牛结节性皮肤病病毒(NMG株)基因组DNA标准物质的研制 被引量：4

1

作者 苏佳 白洪旭 +5 位作者 赵炜 王德丽 刘伟洁 王芳 薛青红 陈晓春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期320-325,共6页

为提高牛结节性皮肤病病毒(LSDV)核酸检测结果的准确性,本研究通过病毒核酸提取及质量检测、分装,制备LSDV NMG株基因组DNA标准物质。通过荧光定量PCR(qPCR)检测外源病毒评价其纯净性;采用液滴式数字PCR(ddPCR)方法检测LSDV ORF101基因... 为提高牛结节性皮肤病病毒(LSDV)核酸检测结果的准确性,本研究通过病毒核酸提取及质量检测、分装,制备LSDV NMG株基因组DNA标准物质。通过荧光定量PCR(qPCR)检测外源病毒评价其纯净性;采用液滴式数字PCR(ddPCR)方法检测LSDV ORF101基因的拷贝数以评估该标准物质的均匀性、稳定性并与9家实验室协作标定;进一步采用qPCR方法对该标准物质试用。结果显示,本研究制备的标准物质不存在外源病毒污染;组内和组间无显著性差异,均匀性好;标准物质于-20℃稳定保存6个月,4℃稳定保存7d,25℃稳定保存24 h;标准物质ORF101基因最终定值为(8.6±1.3)×10~3拷贝/μL;可以用于qPCR检测。综上,该标准物质定值准确,均匀性好,不仅可以用于LSDV核酸检测相关实验的质量控制、仪器校准、检测方法评价,还可为研制体外诊断试剂提供物质基础。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 液滴式数字PCR 标准物质 定值

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牛结节性皮肤病病毒荧光定量PCR方法的建立与应用 被引量：1

2

作者 刘存 刘孟超 +6 位作者 张月 王晓玲 赵梦姣 李云岗 兰邹然 孙圣福 刘砚涵 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第2期146-150,共5页

为了建立牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的快速诊断方法,本试验依据LSDV GCPR基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速诊断LSDV的荧光定量PCR方法。结果表明,建立的LSDV荧光定量PCR方法在3.67×10^(1)~3.67×1... 为了建立牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的快速诊断方法,本试验依据LSDV GCPR基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速诊断LSDV的荧光定量PCR方法。结果表明,建立的LSDV荧光定量PCR方法在3.67×10^(1)~3.67×10^(7) copies/μL拷贝标准品间具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9905;该方法具有良好的敏感性,其检测病毒系列含量下限为3.67×10 copies/μL;该方法特异性良好,与山羊痘病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒等病毒不存在交叉反应;该方法重复性较好,批内和批间的变异系数均介于0.133%~1.81%。该方法,临床样品的检测符合率达90%。本试验所建立的LSDV荧光定量PCR方法为临床诊断牛结节性皮肤病提供了一种快速、灵敏的检测方法,为LSDV流行病学调查和监测提供了技术支持。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 荧光定量PCR GPCR基因 诊断

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牛结节性皮肤病病毒ORF123基因缺失重组病毒的构建及增殖能力分析

3

作者 王芳萍 任善会 +7 位作者 郜晓虹 杨雪 李积雲 王相伟 殷相平 孙跃峰 陈豪泰 万学瑞 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4530-4541,共12页

旨在通过缺失牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ORF123基因,分析其增殖能力,为LSDV ORF123功能研究奠定基础。本研究利用同源重组,以ORF123基因作为靶标,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记,采用融合PCR方法,扩增同源左右臂序列以及EGFP基因表... 旨在通过缺失牛结节性皮肤病病毒(LSDV)ORF123基因,分析其增殖能力,为LSDV ORF123功能研究奠定基础。本研究利用同源重组,以ORF123基因作为靶标,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为筛选标记,采用融合PCR方法,扩增同源左右臂序列以及EGFP基因表达框,克隆至pUC-19T载体,构建基因缺失转移载体pH5-LSDVΔORF123-EGFP质粒。然后将pH5-LSDVΔORF123-EGFP质粒转染至Vero细胞,并感染LSDV/CHA/FJ/2021毒株,利用蚀斑、梯度稀释和挑取绿色荧光单克隆细胞筛选纯化重组毒株,并鉴定其遗传稳定性和增殖能力。结果显示,利用EGFP筛选标记,通过多次挑斑筛选纯化获得ORF123基因缺失的重组病毒株LSDVΔORF123-EGFP。该重组病毒至少在8代细胞传代中能稳定表达绿色荧光蛋白,接种MDBK细胞后绘制一步增殖曲线表明该重组病毒滴度略低于亲本毒株。本研究成功获得ORF123基因缺失的重组病毒株LSDVΔORF123-EGFP,为LSDV ORF123蛋白生物学功能研究以及减毒活疫苗的研制奠定基础。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 ORF123基因 增殖能力 同源重组 重组病毒

