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PLZF的克隆及其对犏牛未分化精原细胞的增殖作用
1
作者 张鹏 王明秀 +4 位作者 敬科民 李雨谦 田园 钟金城 蔡欣 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期390-402,共13页
【目的】犏牛作为牦牛与黄牛的种间杂交产物,具有优良的生产性能,但其杂种优势的进一步应用却受限于犏牛雄性不育。通过克隆犏牛PLZF,明确其在犏牛和牦牛睾丸组织和未分化精原细胞中的差异表达,并进一步揭示过表达该基因对犏牛未分化精... 【目的】犏牛作为牦牛与黄牛的种间杂交产物,具有优良的生产性能,但其杂种优势的进一步应用却受限于犏牛雄性不育。通过克隆犏牛PLZF,明确其在犏牛和牦牛睾丸组织和未分化精原细胞中的差异表达,并进一步揭示过表达该基因对犏牛未分化精原细胞活性的影响。为阐明犏牛生精停滞的作用机制提供理论基础。【方法】以24月龄公麦洼牦牛和F1代公犏牛为实验动物,通过RT-PCR法克隆得到了犏牛PLZF的CDS序列,并进行了生物信息学分析;通过RT-qPCR法分析PLZF在犏牛和牦牛睾丸组织中的差异表达;采用同源重组的方法构建了PLZF的表达载体,并利用RT-qPCR检测了PLZF过表达效率及其下游靶基因的表达;通过PDT、CCK-8、EdU和免疫荧光检测了过表达PLZF对犏牛未分化精原细胞增殖活性的影响。【结果】克隆获得了犏牛PLZF的CDS区,并通过生物信息学分析发现该基因编码的蛋白序列不包含跨膜结构域和信号肽序列,其三级结构以α螺旋和无规卷曲为主。系统进化树分析表明犏牛PLZF与黄牛PLZF的亲缘关系更近。三级结构预测发现,虽然犏牛、牦牛和黄牛的PLZF蛋白三级结构高度相似,但牦牛PLZF蛋白在531—540位氨基酸处与犏牛和黄牛有较大差异。RT-qPCR发现,PLZF在犏牛睾丸组织和未分化精原细胞中的表达均显著低于牦牛(P<0.05),而在犏牛未分化精原细胞中过表达PLZF后,该基因的表达上调了13.8倍(P<0.01),且能显著增加犏牛未分化精原细胞的增殖活性(P<0.05),表明PLZF表达下调影响了犏牛未分化精原细胞增殖活性。此外,过表达PLZF后,犏牛未分化精原细胞中与增殖相关的基因(Etv5、Bcl6b、Pcna和c-fos)全部显著上调(P<0.05),与分化相关的基因(Stra8、Kit、Dmrt1和Sohlh2)全部显著下调(P<0.05),表明PLZF通过上调增殖相关基因、下调分化相关基因的表达促进犏牛未分化精原细胞增殖。【结论】PLZF在犏牛未分化精原细胞中表达异常降低了犏牛未分化精原细胞增殖活性,导致其数量减少,影响了犏牛的精子发生。本试验为进一步阐明犏牛生精停滞的作用机制提供了理论基础,并为解决犏牛雄性不育问题提供了新的思路。 展开更多
关键词 犏牛 PLZF 未分化精原细胞 增殖
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FGFs/FGFRs及其介导信号通路基因的异常表达影响犏牛未分化精原细胞增殖活性 被引量：2
2
作者 张鹏 王明秀 +7 位作者 敬科民 彭巍 田园 李雨谦 付长其 舒适 钟金城 蔡欣 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期2886-2897,共12页
旨在研究FGFs(fibroblast growth factors)/FGFRs(fibroblast growth factor receptors)及其介导的Ras和MAPK信号通路基因在牦牛和犏牛未分化精原细胞的差异表达,以探讨犏牛生精停滞的原因。本研究采集健康的24月龄3头公麦洼牦牛和3头F... 旨在研究FGFs(fibroblast growth factors)/FGFRs(fibroblast growth factor receptors)及其介导的Ras和MAPK信号通路基因在牦牛和犏牛未分化精原细胞的差异表达,以探讨犏牛生精停滞的原因。本研究采集健康的24月龄3头公麦洼牦牛和3头F1代公犏牛的睾丸组织,分为牦牛和犏牛两个样品组,每组3个生物学重复。采用HE染色检测牦牛和犏牛精子发生的差异;采用细胞群体倍增时间、CCK-8和EDU染色检测牦牛和犏牛未分化精原细胞增殖能力的差异;采用荧光定量PCR检测6种FGF家族成员、3种FGFR、FGFs/FGFRs介导的Ras和MAPK信号通路基因在牦牛和犏牛未分化精原细胞中的差异表达。与牦牛相比,犏牛生精小管发育异常,生殖细胞类型单一,未分化精原细胞增殖活性显著低于牦牛(P<0.05)。FGF2、FGF4、FGF5、FGF8、FGF9和FGF21在犏牛睾丸组织及FGFs受体FGFR1、FGFR2和FGFR3在犏牛未分化精原细胞的表达都显著低于牦牛(P<0.01)。FGFs/FGFRs介导Ras信号通路基因中,除HRas和ARaf以外,其余基因(Raf1、BRaf、MEK1和ERK)都是在犏牛未分化精原细胞中以更低的水平表达(P<0.01)。