猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)为模式病毒,对cGAS在抗DNA病毒感染过程中的作用进行了验证。结果表明,cGAS基因成功整合到宿主细胞PK-15基因组,重组细胞系PK-15-cGAS能够稳定表达cGAS蛋白;PRV和PPV感染PK-15-cGAS细胞能诱导产生更高水平的干扰素相关基因,在PK-15-cGAS细胞中PRV和PPV的复制受到明显抑制。这些结果表明,稳定表达cGAS的PK-15细胞系构建成功,它可用于猪病毒性疾病感染与免疫机制相关探究,为后续探究该类病毒免疫逃逸机制提供了良好的试验材料。 展开更多

关键词 cGAS PK-15 稳定细胞系 慢病毒包装系统

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稳定表达牛分枝杆菌PPE13的THP-1细胞株的建立

14

作者 刘卓彤 毕斯琪 +3 位作者 孟祥苗 胡燕萍 宋厚辉 杨杨 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第5期179-184,共6页

为了深入研究牛分枝杆菌PPE13在病原-宿主相互作用中的具体机制,本研究利用慢病毒表达系统构建了PPE13稳定表达的THP-1细胞系。首先,采用分子克隆技术,以牛分枝杆菌基因组DNA为模板扩增出ppe13目的片段,构建含有ppe13片段的重组慢病毒... 为了深入研究牛分枝杆菌PPE13在病原-宿主相互作用中的具体机制,本研究利用慢病毒表达系统构建了PPE13稳定表达的THP-1细胞系。首先,采用分子克隆技术,以牛分枝杆菌基因组DNA为模板扩增出ppe13目的片段,构建含有ppe13片段的重组慢病毒表达质粒,将该质粒和慢病毒包装质粒转染至239T细胞中,72 h后收集病毒。然后,将获得的病毒感染THP-1细胞中,经1μg/mL嘌呤霉素筛选获得稳定表达PPE13的细胞株THP-1/PPE13。最后,使用ELISA方法检测稳定表达细胞系中TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的情况,以验证细胞系中PPE13的生物学活性。结果显示,相较于对照细胞THP-1/Con,THP-1/PPE13中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平均显著升高。该细胞系的建立为深入研究PPE13调控细胞信号通路的功能提供了实验基础。 展开更多

关键词 牛分枝杆菌 PPE13 慢病毒包装 稳定表达

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H7N9流感假病毒制备条件的优化及其在中和抗体检测中的初步应用 被引量：2

15

作者 李善琴 黄保英 +7 位作者 齐香荣 任皎 赵莉 宋敬东 王文玲 谭文杰 阮力 田厚文 《生物技术通讯》 CAS 2016年第3期348-353,共6页

目的:优化A/Anhui/1/2013(H7N9)流感假病毒的制备条件。方法:采用基于慢病毒载体的假病毒包装系统,通过对质粒组合方式、骨架质粒与包膜质粒配比、质粒复合物与转染试剂配比、换液时间点、维持液血清浓度、假病毒收获时间点等条件的探索... 目的:优化A/Anhui/1/2013(H7N9)流感假病毒的制备条件。方法:采用基于慢病毒载体的假病毒包装系统,通过对质粒组合方式、骨架质粒与包膜质粒配比、质粒复合物与转染试剂配比、换液时间点、维持液血清浓度、假病毒收获时间点等条件的探索,优化H7N9假病毒的包装条件;通过对4种假病毒纯化方案的比较,确定纯化方法;对纯化的假病毒进行Western印迹鉴定和电镜形态观察,了解其生物学特征;通过中和试验了解其在中和抗体检测中的应用情况。结果:假病毒包装条件优化结果表明,以血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA)作为膜质粒,采用骨架质粒与膜质粒质量比3:1、质粒复合物与转染试剂质量体积比1:2混合,转染293FT细胞后10 h换含2%胎牛血清的维持液,培养48 h后收获上清,可高效获得流感假病毒AHop-H7N9pp;不同纯化方式获得的假病毒对感染H7N9的雪貂血清的中和抗体检测结果表明,假病毒纯化方法对中和抗体检测灵敏度的影响没有显著性差异;生物学特征分析显示,纯化的假病毒在电镜下具有典型的流感病毒形态,Western印迹能检测到HA和P24蛋白;多种流感疫苗小鼠血清中和试验结果表明该假病毒具有高度特异性,可用于H7N9中和抗体检测。结论:获得了包装有A/Anhui/1/2013(H7N9)HA与NA的假病毒,并确定了高效制备H7N9假病毒的各条件参数,为基于H7N9流感假病毒的中和抗体检测平台的建立奠定了基础。 展开更多

关键词 慢病毒载体包装系统 H7N9流感病毒 假病毒 中和试验

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过表达JMJD6基因的293T细胞系的构建及对水疱性口炎病毒增殖效率的评价 被引量：1