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应用Cre-LoxP系统构建牛结节性皮肤病病毒缺失TK基因毒株

4

作者 张玉哲 任善会 +10 位作者 姚威 龚真莉 张红强 柳民意 尤婷 王相伟 李积雲 殷相平 孙跃峰 陈豪泰 万学瑞 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4517-4529,共13页

利用同源重组技术及Cre-LoxP系统平台,构建牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)缺失TK基因毒株,为研制出安全、高效的LSDV基因工程疫苗提供备选毒株。以TK基因为靶基因,利用Cre-LoxP系统平台,红色荧光蛋白(RFP)为筛选标... 利用同源重组技术及Cre-LoxP系统平台,构建牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)缺失TK基因毒株,为研制出安全、高效的LSDV基因工程疫苗提供备选毒株。以TK基因为靶基因,利用Cre-LoxP系统平台,红色荧光蛋白(RFP)为筛选标记,采用重叠PCR方法扩增左、右同源臂以及RFP基因表达框并进行融合,将其克隆至pUC19T载体,构建基因缺失转移载体pUC19T-LSDV-ΔTK-RFP。将转移载体重组质粒转染至Vero细胞,并感染LSDV/CHA/FJ/2021毒株,构建LSDV-ΔTK-RFP重组病毒。采取蚀斑法、有限稀释法纯化LSDV-ΔTK-RFP。然后,利用Cre-LoxP系统,在MDBK-Cre细胞中从病毒基因组中切除RFP标签,采取蚀斑法和有限稀释法筛选并纯化LSDV-ΔTK毒株。利用PCR及测序方法对重组毒株进行鉴定,并测定其一步生长曲线。结果表明成功构建缺失TK基因的重组毒株(LSDV-ΔTK),重组毒株复制力略低于野生毒株。应用Cre-LoxP系统构建的缺失TK基因LSDV毒株,具有良好的遗传稳定性和复制生长特性,为后续LSDV基因工程疫苗的研制提供了候选毒株,同时拓展了Cre-LoxP系统的应用范围。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 TK基因 CRE/LOXP系统 重组毒株

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基于牛结节性皮肤病病毒ORF61基因荧光定量检测方法的建立

5

作者 马春玲 任善会 +7 位作者 杨雪 蔺玉刚 李积雲 王相伟 殷相平 孙跃峰 万学瑞 陈豪泰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1800-1809,共10页

基于国内流行的牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)的基因组序列,建立了靶向ORF61基因的MGB探针荧光定量PCR检测方法。本研究基于LSDV基因序列设计出带有MGB探针的特异性荧光定量PCR引物,并进行特异性和灵敏性筛选验... 基于国内流行的牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)的基因组序列,建立了靶向ORF61基因的MGB探针荧光定量PCR检测方法。本研究基于LSDV基因序列设计出带有MGB探针的特异性荧光定量PCR引物,并进行特异性和灵敏性筛选验证。最终,筛选得到靶向于LSDV ORF61基因的一对qPCR引物;利用pCAGGS-ORF61真核表达质粒,获得标准曲线y=-3.287 5x+47.87,线性相关系数R^(2)=0.998 6,扩增效率达101%;荧光定量PCR特异性、重复性和灵敏性试验结果表明,该引物的特异性高、重复性良好和灵敏度高等优点;该引物的最低检测限为6.71拷贝·μL^(-1),各批次内与批次间重复性结果的变异系数均小于2%。以上结果表明,作者建立特异性LSDV的荧光定量PCR检测方法,为LSD预防和控制提供有效的检测手段。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 ORF61 MGB探针 荧光定量PCR