FGFs/FGFRs介导MAPK信号通路基因中,p38、MEKK3、MEKK6和ASK1也是在犏牛未分化精原细胞中低表达(P<0.01)。受Ras通路调控的与细胞增殖相关的基因中,只有SHISA6、ID4在犏牛未分化精原细胞中高表达(P<0.01),其余基因(TAF4B、Etv4、GFRα1和Ret)都是在牦牛未分化精原细胞中表达量高(P<0.01)。受Ras和MAPK通路共同调控的与细胞增殖相关的基因中,ETV5和BCL6B都是在牦牛未分化精原细胞中高表达(P<0.01)。受Ras通路调控的与细胞分化相关的基因中,除PIWIL4外,SOX3、NGN3和Stra8都在牦牛未分化精原细胞中高表达(P<0.01)。因此FGFs/FGFRs及其介导的Ras和MAPK通路基因在犏牛未分化精原细胞中的异常表达,降低了未分化精原细胞增殖活性,导致了犏牛没有足够数量的未分化精原细胞进入分化阶段。这可能是犏牛生精停滞的重要原因之一。 展开更多
关键词 成纤维细胞生长因子 未分化精原细胞 信号通路 细胞增殖 犏牛 牦牛
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锁阳对少、弱精子症大鼠模型精子数量、活动率和血清睾酮影响及促进未分化精原细胞增殖的实验研究 被引量：18
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作者 曹义娟 厉振北 +7 位作者 祁玉娟 刘颖 顾娟 胡方方 张文达 郝林 侯建全 韩从辉 《中华男科学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1116-1121,共6页
目的:探究锁阳对少、弱精子症大鼠睾丸重量、血清睾酮浓度、以及精子数量、活动率等精子参数的影响,及促进未分化精原细胞增殖的机制,为开发新的治疗男性少、弱精子症的中药提供实验和理论依据。方法:选取8周龄,体重约(220±10)g的S... 目的:探究锁阳对少、弱精子症大鼠睾丸重量、血清睾酮浓度、以及精子数量、活动率等精子参数的影响,及促进未分化精原细胞增殖的机制,为开发新的治疗男性少、弱精子症的中药提供实验和理论依据。方法:选取8周龄,体重约(220±10)g的SD大鼠30只,随机分为5组(n=6):空白对照组、模型对照组、3组实验组(低、中、高锁阳浓度剂量);将模型对照组与锁阳实验组予以环磷酰胺[30 mg/(kg·d)]腹腔注射,连续5 d,构建大鼠少、弱精子症模型;将3组实验组分别用低浓度[0.5 g/(kg·d)]、中浓度[1 g/(kg·d)]及高浓度[2 g/(kg·d)]锁阳水煎液灌胃,每天1次,连续4周后观察各组精子数量、活动率,测量各组大鼠血清睾酮浓度,并取各组大鼠睾丸称重;采用Real-time PCR方法检测低浓度组睾丸组织中精原干细胞标志物(Oct4、Thy1、PLZF、C-kit)表达情况,采用β-actin作为内参;采用Real-time PCR方法检测低浓度组睾丸组织中胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达情况。结果:空白对照组、模型对照组及低、中、高浓度锁阳实验组的大鼠睾丸重量分别为(1.52±0.06)g、(1.55±0.06)g、(1.34±0.04)g、(1.35±0.40)g、(1.43±0.30)g,不同浓度锁阳实验组大鼠睾丸重量与空白对照组、模型对照组比较未见明显差异(P>0.05)。空白对照组、模型对照组及低、中、高浓度实验组在每10个高倍镜视野精子数(精子数/10HP)分别为200±15、134±30、216±25、196±5、202±20个,锁阳实验组与模型对照组比较可显著提高大鼠的精子数量(P<0.05);低浓度锁阳水提物组睾丸组织中Oct4、Thy1、PLZF、GDNF基因mRNA表达水平较模型对照组增加,差异有统计学意义(P<0.05),C-kit基因mRNA表达水平未见明显差异(P<0.05);空白对照组、模型对照组及低、中、高浓度锁阳实验组的大鼠每10个高倍镜视野精子活动率(精子活动率/10HP)分别为(52.1±5.5)%、(38.1±2.5)%、(49.6±1.0)%、(58.7±9.5)%、(59.1±9.5)%;大鼠血清睾酮浓度分别为(190.0±87.5)、(82.5±25.8)、(185.0±82.4)、(331.0±86.7)、(229.0±75.6)mmol/L,锁阳实验组与模型对照组比较可显著提高大鼠的精子活动率及血清睾酮浓度(P均<0.05),但与空白对照组比较无明显差异(P>0.05)。结论:锁阳能显著提高少、弱精子症大鼠的精子数量、精子活动能力、血清睾酮水平,其改善机制可能是:1通过诱导睾丸Sertoli细胞中GDNF表达,促进未分化精原细胞增殖,从而促进精子发生过程,增加附睾尾部精子数目;2通过促进睾酮分泌,提高血清睾酮水平,进而改善精子活动率。 展开更多
关键词 锁阳水煎液 少、弱精子症 精子活动率 精子数量 血清睾酮 未分化精原细胞 胶质细胞源性神经营养因子
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