拟南芥原生质体瞬时表达快速验证重组酶外源基因删除

1

作者 池俊杰 戴绍军 +1 位作者 魏建华 王宏芝 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期86-92,共7页

通过在拟南芥原生质体中瞬时表达重组酶删除系统,以拟南芥热激蛋白Hsp18.2基因的启动子诱导加入马铃薯StLs1基因第2个内含子的重组酶表达,证明瞬时转化质粒DNA中位于识别位点之间的基因元件可以被有效删除。建立了一种快速验证重组酶外... 通过在拟南芥原生质体中瞬时表达重组酶删除系统,以拟南芥热激蛋白Hsp18.2基因的启动子诱导加入马铃薯StLs1基因第2个内含子的重组酶表达,证明瞬时转化质粒DNA中位于识别位点之间的基因元件可以被有效删除。建立了一种快速验证重组酶外源基因删除系统的方法。 展开更多

关键词 位点特异性重组系统 热激蛋白Hsp18 2启动子 拟南芥原生质体瞬时表达

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转基因在菊花叶肉原生质体瞬时表达及亚细胞定位分析 被引量：1

2

作者 丁林云 万可 +4 位作者 杨丹 王同 王春梅 郭书巧 杨霞 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第2期518-524,共7页

为探究用于亚细胞定位研究的菊花叶肉原生质体分离的最适条件,本研究以菊花无菌苗叶片为受体材料,分析不同叶龄叶片和酶解时间对菊花原生质体细胞产量的影响,并利用外源质粒的导入验证了聚乙二醇(PEG)介导的菊花原生质体瞬时转化体系。... 为探究用于亚细胞定位研究的菊花叶肉原生质体分离的最适条件,本研究以菊花无菌苗叶片为受体材料,分析不同叶龄叶片和酶解时间对菊花原生质体细胞产量的影响,并利用外源质粒的导入验证了聚乙二醇(PEG)介导的菊花原生质体瞬时转化体系。结果表明,以组织培养14 d的菊花无菌苗叶片为外植体材料,在含1.5%纤维素酶、0.4%离析酶和0.8 mol/L甘露醇的酶解液中振荡酶解6 h,能获得高产的原生质体细胞。采用PEG介导的瞬时转化含绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体,在菊花原生质体细胞中观察到强烈的绿色荧光信号。结果显示,稗草乙烯转录因子基因(EcERF)在菊花原生质体中与本氏烟草叶片中的瞬时表达一致,EcERF基因定位于细胞核中。 展开更多

关键词 菊花 原生质体 瞬时表达 亚细胞定位

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柱花草叶肉原生质体提取与瞬时表达体系构建 被引量：1

3

作者 高静 杨丽云 +1 位作者 张世子 蒋凌雁 《草地学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第3期893-902,共10页

柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明:采用1... 柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明:采用1.5%纤维素酶、1.25%离析酶、0.5 mol·L^(-1)甘露醇和4 mmol·L^(-1)MES酶解液组合,酶解时间为16 h时,原生质体的产量和活性均达到最佳,分别为(4.567×10^(6))个·g^(-1)和92.271%;原生质体浓度为(6×10^(5))个·mL^(-1)、质粒浓度为0.6μg·μL^(-1),PEG-4000浓度为50%、转化时间为5 min时,转化效率最高,可达52.524%。构建了目标蛋白SgRKL1表达载体pA7-BIUTNT::SgRKL1-GFP,利用PEG介导法将其转入柱花草原生质体,激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示SgRKL1蛋白定位于细胞膜上,说明所建立的柱花草叶肉原生质体瞬时表达体系可应用于目标基因的瞬时表达和亚细胞定位研究。 展开更多

关键词 柱花草 叶肉原生质体 酶解 PEG介导 瞬时表达

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结缕草叶肉细胞原生质体瞬时基因表达系统的构建 被引量：1