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牛结节性皮肤病病毒检测及蠓、蚊携带病毒调查 被引量：4

6

作者 李楠 孟锦昕 +4 位作者 王建聂 何于雯 杨绍昌 吕顺燕 王静林 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期4179-4187,共9页

【目的】了解牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)在自然感染状况下病牛的带毒状况及其潜在的传播媒介种类,为牛结节性皮肤病防控提供参考依据。【方法】于2021年7月在云南省文山市采集疑似发病牛不同组织类型标本,2020... 【目的】了解牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)在自然感染状况下病牛的带毒状况及其潜在的传播媒介种类,为牛结节性皮肤病防控提供参考依据。【方法】于2021年7月在云南省文山市采集疑似发病牛不同组织类型标本,2020年8月和2021年7月~2021年8月分别在云南省昆明市、文山市和双江县采集疑似LSDV感染的牛圈舍蠓、蚊标本,并进行形态学鉴定。采用实时荧光定量PCR方法检测发病牛不同组织及库蠓、库蚊标本中LSDV核酸;采用LSDV127基因特异引物对皮肤结节标本进行PCR扩增及测序;利用DNAStar和Mega 6.0等软件进行核苷酸序列相似性比对和系统进化分析。【结果】3头发病牛全血、血清、鼻拭子和皮肤结节标本中均检测到LSDV核酸,且皮肤结节标本中LSDV核酸扩增曲线信号最强;LSDV127基因序列分析结果显示,3份皮肤结节标本(17、18和19)的病毒核苷酸序列相似性为100%,与俄罗斯、泰国、越南和南非等LSDV分离株聚为一支,亲缘关系较近,核苷酸序列相似性在99.7%~100%之间。共采集鉴定条带库蠓、连斑库蠓和尖喙库蠓3种,库蠓标本4822只,库蚊标本150只。所有采集自发病牛圈舍的库蠓和库蚊标本LSDV核酸检测结果均为阴性。【结论】在自然感染LSDV的牛中,血液、鼻分泌物和皮肤结节等不同部位都可能为节肢动物媒介获得并传播LSDV提供很好的感染源;蠓、蚊等节肢动物媒介是否参与了当地LSDV的传播有必要进一步调查。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒(LSDV) 蠓 蚊 序列分析

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鉴别牛结节性皮肤病病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用 被引量：1

7

作者 赵钟毅 闭璟珊 +11 位作者 尹德玮 吕荞 吴健皓 韦正吉 邹联斌 苏姣秀 汪伟 辛佳亮 彭久青 李文静 郑敏 胡传活 《中国动物检疫》 CAS 2023年第2期117-124,共8页

为实现牛结节性皮肤病病毒(LSDV)和羊痘病毒属(CaPV)其他成员的鉴别诊断,针对LSDV 010基因保守区域设计特异性引物及TaqMan探针,与文献报道的CaPV 068基因的通用引物及探针组合,通过优化反应体系和条件,建立了一种可同时鉴别检测LSDV和C... 为实现牛结节性皮肤病病毒(LSDV)和羊痘病毒属(CaPV)其他成员的鉴别诊断,针对LSDV 010基因保守区域设计特异性引物及TaqMan探针,与文献报道的CaPV 068基因的通用引物及探针组合,通过优化反应体系和条件,建立了一种可同时鉴别检测LSDV和CaPV其他成员的双重荧光定量PCR检测方法。结果显示:本方法可以特异性扩增LSDV和CaPV其他成员,并且与其他牛、羊病毒无交叉反应,特异性好;对pLSDV-010和pCaPV-068质粒标准品的最低检测限均为15 copies/μL,具有较高的灵敏性;组内和组间变异系数均小于1.75%,重复性良好。应用本试验建立的方法与荧光定量PCR方法同时检测542份临床样品,发现CaPV的样品符合率为98.52%,LSDV为99.63%。本试验建立的方法为CaPV鉴别筛查、LSDV精准防控及流行病学调查提供了快捷有效的技术手段。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 羊痘病毒属 双重荧光定量PCR TAQMAN探针 鉴别检测

