运用实时荧光RT-PCR技术检测柑橘碎叶病毒 被引量：11

1

作者 刘科宏 周常勇 +3 位作者 宋震 周彦 李中安 唐科志 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期748-751,共4页

柑橘碎叶病是由橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)引起的一种重要的柑橘病害,为更快、更准确的检测CTLV,合成了一对特异性引物ASG-Pf和ASG-Pr,建立了运用SYBRGreenI荧光染料法检测CTLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异... 柑橘碎叶病是由橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)引起的一种重要的柑橘病害,为更快、更准确的检测CTLV,合成了一对特异性引物ASG-Pf和ASG-Pr,建立了运用SYBRGreenI荧光染料法检测CTLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明,该检测体系能特异的检出CTLV,对测试的衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒和鳞皮病毒都不能检出;灵敏度比常规PCR高100倍;适用性广,可检测出多种柑橘类植物中的CTLV。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理,且SYBR GreenI荧光染料成本较低,适用于检测柑橘体内含量较低的CTLV病毒。 展开更多

关键词 柑橘碎叶病毒(ctlv) 实时荧光RT—PCR 检测

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柑橘碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析 被引量：8

2

作者 宋震 刘科宏 +3 位作者 杨方云 唐科志 李中安 周常勇 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期3741-3748,共8页

【目的】了解中国CTLV分离物外壳蛋白(CP)基因的变异情况。【方法】对来源于中国不同地区、不同寄主品种的18个柑橘碎叶病毒(CTLV)分离物进行RT-PCR、克隆、测序,应用DNAMAN软件进行序列分析。【结果】18个分离物的CP基因全长714nt,推导... 【目的】了解中国CTLV分离物外壳蛋白(CP)基因的变异情况。【方法】对来源于中国不同地区、不同寄主品种的18个柑橘碎叶病毒(CTLV)分离物进行RT-PCR、克隆、测序,应用DNAMAN软件进行序列分析。【结果】18个分离物的CP基因全长714nt,推导的CP含237个氨基酸。CP核苷酸序列及推导的氨基酸序列最大相似性分别为88.5%～99.9%和91.1%～99.6%。与核苷酸序列G289→A或C、A409→C和G414→T的单碱基突变相对应,CTLV外壳蛋白第97、137、138位氨基酸在强、弱毒分离物之间存在差异,多数弱毒分离物为Q97或K97、Q137、H138,而多数强毒分离物为E97、R137或K137、Q138。在根据CP氨基酸序列构建的系统进化树上,本研究获得的18个CTLV分离物至少可以划分为2个组群,其中,在指示植物上表现较弱症状的多数(4/6)CTLV分离物划分在第Ⅰ组群,多数(10/12)CTLV强毒分离物划分在第Ⅱ组群。【结论】CTLV外壳蛋白基因相对保守,其第289、409、414位碱基在强、弱毒分离物之间存在差异,可能与病毒致病性相关。 展开更多

关键词 柑橘碎叶病毒 ctlv 外壳蛋白基因 克隆 序列分析

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柑橘碎叶病毒巢式RT-PCR检测方法建立及应用 被引量：11

3

作者 宋震 周常勇 +1 位作者 刘科宏 李中安 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期458-462,共5页

柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)是威胁柑橘生产的重要病原之一。本研究在柑橘碎叶病毒一步法RT-PCR检测体系的基础上建立了CTLV的巢式RT-PCR检测方法,并对其检测灵敏度及特异性进行了分析。结果表明,该方法检测灵敏度比... 柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)是威胁柑橘生产的重要病原之一。本研究在柑橘碎叶病毒一步法RT-PCR检测体系的基础上建立了CTLV的巢式RT-PCR检测方法,并对其检测灵敏度及特异性进行了分析。结果表明,该方法检测灵敏度比一步法RT-PCR至少提高100倍,检测模板总核酸的最低浓度约1.27μg·L-1,具有良好的特异性。在对142个田间样品、24个茎尖苗及20个接毒的腊斯克枳橙的检测中,巢式RT-PCR的CTLV检出率最高,为21.5%,比半巢式RT-PCR检出率高3.2%,比一步法RT-PCR检出率高2.1%。该方法灵敏度高,特异性强,适用于对无病毒苗木生产的监控和田间样品的快速检测。 展开更多

关键词 柑橘碎叶病毒 巢式RT-PCR 检测技术

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柑橘碎叶病毒研究进展 被引量：9

4

作者 孙现超 周常勇 +1 位作者 青玲 杨水英 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期213-216,共4页