4

作者 管瑾 郭一荻 +2 位作者 刘凌云 尹淑霞 滕珂 《草业学报》 CSCD 北大核心 2023年第7期61-71,共11页

为了结合转基因方法探索结缕草基因功能,建立高效、快速的结缕草原生质体制备及瞬时基因表达系统,利用正交试验对影响原生质体制备的主要因素进行优化,同时利用原生质体进行亚细胞定位和蛋白互作研究。结果表明,当酶配比为2%(w/v) cellu... 为了结合转基因方法探索结缕草基因功能,建立高效、快速的结缕草原生质体制备及瞬时基因表达系统,利用正交试验对影响原生质体制备的主要因素进行优化,同时利用原生质体进行亚细胞定位和蛋白互作研究。结果表明,当酶配比为2%(w/v) cellulase R10和1.5%(w/v) macerozyme R10,酶解时间为7 h时,原生质体产量和活性均达到最高,分别为1.23×107个·mL^(-1)和98%以上,满足后续转化所需。多次重复试验表明,加入5~10μg质粒,原生质体转化率可达75%以上。利用原生质体转化体系进行了亚细胞定位检测,结果发现结缕草ZjNOL和ZjNYC1定位在叶绿体中,ZjZFN定位在细胞核中。双分子荧光互补分析证明ZjNOL和ZjNYC1在叶绿体中相互作用。原生质体制备及转化方法与遗传学和组学技术相结合,能够为结缕草基因功能研究和基因编辑提供支持。 展开更多

关键词 结缕草 原生质体 瞬时基因表达 亚细胞定位 蛋白互作

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拟南芥原生质体瞬时表达系统检测病原菌蛋白激发子的免疫活性 被引量：2

5

作者 马雪慧 粟永英 +6 位作者 罗霄 甘爽 杨捷 陈后均 唐昕羽 蔡易 郭晋雅 《基因组学与应用生物学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期4635-4640,共6页

激发子是一类能激活植物防卫反应的化合物,病原菌的某些分泌蛋白可作为激发子激活植物免疫。目前已有许多不同来源的植物免疫激发子被报道,但仍有大量的病原菌分泌型蛋白激发子尚未被鉴定,其触发的植物免疫信号转导途径尚不明确。本研... 激发子是一类能激活植物防卫反应的化合物,病原菌的某些分泌蛋白可作为激发子激活植物免疫。目前已有许多不同来源的植物免疫激发子被报道,但仍有大量的病原菌分泌型蛋白激发子尚未被鉴定,其触发的植物免疫信号转导途径尚不明确。本研究通过构建四种病原菌分泌蛋白激发子基因(稻瘟病菌MoHrip1及MoHrip2,大丽轮枝菌PevD1,核盘菌SsCut)瞬时表达载体,利用拟南芥原生质体瞬时表达系统获得上述四种分泌蛋白,鉴定其触发植物免疫的活性,初探其参与的植物免疫信号途径。结果表明,MoHrip1、MoHrip2、PevD1和SsCut可引起叶片中活性氧的爆发和胼胝质的积累;它们在拟南芥原生质体细胞中均能激活PTI信号途径下游报告基因FRK1的表达。证明上述四种病原菌蛋白激发子可能参与了植物PTI免疫反应途径的调控;同时也表明本研究采用的原生质体瞬时表达系统可作为快速筛选和鉴定植物免疫激发子的方法。 展开更多

关键词 植物免疫 病原菌 激发子 原生质体瞬时表达

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棉花叶肉原生质体分离及目标基因瞬时表达体系的建立 被引量：30

6

作者 李妮娜 丁林云 +1 位作者 张志远 郭旺珍 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期231-239,共9页

以棉花幼嫩子叶为材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立了稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为材料,混合1.5%纤维素酶、0.4... 以棉花幼嫩子叶为材料,分析影响棉花叶肉原生质体分离及目标基因转化的主要因素,以棉花叶肉原生质体为受体,建立了稳定、高效的目标基因瞬时表达与鉴定体系。技术体系包括,选择自然生长12 d的棉花幼嫩子叶为材料,混合1.5%纤维素酶、0.4%离析酶、0.5 mol L–1甘露醇、20 mmol L–1 KCl、20 mmol L–1 MES、0.1 mol L–1 CaCl2和1.0 g L–1 BSA,在28℃黑暗条件下振荡酶解8 h,可游离出浓度达1.0×106 mL–1以上的纯净棉花叶肉原生质体。利用该方法将棉花锌指蛋白基因GhZFP2整合到pJIT166-GFP质粒载体,构建了GhZFP2:GFP融合载体,采用40%PEG-4000介导转化,获得高转化率的棉花叶肉原生质体。对目标基因瞬时表达产物检测表明,GhZFP2蛋白清晰定位在细胞核上。 展开更多