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牛结节性皮肤病病毒研究进展 被引量：1

8

作者 周祉玉 沈湛凝 +4 位作者 朱真 杜吉革 张嘉雯 莘若兰 陈小云 《中国兽药杂志》 2023年第8期88-94,共7页

牛结节性皮肤病(LSD)在全世界范围内均有流行和记载,对我国养牛业构成了严重的威胁。接种疫苗是目前防控LSDV最有效的方法,其中减毒活疫苗在许多国家均有使用。近年研究表明,LSDV活疫苗的使用会造成疫苗重组病毒的流行,接种后会引起动... 牛结节性皮肤病(LSD)在全世界范围内均有流行和记载,对我国养牛业构成了严重的威胁。接种疫苗是目前防控LSDV最有效的方法,其中减毒活疫苗在许多国家均有使用。近年研究表明,LSDV活疫苗的使用会造成疫苗重组病毒的流行,接种后会引起动物不同程度的不良反应。对LSDV的病原学特征、分离鉴定方法、流行病学的情况、检测方法以及LSDV疫苗的研究进展进行了阐述,以期为牛结节性皮肤病的免疫预防以及鉴别诊断提供研究思路。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 检测方法 疫苗

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我国首次牛结节性皮肤病病毒的分离鉴定 被引量：37

9

作者 张敏敏 孙亚杰 +3 位作者 刘文兴 刘任强 王喜军 步志高 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第10期1058-1061,共4页

牛结节性皮肤病(LSD)是由羊痘病毒属牛结节性皮肤病病毒(LSDV)引起的牛的烈性传染病。2019年8月,我国首次在新疆伊犁地区发现疑似LSD疫情。本研究采集伊犁疫情临床症状典型病牛病变皮肤组织,接种羊睾丸(LT)细胞,对出现典型细胞病变的培... 牛结节性皮肤病(LSD)是由羊痘病毒属牛结节性皮肤病病毒(LSDV)引起的牛的烈性传染病。2019年8月,我国首次在新疆伊犁地区发现疑似LSD疫情。本研究采集伊犁疫情临床症状典型病牛病变皮肤组织,接种羊睾丸(LT)细胞,对出现典型细胞病变的培养物进行了系列鉴定。透射电镜观察到典型痘病毒形态的砖型粒子;山羊痘高免血清间接免疫荧光检测培养病变细胞显示阳性反应;LSDV基因组特异引物PCR检测结果为阳性;二代测序(De novo)全基因组分析显示与LSDV/Russia/Saratov/2017(MH646674.1)同源性最高(99.42%);系统进化分析显示与LSDV/Russia/Saratov/2017株相似,介于疫苗株和野毒株分支之间;病毒生长曲线测定显示感染LT细胞的生长特性与已报道的山羊痘病毒相似。上述结果表明,本实验分离得到引起我国首次LSD疫情的病毒株,命名为LSDV/China/Xinjiang/2019株(Xinjiang/2019),本研究为牛结节性皮肤病的防治奠定了基础。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 分离鉴定 进化分析

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牛结节性皮肤病病毒实验室检测方法研究进展 被引量：14

10

作者 庄金秋 梅建国 +3 位作者 刘吉山 张颖 莫玲 姚春阳 《中国奶牛》 2021年第3期36-39,共4页

牛结节性皮肤病(LSD)是由牛结节性皮肤病病毒(LSDV)引起的以发热、消瘦、皮肤水肿、局部形成坚硬的结节或溃疡、淋巴结肿大等为主要特征的急性、亚急性传染病。本病目前尚无特效治疗药物,疫苗接种是当前主要的防控措施,但我国目前并没... 牛结节性皮肤病(LSD)是由牛结节性皮肤病病毒(LSDV)引起的以发热、消瘦、皮肤水肿、局部形成坚硬的结节或溃疡、淋巴结肿大等为主要特征的急性、亚急性传染病。本病目前尚无特效治疗药物,疫苗接种是当前主要的防控措施,但我国目前并没有针对该病的疫苗,因此建立快速准确的检测方法显得尤为重要。本文从该病的病毒分离和鉴定、血清学及分子生物学等方面对LSDV的最新实验室检测方法研究进展进行了综述,以期为LSD的诊断和防控提供参考。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 牛结节性皮肤病 检测 研究进展

