目的克隆人核糖体蛋白S3a(Ribosomal protein S3a,RPS3a)基因,并表达、纯化其蛋白,分析RPS3a蛋白的细胞定位,为其功能研究奠定基础。方法应用RT-PCR从人胚肾HEK293细胞的总RNA中反转录并扩增出RPS3a基因,克隆到原核表达载体PET-21a中,...目的克隆人核糖体蛋白S3a(Ribosomal protein S3a,RPS3a)基因,并表达、纯化其蛋白,分析RPS3a蛋白的细胞定位,为其功能研究奠定基础。方法应用RT-PCR从人胚肾HEK293细胞的总RNA中反转录并扩增出RPS3a基因,克隆到原核表达载体PET-21a中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,PET21a-RPS3a融合表达载体在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中以可溶性蛋白的形式高效表达RPS3a蛋白,超声破碎细胞,通过Ni^(2+)-NTA亲和层析柱初步纯化,再应用50kD超滤膜进一步纯化。用Western Blot印迹实验检测纯化后的蛋白。构建绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)的pEGFP-N1-RPS3a表达载体,转染HEK293细胞,通过荧光显微镜观察RPS3a重组荧光蛋白在细胞内的分布。结果获得了较高纯度的RPS3a蛋白,亚细胞定位分析表明RPS3a蛋白主要分布于细胞质。结论成功克隆了RPS3a基因并表达纯化了其蛋白,确定其亚细胞分布,为进一步研究RPS3a蛋白的性质和功能奠定了基础。展开更多
目的采用RNA干扰技术沉默供体肝脏内核糖体蛋白S3(ribosomal protein S3,RPS3)基因的表达,观察其对核转录因子kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的影响以及对肝移植后早期缺血再灌注损伤的保护作用。方法构建以腺病毒(Ad)为载体的...目的采用RNA干扰技术沉默供体肝脏内核糖体蛋白S3(ribosomal protein S3,RPS3)基因的表达,观察其对核转录因子kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的影响以及对肝移植后早期缺血再灌注损伤的保护作用。方法构建以腺病毒(Ad)为载体的RPS3基因特异性短发夹RNA(shRNA)表达颗粒,按随机数字表法将实验大鼠分为3组:Ad-RPS3-shRNA组、空白腺病毒对照组(空白对照组)、生理盐水对照组(NS对照组)。于肝移植前48 h分别用Ad-RPS3-shRNA颗粒、空白腺病毒载体、生理盐水处理3组供体大鼠。收集血液及肝脏组织检测血清转氨酶、血浆炎症因子水平、肝脏组织病理改变、炎症因子mRNA、肝组织提取物中NF-κB活性和表达水平指标的变化。结果肝移植后恢复灌注3 h Ad-RPS3-shRNA组大鼠血清ALT水平(725.9±67.3)U/L、AST水平(863.7±72.7)U/L,血浆TNF-α水平(223.7±16.8)ng/L、IL-1β水平(242.5±18.7)ng/L、ICAM-1水平(258.4±24.9)ng/L,Suzuki评分(3.72±0.31),肝组织mRNA水平:TNF-α(0.252±0.026)、IL-1β(0.217±0.028)、ICAM-1(0.226±0.017)、RPS3(0.094±0.007),肝组织NF-κB蛋白水平(0.216±0.022)及其活性(92.4±9.5)均显著低于空白对照组和NS对照组(P<0.01),而空白对照组、NS对照组比较无统计学差异(P>0.05);恢复灌注12 h Ad-RPS3-shRNA组各检测指标与3 h变化趋势相同。结论沉默供体肝脏内RPS3基因可显著降低肝脏细胞NF-κB活性和表达量,从而降低炎症因子表达,有效减轻肝移植后早期缺血再灌注损伤。展开更多
文摘目的克隆人核糖体蛋白S3a(Ribosomal protein S3a,RPS3a)基因,并表达、纯化其蛋白,分析RPS3a蛋白的细胞定位,为其功能研究奠定基础。方法应用RT-PCR从人胚肾HEK293细胞的总RNA中反转录并扩增出RPS3a基因,克隆到原核表达载体PET-21a中,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)进行蛋白表达。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,PET21a-RPS3a融合表达载体在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中以可溶性蛋白的形式高效表达RPS3a蛋白,超声破碎细胞,通过Ni^(2+)-NTA亲和层析柱初步纯化,再应用50kD超滤膜进一步纯化。用Western Blot印迹实验检测纯化后的蛋白。构建绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)的pEGFP-N1-RPS3a表达载体,转染HEK293细胞,通过荧光显微镜观察RPS3a重组荧光蛋白在细胞内的分布。结果获得了较高纯度的RPS3a蛋白,亚细胞定位分析表明RPS3a蛋白主要分布于细胞质。结论成功克隆了RPS3a基因并表达纯化了其蛋白,确定其亚细胞分布,为进一步研究RPS3a蛋白的性质和功能奠定了基础。
文摘目的采用RNA干扰技术沉默供体肝脏内核糖体蛋白S3(ribosomal protein S3,RPS3)基因的表达,观察其对核转录因子kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的影响以及对肝移植后早期缺血再灌注损伤的保护作用。方法构建以腺病毒(Ad)为载体的RPS3基因特异性短发夹RNA(shRNA)表达颗粒,按随机数字表法将实验大鼠分为3组:Ad-RPS3-shRNA组、空白腺病毒对照组(空白对照组)、生理盐水对照组(NS对照组)。于肝移植前48 h分别用Ad-RPS3-shRNA颗粒、空白腺病毒载体、生理盐水处理3组供体大鼠。收集血液及肝脏组织检测血清转氨酶、血浆炎症因子水平、肝脏组织病理改变、炎症因子mRNA、肝组织提取物中NF-κB活性和表达水平指标的变化。结果肝移植后恢复灌注3 h Ad-RPS3-shRNA组大鼠血清ALT水平(725.9±67.3)U/L、AST水平(863.7±72.7)U/L,血浆TNF-α水平(223.7±16.8)ng/L、IL-1β水平(242.5±18.7)ng/L、ICAM-1水平(258.4±24.9)ng/L,Suzuki评分(3.72±0.31),肝组织mRNA水平:TNF-α(0.252±0.026)、IL-1β(0.217±0.028)、ICAM-1(0.226±0.017)、RPS3(0.094±0.007),肝组织NF-κB蛋白水平(0.216±0.022)及其活性(92.4±9.5)均显著低于空白对照组和NS对照组(P<0.01),而空白对照组、NS对照组比较无统计学差异(P>0.05);恢复灌注12 h Ad-RPS3-shRNA组各检测指标与3 h变化趋势相同。结论沉默供体肝脏内RPS3基因可显著降低肝脏细胞NF-κB活性和表达量,从而降低炎症因子表达,有效减轻肝移植后早期缺血再灌注损伤。