关键词 棉花 原生质体 PEG介导 转化 目标基因 瞬时表达

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利用杨树原生质体瞬时表达系统筛选杨生褐盘二孢菌效应因子蛋白 被引量：6

7

作者 曹友志 谭碧玥 +1 位作者 王明庥 黄敏仁 《南京林业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期31-36,共6页

效应因子蛋白在病原真菌侵染宿主植物过程中发挥着重要作用,效应因子的筛选和鉴定是目前研究的难点。笔者以杨生褐盘二孢菌全基因组测序结果为基础,根据真菌效应因子蛋白结构特征,预测出106个候选效应因子,并成功克隆其中25个。利用杨... 效应因子蛋白在病原真菌侵染宿主植物过程中发挥着重要作用,效应因子的筛选和鉴定是目前研究的难点。笔者以杨生褐盘二孢菌全基因组测序结果为基础,根据真菌效应因子蛋白结构特征,预测出106个候选效应因子,并成功克隆其中25个。利用杨树原生质体瞬时表达系统对这25个候选效应因子蛋白进行细胞内功能筛选,鉴定出4个效应因子蛋白可以抑制杨树转录因子WRKY29启动子的活性,表明这4个效应因子蛋白在干扰植物免疫系统的信号传导途径中发挥重要作用。 展开更多

关键词 杨树原生质体瞬时表达系统 WRKY29 杨生褐盘二孢菌 效应因子

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芜菁原生质体的分离及绿色荧光蛋白的瞬时表达 被引量：6

8

作者 周波 聂玉哲 +1 位作者 张晓磊 李玉花 《生物技术通讯》 CAS 2008年第4期542-544,共3页

目的:分离芜菁叶片原生质体,建立蛋白质在芜菁原生质体的瞬时表达系统。方法:以津田芜菁成叶为试材,酶解分离原生质体;通过PEG介导的转化,将编码绿色荧光蛋白(GFP)的瞬时表达载体转入原生质体中,用激光扫描共聚焦显微镜检测原生质体中GF... 目的:分离芜菁叶片原生质体,建立蛋白质在芜菁原生质体的瞬时表达系统。方法:以津田芜菁成叶为试材,酶解分离原生质体;通过PEG介导的转化,将编码绿色荧光蛋白(GFP)的瞬时表达载体转入原生质体中,用激光扫描共聚焦显微镜检测原生质体中GFP的表达情况。结果:分离出大量的津田芜菁原生质体,并获得了较高的转化效率,GFP在整个原生质体中都有表达。结论:建立了津田芜菁原生质体瞬时表达系统。 展开更多

关键词 芜菁 原生质体 瞬时表达 绿色荧光蛋白

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华南象草原生质体分离及基因瞬时表达研究 被引量：4

9

作者 唐然 彭小群 解新明 《草地学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期571-579,共9页

以华南象草(Pennisetum purpureum)幼叶鞘为材料,采用L_(16)(4~5)正交试验设计,对分离原生质体过程中的纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解液pH、甘露醇浓度、酶解时间5个因素进行筛选,建立了高效的象草叶鞘原生质体分离体系,并进行目标基... 以华南象草(Pennisetum purpureum)幼叶鞘为材料,采用L_(16)(4~5)正交试验设计,对分离原生质体过程中的纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解液pH、甘露醇浓度、酶解时间5个因素进行筛选,建立了高效的象草叶鞘原生质体分离体系,并进行目标基因的瞬时转化,以期为象草基因功能研究奠定基础。结果表明:叶鞘在含有1.5%纤维素酶R-10,0.75%离析酶R-10,0.5 mol·L^(-1)甘露醇,pH为5.8的酶解液中酶解4 h,原生质体产量达5.11×10~6个·g FW^(-1),活力达91.08%,酶解时间对象草原生质体产量和活力的影响最大。用PEG介导法将2个分别带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的载体转入原生质体中,转化效率最高可达77.47%,共转化效率为8.79%。所分离的原生质体可用于基因的瞬时表达研究。 展开更多