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牛结节性皮肤病病毒在BHK-21细胞中的生长特性分析

11

作者 马春玲 蔺玉刚 +9 位作者 杨雪 龚真莉 岳亚辉 任善会 王相伟 杨增岐 殷相平 孙跃峰 陈豪泰 万学瑞 《动物医学进展》 北大核心 2022年第9期7-12,共6页

为探究国内流行的牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)野毒株在鼠源BHK-21细胞中的复制生长特性,用间接免疫荧光、蛋白免疫印迹和透射电镜方法,确定了在BHK-21细胞系中能够感染中国流行的LSDV/FJ/CHA/2021毒株。蛋白免... 为探究国内流行的牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LSDV)野毒株在鼠源BHK-21细胞中的复制生长特性,用间接免疫荧光、蛋白免疫印迹和透射电镜方法,确定了在BHK-21细胞系中能够感染中国流行的LSDV/FJ/CHA/2021毒株。蛋白免疫印迹和病毒生长曲线结果均表明,LSDV野毒株呈现时间依赖性的方式在BHK-21细胞中进行有效复制。电镜结果证明LSDV病毒工厂位于BHK-21细胞质内而非细胞核内。结果表明,LSDV国内流行毒株能够在BHK-21细胞中进行高效复制,为探究LSDV感染的致病机制、动物模型建立及弱毒疫苗的研制奠定重要理论基础。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 BHK-21细胞 病毒增殖 生长特性

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牛结节性皮肤病病毒基因组学研究进展 被引量：4

12

作者 翟颀 黄敏霞 +4 位作者 吕殿红 贾春玲 周秀蓉 温肖会 罗胜军 《广东农业科学》 CAS 2022年第7期97-104,共8页

牛结节性皮肤病(Lumpy Skin Disease,LSD)是一种由牛结节性皮肤病病毒(Lumpy Skin Disease Virus,LSDV)引起牛产生结节特征性病变的动物传染病,在东亚、南亚和东南亚等国家广泛流行,对当地养牛业造成严重的经济损失。目前我国将LSD作为... 牛结节性皮肤病(Lumpy Skin Disease,LSD)是一种由牛结节性皮肤病病毒(Lumpy Skin Disease Virus,LSDV)引起牛产生结节特征性病变的动物传染病,在东亚、南亚和东南亚等国家广泛流行,对当地养牛业造成严重的经济损失。目前我国将LSD作为二类动物疫病管理,自2019年以来,国内已有10多个省份报告过LSD疫情,疫情形势十分严峻。当前分离增殖LSDV较优的细胞为牛肾细胞。LSDV为痘病毒科山羊痘病毒属,其病毒粒子大小约为290 nm×270 nm,具有两种存在形态,病毒基因组复杂庞大,约为151 kb,包含150多个基因。目前GenBank数据库中仅保存有40多条LSDV病毒株的全基因组序列信息,流行毒株除了田间野毒株,近年来在亚洲部分地区还出现了田间野毒株和疫苗毒株的重组毒株,并且流行的重组毒株具有致病性,给未来LSD的疫苗研制和防控策略制定提出了新挑战。综述了LSD的病原学,以及非洲、欧洲和亚洲不同地区LSDV毒株全基因组学的研究进展,以期为LSD的防控和深入研究提供参考。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒(LSDV) 病原学 基因组学 测序 重组毒株

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牛结节性皮肤病病毒感染MDBK细胞后转录组差异表达分析 被引量：3

13

作者 曹政 居马别克·夏拉巴依 +1 位作者 李春燕 马力克·艾则孜 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期460-468,共9页