起源于我国的柑橘碎叶病是严重危害柑橘的一种重要柑橘病毒病,国内外关于柑橘碎叶病毒的研究对于控制该病害起到了重要的作用。概述了国内外关于柑橘碎叶病毒的生物学、分子生物学、病毒的株系和控制方面的研究进展,尤其是对近些年用分... 起源于我国的柑橘碎叶病是严重危害柑橘的一种重要柑橘病毒病,国内外关于柑橘碎叶病毒的研究对于控制该病害起到了重要的作用。概述了国内外关于柑橘碎叶病毒的生物学、分子生物学、病毒的株系和控制方面的研究进展,尤其是对近些年用分子生物学方法研究病毒的基因组和株系序列差异方面的情况作了详细的介绍。并对柑橘碎叶病毒研究仍未解决的问题和进一步深入研究的内容进行了分析探讨。 展开更多

关键词 柑橘碎叶病毒 生物学 分子生物学 株系 控制

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柑橘碎叶病毒外壳蛋白基因的原核表达 被引量：3

5

作者 段硕 李敏 +3 位作者 陶珍珍 宋震 李中安 周常勇 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期744-747,共4页

【目的】获得原核表达的柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)的外壳蛋白(Coat protein,CP)。【方法】以感染CTLV的柑橘叶片总RNA为模板,根据已报道CTLV设计引物,运用一步法RT-PCR对CTLV的CP进行扩增并克隆,并将CP克隆至表达载... 【目的】获得原核表达的柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)的外壳蛋白(Coat protein,CP)。【方法】以感染CTLV的柑橘叶片总RNA为模板,根据已报道CTLV设计引物,运用一步法RT-PCR对CTLV的CP进行扩增并克隆,并将CP克隆至表达载体pET28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得表达蛋白。【结果】扩增测序结果显示,克隆产物CP区域序列全长714 bp,与已报道CP核苷酸序列(GenBank序列号:FJ223212)相似性达100%,推测编码238个氨基酸,表达蛋白的大小约27 kD。重组质粒经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析结果显示,重组质粒高效表达约30 kD蛋白,酶联免疫吸附(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)检测结果表明,该蛋白稀释5000倍仍能与苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)抗体发生阳性反应,证实表达蛋白为CTLV的CP。【结论】克隆了CTLV的CP,通过原核表达系统高效表达了CTLV的CP,为制备CTLV抗体奠定了基础。 展开更多

关键词 柑橘碎叶病毒 CP 原核表达 蛋白纯化

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8种柑橘类植物对柑橘碎叶病毒分子组成的影响 被引量：1

6

作者 刘科宏 宋震 +2 位作者 周彦 李中安 周常勇 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期90-93,共4页

探究不同柑橘类型对柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)变异的影响,为研究寄主-CTLV的互作关系提供基础。将CTLV分离株HH和XLB分别嫁接接种于8种柑橘类植物,对CTLV分离株和获得的亚分离株样品进行CP基因的限制性长度多态性(RF... 探究不同柑橘类型对柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)变异的影响,为研究寄主-CTLV的互作关系提供基础。将CTLV分离株HH和XLB分别嫁接接种于8种柑橘类植物,对CTLV分离株和获得的亚分离株样品进行CP基因的限制性长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)分析,以及序列比较。结果表明HH和XLB与其各自在不同柑橘植株上的亚分离株的CP/Hinf I RFLP酶切图谱无明显差异;混合侵染的CTLV分离株HH和其亚分离株之间的SSCP谱型存在差异,株系构成单一的CTLV分离株XLB与其亚分离株间的SSCP谱型差异不明显。通过序列分析进一步证实CTLV在不同寄主上其CP基因有几个核苷酸位点发生了变异。CTLV可能受寄主植物的影响发生了变异。 展开更多

关键词 柑橘 柑橘碎叶病毒 CP基因

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柑橘衰退病、裂皮病和碎叶病的多重RT-PCR检测方法研究 被引量：13

7

作者 肖远辉 曾继吾 +1 位作者 张秋明 周碧容 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期31-35,共5页

本研究以广东省农业科学院果树研究所隔离网室内通过嫁接分别感染CTV、CEVd和CTLV的柑橘树皮为实验材料,建立了以oligo(dT)为反转录引物的RT-PCR检测体系,成功检测到在病毒RNA 3′末端带有ploy_(A)加尾的CTV和CTLV。实验过程中,发现不具... 本研究以广东省农业科学院果树研究所隔离网室内通过嫁接分别感染CTV、CEVd和CTLV的柑橘树皮为实验材料,建立了以oligo(dT)为反转录引物的RT-PCR检测体系,成功检测到在病毒RNA 3′末端带有ploy_(A)加尾的CTV和CTLV。实验过程中,发现不具有ploy_(A)加尾的环状类病毒CEVd,同样可以用oligo(dT)反转录的RT-PCR检测出来,通过测序分析,其同源性在96%以上,并发现在CEVd序列中有一个富含A的区段。在此基础上,进一步研究了同时检测CTV、CEVd和CTLV的多重RT-PCR检测体系,该方法能为这3种病害的检测简化步骤、节省时间、降低成本。 展开更多