关键词 象草 原生质体 PEG介导 瞬时表达

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橡胶树原生质体的分离及红色荧光蛋白的瞬时表达研究 被引量：2

10

作者 于晓玲 阮孟斌 王树昌 《中国农学通报》 CSCD 2013年第28期18-22,共5页

分离巴西橡胶树松散愈伤组织原生质体,建立目标基因在橡胶原生质体的瞬时表达系统。以巴西橡胶树松散愈伤组织为材料,酶解分离得到高纯度原生质体,通过电击介导的转化方法,将编码红色荧光蛋白(RFP)的植物表达载体转入原生质体中,用激光... 分离巴西橡胶树松散愈伤组织原生质体,建立目标基因在橡胶原生质体的瞬时表达系统。以巴西橡胶树松散愈伤组织为材料,酶解分离得到高纯度原生质体,通过电击介导的转化方法,将编码红色荧光蛋白(RFP)的植物表达载体转入原生质体中,用激光扫描共聚焦显微镜检测原生质体中RFP的表达情况。初步建立了橡胶原生质体瞬时表达系统。 展开更多

关键词 巴西橡胶树 原生质体 瞬时表达 红色荧光蛋白

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甘蓝型油菜异三聚体G蛋白原生质体瞬时表达体系的建立

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作者 陈云 于一帆 +3 位作者 潘淑芬 周研 葛会敏 刘立军 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2016年第6期21-25,共5页

为建立甘蓝型油菜异三聚体G蛋白各组分原生质体瞬时表达体系,以油菜叶片为试材,从试材选取、平摇时间和聚乙二醇浓度方面优化了油菜原生质体制备条件和转化条件。结果表明,选取30 d苗龄叶片、平摇10 min时原生质体游离状态最佳,产量为10... 为建立甘蓝型油菜异三聚体G蛋白各组分原生质体瞬时表达体系,以油菜叶片为试材,从试材选取、平摇时间和聚乙二醇浓度方面优化了油菜原生质体制备条件和转化条件。结果表明,选取30 d苗龄叶片、平摇10 min时原生质体游离状态最佳,产量为10.73×10~6/m L,活力可达96.4%。采用30%PEG转化原生质体时,目的蛋白表达量最高。Western Bolt的检测分析表明,异三聚体G蛋白各组分均参与了甘蓝型油菜对ABA的应答反应,当ABA浓度分别为100,150,100,50 mmol/L时,Bn GA1、Bn GB1、Bn GG2和BnRGS1蛋白的表达量最高。 展开更多

关键词 油菜 原生质体瞬时表达 异三聚体G蛋白

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棉花真叶原生质体分离及瞬时表达体系的优化 被引量：8

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作者 李青 鱼海鹏 +6 位作者 张子豪 孙正文 张艳 张冬梅 王省芬 马峙英 阎媛媛 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第21期4514-4524,共11页