16

作者 黄梦瑶 杨帆 +8 位作者 杨洋 邵文华 王家丽 吕岳芹 赵晓义 陈治彤 曹伟军 张伟 郑海学 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期569-576,共8页

为提高水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)在细胞中的增殖效率,本研究利用慢病毒包装系统构建Jumonji C结构域蛋白6(Jumonji domain-containing protein 6,JMJD6)过表达的HEK-293T/JMJD6细胞系,分析VSV在HEK-293T/JMJD6细... 为提高水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)在细胞中的增殖效率,本研究利用慢病毒包装系统构建Jumonji C结构域蛋白6(Jumonji domain-containing protein 6,JMJD6)过表达的HEK-293T/JMJD6细胞系,分析VSV在HEK-293T/JMJD6细胞系与HEK-293T细胞中的复制差异。首先以JMJD6基因为目标,构建重组质粒pLV-puro-3×Flag-JMJD6,并与辅助质粒pMD2.G和psPAX2共转染至HEK-293T细胞进行慢病毒包装。将包装好的慢病毒感染HEK-293T细胞并通过嘌呤霉素筛选获得过表达JMJD6基因的阳性细胞。利用Western-blot、间接免疫荧光试验、流式细胞术和蚀斑试验检测VSV在HEK-293T/JMJD6细胞系中的复制能力。结果显示,在HEK-293T/JMJD6细胞系中,VSV的复制能力显著增强。实时荧光定量检测VSV感染的HEK-293T/JMJD6细胞系和野生型HEK-293T细胞中干扰素下游基因的表达,结果显示HEK-293T/JMJD6细胞系抑制VSV诱导的Ⅰ型干扰素下游基因的产生。总之,本研究构建的HEK-293T/JMJD6细胞系能显著促进VSV的增殖并抑制Ⅰ型干扰素信号通路,为VSV疫苗候选细胞株的筛选奠定了基础。 展开更多

关键词 JMJD6 水疱性口炎病毒 慢病毒包装 过表达细胞系 干扰素

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慢病毒介导的TET2基因稳定敲低SKM-1细胞株的构建及验证

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作者 谷晓丽 杨秀鹏 +2 位作者 喻丽 凌志明 许勇钢 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期160-168,共9页

目的:构建稳定敲低TET2基因的SKM-1细胞株,将包装好的H_TET2-shRNA慢病毒感染SKM-1细胞株,得到H_TET2-shRNA SKM-1稳定株。方法:将稳定敲低的SKM-1细胞株进行qPCR和Western blot实验验证。利用CCK-8细胞活力检测试剂盒和流式细胞术分别... 目的:构建稳定敲低TET2基因的SKM-1细胞株,将包装好的H_TET2-shRNA慢病毒感染SKM-1细胞株,得到H_TET2-shRNA SKM-1稳定株。方法:将稳定敲低的SKM-1细胞株进行qPCR和Western blot实验验证。利用CCK-8细胞活力检测试剂盒和流式细胞术分别检测转染前后SKM-1细胞的增殖活性和凋亡情况。结果:qPCR验证H_TET2-shRNA的SKM-1细胞中TET2基因表达量明显降低;Western blot表明H_TET2-shRNA的SKM-1细胞中TET2蛋白表达量也明显降低;利用CCK-8细胞活力检测证实了TET2基因稳定敲低后并不影响细胞的活力;细胞周期检测发现敲低TET2后S期细胞占总细胞数的48.1%,高于SKM-1组(42.3%)和对照空质粒组;细胞凋亡检测发现TET2敲低组SKM-1细胞凋亡率为0.6%,低于空质粒组的4.4%。结论:通过慢病毒介导构建TET2基因稳定低表达的SKM-1细胞株,利用PCR、Western blot实验验证成功构建细胞株,利用CCK-8细胞活力检测证实TET2基因稳定敲低后并不影响细胞活力;流式细胞术细胞周期检测发现TET2基因敲低会影响细胞DNA复制功能,导致细胞间期分裂异常,影响细胞生长和自我修复;流式细胞术细胞凋亡检测发现TET2基因敲低会抑制细胞凋亡,这可能与TET2是抑癌基因相关。 展开更多

关键词 TET2敲低细胞株 SKM-1细胞株 慢病毒包装 细胞周期 细胞凋亡

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基于CRISPR/cas9文库筛选的慢病毒库包装方法研究 被引量：1

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作者 刘铁柱 李阿茜 +7 位作者 李乃哲 曲园园 李川 张全福 刘洋 李德新 梁米芳 王世文 《中华实验和临床病毒学杂志》 CAS CSCD 2019年第2期207-211,共5页