旨在探索牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)与宿主细胞的相互作用,采集了具有典型临床症状的牛皮肤病变组织,接种MDBK细胞进行病毒分离,采用透射电镜观察病变组织及病毒感染后的MDBK细胞,同时对感染后24 h的MDBK细胞... 旨在探索牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)与宿主细胞的相互作用,采集了具有典型临床症状的牛皮肤病变组织,接种MDBK细胞进行病毒分离,采用透射电镜观察病变组织及病毒感染后的MDBK细胞,同时对感染后24 h的MDBK细胞进行转录组学分析,筛选差异表达基因并将其按功能分类,分析它们参与的细胞信号通路。结果显示,LSDV在电镜下呈椭圆形,病毒粒子大小约320 nm×260 nm。转录组分析发现,与未处理组相比,显著差异表达的基因共499个,其中,112个基因上调表达,387个基因下调表达。通过GO和KEGG分析得知,差异表达基因主要富集在从细胞表面传导信号至细胞核内部的MAPK信号通路,其中,参与天然免疫且涉及细胞凋亡的MAP3K1基因表达呈现显著下调,提示病毒感染会影响宿主细胞的迁移与凋亡等过程。显著变化基因包括HIF1A、RORA、LRRK2、AP3B1和ANO6等,分别涉及到调节血管内皮生长因子、炎症反应、细胞增殖分化以及信号转导等功能,除此之外,不饱和脂肪酸及胆汁分泌两个信号通路也发生了显著变化。本研究为进一步深入探究LSDV的致病机制奠定了基础。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 MDBK细胞 高通量测序 转录组

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牛结节性皮肤病病毒p32蛋白膜外区可溶性表达及多克隆抗体制备 被引量：2

14

作者 黄敏霞 翟颀 +6 位作者 吕殿红 温肖会 翟少伦 罗胜军 周秀蓉 贾春玲 魏文康 《动物医学进展》 北大核心 2022年第12期20-25,共6页

为获得牛结节性皮肤病病毒(LSDV)p32可溶性蛋白并制备其多克隆抗体,截取了LSDV的P 32基因膜外区序列,并构建了重组表达质粒pColdⅠ-P32,在大肠埃希氏菌BL21(DE3)pLysS细胞中经低温诱导表达,然后用钴离子亲和层析纯化以可溶性形式表达的... 为获得牛结节性皮肤病病毒(LSDV)p32可溶性蛋白并制备其多克隆抗体,截取了LSDV的P 32基因膜外区序列,并构建了重组表达质粒pColdⅠ-P32,在大肠埃希氏菌BL21(DE3)pLysS细胞中经低温诱导表达,然后用钴离子亲和层析纯化以可溶性形式表达的重组蛋白,使用纯化的p32截短蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,并通过Western blot鉴定。结果表明,成功使用钴离子亲和层析纯化获得LSDV p32可溶性膜外区蛋白,制备的多克隆抗体可以特异性识别LSDV感染的牛组织蛋白。获得的纯度较高的LSDV p32截短蛋白和特异性良好的多克隆抗体,为建立LSDV抗原检测方法及亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 p32蛋白 可溶性表达 多克隆抗体

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牛结节性皮肤病病毒与山羊痘病毒双重TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

15

作者 余翰维 冯秋媛 +8 位作者 苏洋 张慧 邵晓龙 杨云凤 何小兵 陈国华 房永祥 景志忠 陈轶霞 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期1188-1194,共7页

为建立可快速鉴别牛结节性皮肤病病毒(LSDV)与山羊痘病毒(GTPV)的方法,通过对GenBank中公布的LSDV和GTPV的全基因序列进行比对分析,靶向LSDV基因组的保守区域设计了1对特异性的引物和2条TaqMan探针,经反应条件优化后,建立了一种LSDV和G... 为建立可快速鉴别牛结节性皮肤病病毒(LSDV)与山羊痘病毒(GTPV)的方法,通过对GenBank中公布的LSDV和GTPV的全基因序列进行比对分析,靶向LSDV基因组的保守区域设计了1对特异性的引物和2条TaqMan探针,经反应条件优化后,建立了一种LSDV和GTPV的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并评估其敏感性、重复性、特异性。结果表明,本方法能从LSDV、GTPV、绵羊痘病毒、羊口疮病毒、牛病毒性腹泻病毒、口蹄疫病毒6种常见的牛源性疾病病原中成功鉴别LSDV和GTPV,具有良好的特异性。LSDV和GTPV基因组的最低检测下限都为3.37×10~1copies/μL。组内、组间变异系数均小于1%。运用本方法对10份临床样品进行检测,符合率达到100%。综上所述,本方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可快速鉴别出样品中的LSDV和GTPV,解决了目前国内容易造成的牛结节性皮肤病漏诊的问题,为全面控制国内牛结节性皮肤病疫情提供了新的技术手段。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 山羊痘病毒 双重TaqMan实时定量PCR