【目的】真叶细胞能模拟植物内源条件,建立基于棉花真叶原生质体的高效瞬时表达体系,为快速有效研究棉花基因功能提供方法。【方法】以陆地棉TM-1真叶为材料,采用常用的纤维素酶和离析酶组合分离原生质体,探究影响原生质体分离的叶龄、... 【目的】真叶细胞能模拟植物内源条件,建立基于棉花真叶原生质体的高效瞬时表达体系,为快速有效研究棉花基因功能提供方法。【方法】以陆地棉TM-1真叶为材料,采用常用的纤维素酶和离析酶组合分离原生质体,探究影响原生质体分离的叶龄、渗透压、酶解液成分和酶解时间,及渗透压和酶解时间对原生质体活力的影响,并分析渗透压、PEG浓度和培养液种类对原生质体瞬时转化的影响,进而优化棉花真叶原生质体瞬时表达体系。构建GhLTP-GFP表达载体,对比融合蛋白在拟南芥、棉花原生质体和烟草表皮细胞中的亚细胞定位,验证该体系。【结果】不同于棉花子叶,酶解液中高浓度CaCl_(2)会显著抑制真叶细胞壁的酶解,含10 mmol·L^(-1)CaCl_(2)的酶解液能有效分离棉花真叶原生质体。甘露醇显著影响原生质体得率,含0.5 mol·L^(-1)甘露醇的酶解液分离原生质体得率最高,且细胞形态维持较好,而0.4 mol·L^(-1)甘露醇条件下原生质体活力降低一倍,表明0.5 mol·L^(-1)甘露醇能较好维持棉花真叶原生质体渗透压。陆地棉刚展平的真叶分离所得原生质体大小合适,而展平后的嫩叶分离得到的原生质体细胞较大,得率降低一倍。酶解处理7 h前,原生质体游离缓慢,酶解9 h原生质体产量达到高峰,继续酶解原生质体将破裂,得率降低。在等渗条件下用40%PEG4000转化所得原生质体,转化效率最高,而普遍采用的低渗条件不利于棉花真叶原生质体的转化。转化后,用WI溶液继续培养原生质体,会引起原生质体的大量破裂,用含0.5 mol·L^(-1)甘露醇的W5溶液继续培养,有利于原生质体形态的维持,转化率提高到90%。表达载体35S:GhLTP-GFP分别转入棉花、拟南芥原生质体和烟草表皮细胞,GFP信号在细胞中的定位结果一致。【结论】建立的棉花真叶原生质体瞬时表达体系,可获得8.10×10^(-6)个/mL活力在95%以上的高质量原生质体,原生质体得率提高8倍,转化效率达到90%,可用于亚细胞定位、蛋白互作,以及代谢调控网络研究等。 展开更多

关键词 棉花 TM-1 原生质体分离 瞬时表达

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小麦叶肉细胞原生质体制备参数解析及在基因瞬时表达上的应用 被引量：6

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作者 杜晓敏 王均 +2 位作者 安子玄 裴丹 王华忠 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2015年第6期52-60,共9页

为建立一套稳定高效的小麦叶肉细胞原生质体制备技术流程,以小麦幼苗叶片为材料,采用正交和随机设计试验分析了影响小麦叶肉细胞原生质体产量的制备因素。结果发现,酶解条件相关因素对制备原生质体产量的影响由大到小依次为酶解液甘露... 为建立一套稳定高效的小麦叶肉细胞原生质体制备技术流程,以小麦幼苗叶片为材料,采用正交和随机设计试验分析了影响小麦叶肉细胞原生质体产量的制备因素。结果发现,酶解条件相关因素对制备原生质体产量的影响由大到小依次为酶解液甘露醇浓度、纤维素酶浓度、酶解时间和离析酶浓度;甘露醇浓度和纤维素酶浓度对原生质体产量的增长表现相互促进模式,延长酶解时间情况下低纤维素酶浓度产出的原生质体较高纤维素酶浓度破碎情况少,峰值过后的产量下降慢。研究还发现取材幼苗苗龄、光照条件和取材叶位等因素对原生质体产量也有影响。综合以上结果确定了一套优化的参数组合:以黑暗培养条件下的10 d苗龄小麦幼苗第2片真叶为材料,酶解液中的纤维素酶浓度为0.5%、离析酶浓度为0.6%、甘露醇浓度为0.5 mol/L,酶解时间为6 h,使用此参数组合制备的原生质体形状均一、破碎情况轻,产量可达(7.28±2.18)×106个/g,有活性原生质体的比例可达(95.06±2.66)%。采用PEG-Ca^(2+)介导的方法将目标基因导入制备的原生质体,结果表明GFP基因的转化效率可达(61.31±5.74)%,小麦基因Ta ATG8h和异源植物拟南芥基因At PIP2;1的蛋白质产物均定位于正确的亚细胞结构处。 展开更多

关键词 小麦 原生质体 基因转化 瞬时表达

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PEG介导的柳枝稷叶肉细胞原生质体瞬时表达体系的建立 被引量：5