关键词 柑橘衰退病毒(CTV) 柑橘裂皮病类病毒(CEVd) 柑橘碎叶病毒(ctlv) 多重RT—PCR oligo(dT)18

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砂糖橘上碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析 被引量：4

8

作者 孟祥春 向旭 +2 位作者 钟云 刘岩 易干军 《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期796-798,共3页

利用RT-PCR技术对广东砂糖橘碎叶病毒的外壳蛋白(CTLV-CP)基因进行了克隆和测序分析。DNA序列分析表明,砂糖橘CTLV-CP基因的cDNA序列全长为786bp,编码262个氨基酸。BLAST分析结果显示,所得序列与苹果、梨茎沟病毒(ASGV)外壳蛋白基因及... 利用RT-PCR技术对广东砂糖橘碎叶病毒的外壳蛋白(CTLV-CP)基因进行了克隆和测序分析。DNA序列分析表明,砂糖橘CTLV-CP基因的cDNA序列全长为786bp,编码262个氨基酸。BLAST分析结果显示,所得序列与苹果、梨茎沟病毒(ASGV)外壳蛋白基因及其它柑橘CTLV-CP基因的同源性在87%～91%,证明所克隆的片段为CTLV-CP基因。 展开更多

关键词 砂糖橘 碎叶病毒(ctlv) 外壳蛋白(CP) 克隆

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利用RT-PCR检测柑桔碎叶病毒的研究 被引量：3

9

作者 唐科志 周常勇 +3 位作者 王雪峰 周彦 刘科宏 刘英 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第S1期118-119,共2页

柑桔碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV) 的传统检测方法是指示植物测定,该方法检测周期较长,且需要温、网室等配套设施;酶联免疫吸附方法(ELISA)可用于检测CTLV,但使用的是针对苹果茎沟病毒(ASGV)的抗体,虽然CTLV和AS- GV的亲缘... 柑桔碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV) 的传统检测方法是指示植物测定,该方法检测周期较长,且需要温、网室等配套设施;酶联免疫吸附方法(ELISA)可用于检测CTLV,但使用的是针对苹果茎沟病毒(ASGV)的抗体,虽然CTLV和AS- GV的亲缘关系已经得到证实,但到目前为止没有对中国的分离株进行实验验证,这在一定程度上影响了结果的可靠性。本研究应用Halistones 等建立的半巢式RT-PCR技术对已感病柑桔品种进行了周年检测,现将研究结果报道如下。 展开更多

关键词 ctlv 指示植物 巢式 柑桔碎叶病毒 RT-PCR PCR

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脱除茂谷柑碎叶病毒、天草衰退病毒的试验报告 被引量：2

10

作者 赵小龙 张社南 刘升球 《浙江柑橘》 2006年第3期19-20,共2页

我所于1998～2000年从浙江引进天草、从台湾引进茂谷柑，经指示植物鉴定，发现天草带有柑橘衰退病毒强毒系，茂谷柑带有柑橘碎叶病毒，并对其进行了茎尖嫁接，热处理、热处理＋茎尖嫁接脱毒试验，兹将试验结果报告如下。

关键词 柑橘衰退病毒 试验报告 碎叶病毒 茂谷柑 天草 脱除 茎尖嫁接 植物鉴定

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苹果茎沟病毒柑橘碎叶株系的分布与序列分析

11

作者 高海馨 陈香玲 +3 位作者 乔兴华 廖慧红 周常勇 周彦 《植物保护学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期1318-1326,共9页

为明确苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)柑橘碎叶株系(citrus tatter leaf virus,CTLV)在中国柑橘产区的发生分布及其分子特性,于2017—2021年对我国12个柑橘主产区开展系统调查,并采用多重比对以及系统发育分析法对CTLV... 为明确苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus,ASGV)柑橘碎叶株系(citrus tatter leaf virus,CTLV)在中国柑橘产区的发生分布及其分子特性,于2017—2021年对我国12个柑橘主产区开展系统调查,并采用多重比对以及系统发育分析法对CTLV的全序列进行分析。结果表明,从12个柑橘主产区采集的2012份疑似样品中检测出413份感CTLV阳性样品。除陕西省外,其余11个柑橘主产区样品中均检测出CTLV,并且柚类样品中CTLV的检出率最高,达到32.31%。对分离获得的22株CTLV毒株和已知的7株CTLV以及5株ASGV毒株进行全序列分析,发现所有34株毒株的核苷酸序列相似性为78.6%~99.8%,且CTLV序列的保守性较高。此外,与其他4株ASGV毒株相比,本研究中22株CTLV毒株与ASGV-MK毒株(GenBank登录号为MZ127820.1)具有更近的亲缘关系。推测CTLV中国毒株间的亲缘关系可能与其采样地和寄主品种有关。 展开更多