目的探讨基于CRISPR/cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9)文库筛选的慢病毒库包装优化条件。方法采用RT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA法)和免疫荧光法,对不同质粒... 目的探讨基于CRISPR/cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9)文库筛选的慢病毒库包装优化条件。方法采用RT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA法)和免疫荧光法,对不同质粒配比、不同收毒时间以及不同量的Lipofectamine 3000 reagent包装出的慢病毒滴度进行检测,最后通过高通量测序技术评价慢病毒库的sgRNA(single guide RNA,单链引导RNA)覆盖度和reads数分布。结果当质粒配比psPAX2∶pMD2.0G∶Lentivirus library=2∶1∶1时,慢病毒滴度较高;当加入Lipofectamine 3000 reagent的量为10 μl时,慢病毒滴度较高。两种情况,RT-PCR和ELISA法结果一致。免疫荧光显示,收毒时间为60 h时慢病毒滴度较高。经Ion Torrent高通量测序,按照本研究的最优条件包装出的慢病毒库覆盖度达99.3%,sgRNA的reads数符合正态分布。结论本研究探索了慢病毒库包装的优化条件,为下一步CRISPR/cas9文库筛选提供保证。 展开更多

关键词 CRISPR/cas9文库筛选 慢病毒库包装 高通量测序技术

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鲍曼不动杆菌外膜蛋白A慢病毒载体的构建及其对RAW264.7细胞NLRP3炎症小体的激活 被引量：7

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作者 安志远 丁文一 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2019年第2期146-150,共5页

目的建立OmpA过表达慢病毒载体并观察其对RAW264.7细胞NLRP3炎症小体的激活。方法以鲍曼不动杆菌ATCC 19606为模板,设计引物扩增OmpA基因,将其克隆至慢病毒表达载体pCDH-MSCV-copGFP中。将此表达质粒和辅助质粒共转染HEK293T细胞包装病... 目的建立OmpA过表达慢病毒载体并观察其对RAW264.7细胞NLRP3炎症小体的激活。方法以鲍曼不动杆菌ATCC 19606为模板,设计引物扩增OmpA基因,将其克隆至慢病毒表达载体pCDH-MSCV-copGFP中。将此表达质粒和辅助质粒共转染HEK293T细胞包装病毒,浓缩病毒上清液并用GFP报告基因法测定病毒滴度;用包装病毒颗粒感染RAW264.7细胞48h,Real-time PCR法检测OmpA的mRNA表达水平,用Western blot法检测OmpA蛋白以及感染后NLRP3炎症小体相关蛋白。结果成功构建OmpA过表达慢病毒载体并在HEK293T细胞中包装得到病毒,经测定病毒滴毒为1.5×109 TU/mL;重组OmpA病毒感染RAW264.7细胞表达OmpA蛋白,该蛋白能引起NLRP3炎症小体激活。结论成功构建OmpA过表达慢病毒载体并证明OmpA可激活RAW264.7细胞NLRP3炎症小体。 展开更多

关键词 鲍曼不动杆菌 外膜蛋白A 慢病毒包装 RAW264.7细胞 NLRP3炎症小体

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鼠PVRL-2慢病毒载体的构建及其在3T3-L1细胞中的表达

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作者 马静 刘晓萌 +4 位作者 张传海 郑宗基 赵倩伟 杨鸣琦 张雷 《畜牧与兽医》 北大核心 2013年第8期8-13,共6页

过多的脂肪和胆固醇随着肉蛋奶被人体摄入是导致人类高血脂等各种疾病诱发的原因之一,而探索脂代谢通路相关基因的表达变化及其调控机制已经成为分子生物学技术在兽医学领域中的研究热点。与高血脂有关的ApoE、ApoC1和Tomm40等基因研究... 过多的脂肪和胆固醇随着肉蛋奶被人体摄入是导致人类高血脂等各种疾病诱发的原因之一,而探索脂代谢通路相关基因的表达变化及其调控机制已经成为分子生物学技术在兽医学领域中的研究热点。与高血脂有关的ApoE、ApoC1和Tomm40等基因研究较多,而与这些基因共同位于小鼠七号染色体上且遗传距离较近的PVRL-2及其编码蛋白Nectin-2则少见报道。为了解PVRL-2在脂代谢中的作用,本研究利用成功构建的PVRL-2慢病毒载体包装病毒在3T3-L1前脂细胞中进行了过表达分析,并通过生物信息学方法对鼠Nectin-2蛋白的结构及其在血脂调控方面的潜在功能进行了预测。结果显示,与对照相比,病毒侵染的3T3-L1细胞中PVRL-2的表达量升高近100倍,而PPARα的表达量则升高了4.5倍;蛋白结构预测显示Necitn-2为含有信号肽的跨膜蛋白。PPARα表达量上升会引起脂肪酸代谢相关基因的活化进而能够改善机体的脂代谢,而信号肽以及跨膜结构的存在表明Nectin-2蛋白有可能是通过与膜上的蛋白受体相结合进而启动下游脂代谢的信号通路。这提示或可将Nectin-2作为新的预防和治疗血脂异常等心血管疾病的药物靶点。 展开更多

关键词 PVRL-2 慢病毒包装 3T3-L1 表达

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