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作者 祁泽文 孙鑫博 +3 位作者 樊波 张雪 袁建波 韩烈保 《草业学报》 CSCD 北大核心 2017年第9期113-120,共8页

为了建立以PEG介导的柳枝稷叶肉细胞原生质体瞬时表达体系,本研究以柳枝稷Alamo品种的叶片为材料,通过设计梯度实验确定柳枝稷原生质体分离的最佳条件,每组梯度实验重复3次,方案如下:1)对植物培养的时间进行优化。酶解时间固定在8h,甘... 为了建立以PEG介导的柳枝稷叶肉细胞原生质体瞬时表达体系,本研究以柳枝稷Alamo品种的叶片为材料,通过设计梯度实验确定柳枝稷原生质体分离的最佳条件,每组梯度实验重复3次,方案如下:1)对植物培养的时间进行优化。酶解时间固定在8h,甘露醇浓度为0.6mol/L,将培养了1,2,3和4周的黄化苗用作实验材料;2)渗透压优化。选取2周的黄化苗为实验材料,酶解时间固定在8h,甘露醇浓度分别为0.4,0.5,0.6,0.7和0.8mol/L;3)酶解时间优化。选取2周的黄化苗为实验材料,甘露醇浓度为0.6mol/L,酶解时间分别为6,7,8,9和10h。通过对比分析发现,苗龄为2周的柳枝稷黄化苗叶片在甘露醇为0.6mol/L的酶解液中,黑暗,28℃并裂解8h后分离的原生质体最为理想。接下来构建了能够在植物细胞内表达GFP-MYB103融合蛋白(GFP为绿色荧光蛋白)的重组质粒LN-OsMYB103,利用PEG介导法将质粒LN-OsMYB103转化进入柳枝稷原生质体,并且在激光共聚焦显微镜下观察到了强烈的绿色荧光蛋白信号。该结果表明,分离的原生质体可以行使正常生物学功能。综上所述,利用柳枝稷叶片建立了一套完整的柳枝稷叶肉细胞原生质体瞬时表达体系。这将为深入开展柳枝稷的功能基因组学研究奠定了基础。 展开更多

关键词 柳枝稷 PEG 原生质体 瞬时表达

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沙冬青子叶原生质体瞬时表达体系的建立及其AmDREB1蛋白的亚细胞定位 被引量：7

15

作者 楠迪娜 薛敏 +2 位作者 唐宽刚 任美艳 王茅雁 《植物科学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期562-568,共7页

以沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.ex Kom.)Cheng f.)幼苗的子叶为材料,对其原生质体的分离、纯化和瞬时表达体系进行了研究。结果表明,子叶原生质体分离的最佳酶解液组成为CPW溶液+3.0%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.3%半纤... 以沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus(Maxim.ex Kom.)Cheng f.)幼苗的子叶为材料,对其原生质体的分离、纯化和瞬时表达体系进行了研究。结果表明,子叶原生质体分离的最佳酶解液组成为CPW溶液+3.0%纤维素酶R-10+0.5%离析酶R-10+0.3%半纤维素酶+9.0%甘露醇(p H5.8);最佳酶解条件为室温、避光、40 r/min轻摇14 h。采用W5溶液作为漂洗液将酶解物稀释后进行过滤,将过滤液在4℃、700 r/min条件下离心5 min,所得纯化原生质体的产量约为2.50×106cells/g,活力达到90%;以纯化的原生质体作为受体,利用聚乙二醇(PEG)介导法成功将植物瞬时表达载体p BI-GFP导入其中,转化效率达到50.8%。利用本研究建立的原生质体瞬时表达体系,检测到沙冬青脱水应答转录因子Am DREB1定位于细胞核内。 展开更多

关键词 沙冬青 原生质体 瞬时表达 DREB转录因子 亚细胞定位

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匍匐翦股颖叶肉细胞原生质体瞬时表达体系的建立 被引量：2

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作者 李鑫 高佩然 +5 位作者 边秀举 王丽宏 李会彬 刘畅 董康挺 孙鑫博 《草地学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期2091-2097,共7页