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牛结节性皮肤病病毒ORF141蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

16

作者 张慧 何小兵 +7 位作者 房永祥 谭金龙 余翰维 高真贞 景伟 苏洋 陈国华 景志忠 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期1072-1078,共7页

为获得牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin diseasevirus,LSDV)ORF141蛋白及其多克隆抗体,本研究参照Gen Bank收录的LSDV ORF141基因序列,利用Snap Gene软件设计引物,以LSDV基因组为模板,利用PCR扩增ORF141基因,构建原核表达重组质粒p ET-30... 为获得牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin diseasevirus,LSDV)ORF141蛋白及其多克隆抗体,本研究参照Gen Bank收录的LSDV ORF141基因序列,利用Snap Gene软件设计引物,以LSDV基因组为模板,利用PCR扩增ORF141基因,构建原核表达重组质粒p ET-30a(+)-ORF141,转化至Rosseta大肠杆菌表达细胞中,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,然后利用SDS-PAGE和Western-blot对目标蛋白进行鉴定,用该蛋白免疫新西兰大白兔,利用免疫荧光试验确定多克隆抗体的特性。结果表明,本研究成功构建了p ET-30a(+)-ORF141原核表达载体,在1 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导表达目的蛋白,大小约25 ku,主要以包涵体的形式存在;制备的抗LSDV ORF141多克隆抗体的效价可达1∶409600,免疫荧光试验表明其能够识别LSDV病毒中ORF141编码的天然蛋白,这为后续明确LSDV ORF141基因编码蛋白的生物学功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 ORF141基因 原核表达 多克隆抗体

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牛结节性皮肤病病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立

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作者 柯文婷 李杨 +3 位作者 但汉并 余瑞瑶 汤细彪 董晓辉 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期928-934,共7页

为建立高效检测牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)的血清学方法,本研究设计优化LSDV RNA聚合酶30亚基(RPO30)蛋白的密码子,构建其原核表达质粒pET-25b-RPO30,并进行诱导表达和阴离子纯化。纯化后的RPO30蛋白可以被LSD... 为建立高效检测牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)的血清学方法,本研究设计优化LSDV RNA聚合酶30亚基(RPO30)蛋白的密码子,构建其原核表达质粒pET-25b-RPO30,并进行诱导表达和阴离子纯化。纯化后的RPO30蛋白可以被LSDV的阳性血清识别,具有良好的反应原性。用纯化的RPO30蛋白免疫BALB/c小鼠,并将免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合,筛选到能够稳定分泌抗体且具有竞争效果的杂交瘤细胞株1H1。以重组RPO30蛋白为包被抗原,经反应条件的优化,建立了基于RPO30蛋白的竞争ELISA(cELISA)抗体检测方法。本研究建立的cELISA检测方法的最适抗原包被质量浓度为1 mg/L,用含5%牛血清白蛋白(BSA)的PBST作为封闭液37℃孵育2 h,待测血清的最适稀释度为1∶2,1H1抗体稀释度为1∶2 000,兔抗鼠HRP-IgG稀释度为1∶4 000,最佳显色条件是37℃反应15 min。当检测样品的1-S/P≥0.55,判定结果为阳性;当检测样品的1-S/P<0.55,判定结果为阴性。利用该方法检测了LSDV、牛传染性鼻支气管炎病毒(IBRV)、牛支原体(M.bovis)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛布鲁杆菌(B.abortus)、口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清,结果显示除了LSDV检测结果阳性外,其他病原的检测结果都是阴性,说明本方法特异性强。利用本试验建立的cELISA检测有免疫背景的临床血清200份,结果显示,其可用于临床疫苗免疫效果的评估。本研究基于重组RPO30蛋白建立的cELISA方法操作简单、特异性强、敏感性高、重复性好,为LSDV的检测和预防提供了可靠的技术支持。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 RPO30基因 原核表达 竞争ELISA

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牛结节性皮肤病的诊断防控研究

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作者 胡小慧 邓瑞雪 +3 位作者 潘玉平 贾怀杰 安芳兰 刘学荣 《中国畜禽种业》 2024年第1期135-140,共6页