关键词 苹果茎沟病毒 柑橘碎叶株系 检测 序列分析 系统进化分析

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中国柑橘叶斑驳病毒和碎叶病毒发生状况及其分子特性研究 被引量：11

12

作者 项周 程桥 +2 位作者 谢宗周 王国平 洪霓 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期113-119,共7页

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)和柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)均可侵染柑橘的不同种。为明确CLBV及CTLV在中国柑橘上的发生状况和分子特性,采用RT-PCR技术对来源于中国7个省的342份和346份柑橘样品进... 柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)和柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)均可侵染柑橘的不同种。为明确CLBV及CTLV在中国柑橘上的发生状况和分子特性,采用RT-PCR技术对来源于中国7个省的342份和346份柑橘样品进行检测,检出率分别为9.6%和11.0%。对14个CLBV分离物和15个CTLV分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因部分序列分析显示,CLBV分离物间cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为82.1%~100%和88.1%~100%,CTLV分离物的cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~100%和92.5%~100%。测定的14个CLBV分离物在系统进化树中聚为2个组;而CTLV分离物分组不明显,该病毒的系统进化与寄主来源无明显关系。 展开更多

关键词 柑橘叶斑驳病毒 柑橘碎叶病毒 检测 系统进化分析

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柑橘4种病毒多重PCR检测技术的建立及应用 被引量：15

13

作者 黄爱军 王莹 +2 位作者 丁敏 卢占军 易龙 《园艺学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1616-1622,共7页

柑橘衰退病毒(CTV)、柑橘碎叶病毒(CTLV)、柑橘黄化脉明病毒(CYVCV)和柑橘叶斑驳病毒(CLBV)是影响柑橘生产的重要病毒性病害,建立快速、准确的检测方法是防控该病害的基础。本研究通过筛选针对4种病毒基因组保守区域设计的特异性引物,... 柑橘衰退病毒(CTV)、柑橘碎叶病毒(CTLV)、柑橘黄化脉明病毒(CYVCV)和柑橘叶斑驳病毒(CLBV)是影响柑橘生产的重要病毒性病害,建立快速、准确的检测方法是防控该病害的基础。本研究通过筛选针对4种病毒基因组保守区域设计的特异性引物,优化影响多重RT-PCR扩增的引物浓度、退火温度,建立了可同时扩增4种病毒的多重RT-PCR检测体系。该检测体系扩增的特异片段大小分别是CTLV 889 bp、CYVCV 612 bp、CTV 462 bp和CLBV 294 bp,扩增产物清晰,特异,检测灵敏度较普通单重RT-PCR灵敏度低约10倍。采用多重RT-PCR和单重RT-PCR对收集到的59份田间样品分别进行检测,结果显示2种方法检测结果一致,4种病毒的检出率在11.9%~54.2%之间。建立的多重RT-PCR方法可准确、快速、灵敏地检测单一或复合侵染的4种柑橘病毒。 展开更多

关键词 柑橘 柑橘衰退病毒 柑橘碎叶病毒 柑橘黄化脉明病毒 柑橘叶斑驳病毒 多重PCR

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《果树学报》2009年第26卷总目次

14

《果树学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期926-933,共8页

关键词 ping 果树学报 新品种选育 中国野生葡萄 SRAP ISSR 梨种质资源 柑橘碎叶病毒 AFLP 甜樱桃 JUN 研究进展 果实品质 嘎拉苹果 采后生理 吕德 遗传多样性分析 目次

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应用多重PCR技术同步检测柑橘4种重要嫁接传播病原(英文) 被引量：3

15

作者 刘金香 周常勇 +4 位作者 唐科志 李玲娣 刘科宏 田晓 李中安 《植物病理学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期295-301,共7页

柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV),柑橘碎叶病毒(Citrus tatter-leaf virus,CTLV),柑橘裂皮病类病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)和柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)亚洲种病原(Candidatus liberobacter asiaticus)是重要的柑... 柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV),柑橘碎叶病毒(Citrus tatter-leaf virus,CTLV),柑橘裂皮病类病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)和柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)亚洲种病原(Candidatus liberobacter asiaticus)是重要的柑橘嫁接传播病原。本文建立了同时检测HLB病菌、CTV、CEVd和CTLV 4种柑橘嫁接病原的一步法、双温多重PCR检测技术体系,同时在体系中设置内参基因。应用该体系快速评价了4种嫁接传播病原在田问侵染情况,结果表明28个田间样品CTV、CEVd、CTLV和HLB感染率分别为89.3%、17.9%、10.7%和28.6%,接近半数样品为混合感染。并且将该方法应用于快速评价茎尖嫁接苗病毒的脱除情况。 展开更多

关键词 柑橘衰退病毒 柑橘碎叶病毒 柑橘裂皮病类病毒 柑橘黄龙病菌 多重PCR

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