为了建立稳定、高效的匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera L.)叶肉细胞原生质体瞬时表达体系,本研究以匍匐翦股颖‘Penn-A4’的叶片为材料,分析不同因素对其叶肉细胞原生质体分离的影响,确定其原生质体分离的最佳条件。结果表明:苗龄为4... 为了建立稳定、高效的匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera L.)叶肉细胞原生质体瞬时表达体系,本研究以匍匐翦股颖‘Penn-A4’的叶片为材料,分析不同因素对其叶肉细胞原生质体分离的影响,确定其原生质体分离的最佳条件。结果表明:苗龄为4周的翦股颖无菌苗叶片在甘露醇为0.6 mol·L^(-1)的酶解液中,28℃酶解4 h后,可分离得到较高活力原生质体、提取量约为6.75×106个·g^(-1);为进一步检测该原生质体是否可有效的应用在蛋白功能研究中,构建了热激蛋白基因AsHSP26.8-GFP重组质粒,并在聚乙二醇(PEG-4000)介导下将其导入叶肉细胞原生质体中进行了亚细胞定位;通过激光共聚焦显微镜观察到AsHSP26.8定位于叶绿体。综上所述,本研究建立了一套较为完整的匍匐翦股颖叶肉细胞原生质体分离与瞬时表达体系,为探究匍匐翦股颖的功能基因组学研究奠定了基础。 展开更多

关键词 匍匐翦股颖 原生质体 瞬时表达 亚细胞定位

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浮萍原生质体瞬时表达体系的建立及其应用研究 被引量：1

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作者 宋乐元 方扬 +2 位作者 田润 杜安平 王海燕 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第8期1792-1798,共7页

【目的】建立浮萍原生质体瞬时表达体系,以加快浮萍生物反应器工程的开发进程。【方法】采用酶解法制备浮萍原生质体,通过对愈伤组织类型、渗透压、预处理方法等一系列参数的优化调整,建立了浮萍原生质体制备方法。利用农杆菌介导外源... 【目的】建立浮萍原生质体瞬时表达体系,以加快浮萍生物反应器工程的开发进程。【方法】采用酶解法制备浮萍原生质体,通过对愈伤组织类型、渗透压、预处理方法等一系列参数的优化调整,建立了浮萍原生质体制备方法。利用农杆菌介导外源基因进入浮萍愈伤组织,并制备原生质体观察瞬时表达情况,通过对农杆菌种类、菌浓度、乙酰丁香酮浓度及共培养时间等参数进行调整,筛选最佳的浸染条件。最后利用该瞬时表达体系进行亚细胞定位研究和启动子功能验证。【结果】原生质体制备的最佳条件为:以4℃过夜培养的浮萍悬浮培养愈伤组织为制备材料,用酶液(2%纤维素酶、0.5%离析酶、0.5%果胶酶、0.1 mol/L CaCl2、0.2 mol/L KCl、1%BSA、20 mmol/L MES pH 5.8、0.5 mol/L甘露醇)于25℃避光消化16 h(40 r/min);农杆菌浸染最佳条件为:农杆菌GV301在菌浓度(OD600)为1、乙酰丁香酮浓度为100μmol/L时,浸染悬浮培养愈伤有最大转化率。【结论】成功建立了浮萍原生质体瞬时表达体系,并证明其可用于亚细胞定位和启动子功能验证等方面的研究。 展开更多

关键词 浮萍Lemna gibba 原生质体 瞬时表达体系 亚细胞定位 启动子功能

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GUS基因在烟草原生质体中的瞬时表达 被引量：3

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作者 王业 陈一明 +2 位作者 李良才 裴美云 邱并生 《甘肃科学（甘肃科学院学报）》 1989年第1期32-36,共5页

β—G1ucuronidase(GUS)基因是从大肠杆菌得到的。GUS系统是一种优良的reporter基因系统,可用于外源基因导入受体的检测手段。我们用PEG法将构建在pBI121上的GUS基因导入烟草原生质体,获得了瞬时表达。