2019年8月10日,第一例牛结节性皮肤病在我国新疆伊犁哈萨克自治州确诊,此后疫情迅速蔓延至国内其他多个省份,牛群感染后严重影响皮张质量和产奶量,给养殖户造成重大经济损失。该文梳理了现有牛结节性皮肤病应用较为广泛的诊断方法及防... 2019年8月10日,第一例牛结节性皮肤病在我国新疆伊犁哈萨克自治州确诊,此后疫情迅速蔓延至国内其他多个省份,牛群感染后严重影响皮张质量和产奶量,给养殖户造成重大经济损失。该文梳理了现有牛结节性皮肤病应用较为广泛的诊断方法及防控措施的研究进展,主要从临床综合诊断、实验室诊断、防控难点和防控建议等方面进行阐述。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 诊断 血清学 分子生物学

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牛结节性皮肤病病毒LAMP快检方法的建立与应用 被引量：1

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作者 袁向芬 许晓琳 +7 位作者 孔玉方 吕继洲 王慧煜 王彩霞 张舟 邓俊花 景志忠 吴绍强 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期1355-1362,共8页

本研究旨在建立一种特异性检测牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的LAMP快检方法,以用于该病临床早期诊断与监测。笔者根据LSDV的特异性基因序列,设计了数十套LAMP引物,经过筛选最终确定1套反应效率最高的引物,其位于LSDV095基因序列内。以实验... 本研究旨在建立一种特异性检测牛结节性皮肤病病毒(LSDV)的LAMP快检方法,以用于该病临床早期诊断与监测。笔者根据LSDV的特异性基因序列,设计了数十套LAMP引物,经过筛选最终确定1套反应效率最高的引物,其位于LSDV095基因序列内。以实验室保存的PUC57-LSDV质粒作为阳性质控进行方法的优化与验证,基于不同的检测需求,分别建立了实时浊度LAMP检测方法、实时荧光LAMP检测方法及荧光可视化LAMP检测方法。优化后的3种LSDV LAMP方法灵敏度均可达20 copies/反应的靶基因,与WOAH推荐的实时荧光PCR方法(5 copies/反应)相近;特异性良好,与山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、赤羽病病毒(AKV)、蓝舌病病毒(BTV)及口蹄疫病毒(FMDV)均无交叉反应。其中,实时浊度法操作程序简单,实时荧光法反应快速(25 min内完成检测),荧光可视化法不依赖专用仪器及中心实验室。将所建方法应用于临床样本的检测,显示这3种方法均可特异性检测到LSDV,与实时荧光PCR方法检测结果一致性为100%,优于WOAH推荐的普通PCR方法。所建方法具有快速、特异、灵敏、操作简便且不依赖专用仪器等优点,可为LSDV的临床快速筛查提供技术支持。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 环介导等温扩增技术(LAMP) 快检技术

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牛结节性皮肤病病毒Cycleave PCR检测方法的建立 被引量：1

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作者 南文龙 巩明霞 +7 位作者 陆游 李金明 王永杰 哈达 李林 杜秋明 陈义平 吴晓东 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期1145-1148,1174,共5页

将GenBank中牛结节性皮肤病病毒与同属的山羊痘病毒和绵羊痘病毒全基因组进行比较,筛选设计特异性引物和探针,建立Cycleave PCR检测方法。结果显示,建立的方法在40 min内即可特异性地检出牛结节性皮肤病病毒核酸,与山羊痘病毒、绵羊痘... 将GenBank中牛结节性皮肤病病毒与同属的山羊痘病毒和绵羊痘病毒全基因组进行比较,筛选设计特异性引物和探针,建立Cycleave PCR检测方法。结果显示,建立的方法在40 min内即可特异性地检出牛结节性皮肤病病毒核酸,与山羊痘病毒、绵羊痘病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、蓝舌病病毒均无交叉反应,该方法的最低检出限为1.13拷贝/μL。平行检测89份临床样本,与国标荧光定量PCR方法相比,本方法敏感性100.0%,特异性90.0%,总符合率为95.5%。结果表明,本试验建立的Cycleave PCR检测方法敏感、特异且操作简便,适用于牛结节性皮肤病病毒的高通量、快速检测。 展开更多

关键词 牛结节性皮肤病病毒 Cycleave PCR ORF024基因

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