关键词 GUS基因 烟草 原生质体 瞬时表达

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利用R基因RRS1/RPS4探索水稻原生质体瞬时表达转化体系的研究 被引量：6

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作者 李丽 赵彦丰 +1 位作者 吴琪琦 黄燕 《四川农业大学学报》 CSCD 北大核心 2021年第3期297-306,315,共11页

【目的】将拟南芥TNL型R基因RRS1/RPS4转入水稻原生质体中,探索瞬时表达转化体系的最佳条件,并分析AtRRS1/AtRPS4对水稻内源ETI下游抗病基因表达的影响,为揭示水稻EDS1是否参与ETI反应途径提供实验依据。【方法】以日本晴两叶一心期幼... 【目的】将拟南芥TNL型R基因RRS1/RPS4转入水稻原生质体中,探索瞬时表达转化体系的最佳条件,并分析AtRRS1/AtRPS4对水稻内源ETI下游抗病基因表达的影响,为揭示水稻EDS1是否参与ETI反应途径提供实验依据。【方法】以日本晴两叶一心期幼苗为植物材料,设计不同梯度的PEG浓度(30%、35%、40%)、转化时的质粒浓度(0.5、1、2μg/μL)以及PEG介导的转化温度(0、18、37℃),利用Box-Benhnken设计三因素三水平来分析不同参数组合条件下对转化效果的影响,并对原生质体转化效率进行预测和试验验证。随后,利用该瞬时系统表达拟南芥TNL型R基因RRS1/RPS4,并通过检测水稻内源抗病标志基因的表达水平来揭示其对水稻抗病能力的影响。【结果】经过试验验证得到水稻原生质体转化最佳条件:PEG浓度36.16%、质粒浓度1.72μg/μL、转化温度37℃,该组合条件下转化效率可达75%;利用该优化体系开展的瞬转研究发现拟南芥TNL型R基因/基因对RRS1/RPS4能显著提高水稻原生质体中抗病相关基因的表达。【结论】构建了高效的水稻原生质体瞬时转化系统,并以此为平台,研究揭示了拟南芥TNL型R基因RRS1/RPS4可能通过水稻内源的EDS1去诱导ETI下游抗病免疫反应的发生。 展开更多

关键词 水稻 原生质体 瞬时表达 R基因 转化体系

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葡萄原生质体分离及瞬时转化体系的建立 被引量：23

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作者 舒小娟 温腾建 +2 位作者 邢佳毅 卢龙 胡建芳 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期1262-1268,共7页

为了建立葡萄原生质体进行遗传转化的技术,该研究以葡萄品种‘黑香蕉’的叶片和愈伤组织为材料,分析纤维素酶和离析酶的浓度与配比、渗透压和酶解时间等主要因素对葡萄原生质体分离的影响,探讨建立稳定、高效的葡萄原生质体分离与瞬时... 为了建立葡萄原生质体进行遗传转化的技术,该研究以葡萄品种‘黑香蕉’的叶片和愈伤组织为材料,分析纤维素酶和离析酶的浓度与配比、渗透压和酶解时间等主要因素对葡萄原生质体分离的影响,探讨建立稳定、高效的葡萄原生质体分离与瞬时转化体系,为鉴定目标基因的功能奠定基础。结果表明:(1)葡萄叶片原生质体的分离以3.0%纤维素酶和0.75%离析酶的酶组合,在0.6mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为4.09×106个原生质体,活力为83.12%。(2)葡萄愈伤组织原生质体的分离以2.0%纤维素酶和0.5%离析酶的酶组合,在0.5mol/L甘露醇溶液中,酶解14h为宜,每克游离产量为6.05×106个原生质体,活力为84.13%。(3)利用该方法得到的葡萄原生质体为受体,采用40%PEG-4000介导转化质粒载体pEZS-NL,目标基因瞬时表达产物检测表明,GFP蛋白表达稳定、清晰。该研究建立的葡萄原生质体制备和转化体系,可以用较少量的质粒DNA获得外源基因在原生质体内的表达,为葡萄功能基因的研究提供技术支持。 展开更多

关键词 葡萄 原生质体 叶片 愈伤组织 遗传转化 瞬时表达

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