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猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 被引量：22
1
作者 郑敏 金宁一 +2 位作者 张洪勇 李昌 尹革芬 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期430-432,共3页
通过 RT- PCR方法从用 PHA和 L PS刺激的猪脾脏细胞中扩增出猪白细胞介素 18(p IL - 18)成熟蛋白基因的c DNA,克隆到 T载体 p UCm- T后 ,序列测定表明 ,p IL- 18成熟蛋白基因核苷酸长度为 4 74 bp,编码 15 7个氨基酸。将该基因片段克隆... 通过 RT- PCR方法从用 PHA和 L PS刺激的猪脾脏细胞中扩增出猪白细胞介素 18(p IL - 18)成熟蛋白基因的c DNA,克隆到 T载体 p UCm- T后 ,序列测定表明 ,p IL- 18成熟蛋白基因核苷酸长度为 4 74 bp,编码 15 7个氨基酸。将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体 p ET- 2 8a构建重组质粒 p ETIL 18m,转化大肠杆菌 BL 2 1(DE3) ,并用 IPTG诱导。重组菌菌体裂解物 SDS- PAGE可检测到相对分子质量为 190 0 0的重组蛋白 ,免疫印迹法证实该重组蛋白可以与人 IL- 展开更多
关键词 猪白细胞介素18 成熟蛋白 基因克隆 原核表达 RT-PCR 大肠杆菌 免疫佐剂 免疫调节剂
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猪白细胞介素18基因的克隆、表达及生物学活性检测 被引量：6
2
作者 郑兰兰 贾云飞 +3 位作者 崔保安 陈红英 魏战勇 陈瑞亮 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期214-219,共6页
通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA,克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-IL18,转化E.coli JM109感受态细胞,取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明,pIL-18... 通过RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA,克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-IL18,转化E.coli JM109感受态细胞,取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定。测序结果表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp,编码157个氨基酸。将其克隆到表达载体pGEX6P-1中,构建重组质粒pGEX-IL18,转化E.coli BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达。重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为45 kD的重组蛋白,占菌体总蛋白的28%左右,以包涵体形式存在。对包涵体进行洗涤,用MTT法测定表明,重组蛋白能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应的活性。 展开更多
关键词 猪白细胞介素18 成熟蛋白 原核表达 活性检测
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猪白细胞介素18成熟蛋白基因克隆及在不同原核表达系统中的表达
3
作者 郑兰兰 崔保安 +3 位作者 陈红英 贾云飞 陈瑞亮 方忠意 《华南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期75-79,共5页
RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18成熟蛋白基因的cDNA,克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-TpIL18,转化E.coliJM109感受态细胞,取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定.测序结果表明,pIL-18成熟蛋白基因核... RT-PCR方法直接从猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪白细胞介素18成熟蛋白基因的cDNA,克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-TpIL18,转化E.coliJM109感受态细胞,取PCR和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定.测序结果表明,pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474 bp,编码157个氨基酸.将其分别克隆到表达载体pQE30、pET-28a、pGEX6P-1中,构建重组表达质粒pQE-mpIL18、pET-mpIL18、pGEX-mpIL18.用IPTG诱导表达,重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量分别为19 000、21 000、45 000的重组蛋白.经薄层扫描分析,pQE-mpIL18、pET-mpIL18、pGEX-mpIL18菌体裂解物分别占菌体总蛋白的17%、28%、27%,均以包涵体形式存在. 展开更多
关键词 猪白细胞介素18 成熟蛋白 原核表达
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猪细小病毒对猪外周血淋巴细胞分泌猪白细胞介素18转录时相影响的探讨
4
作者 刘占通 李金磊 魏战勇 《浙江农业科学》 2011年第6期1410-1412,共3页
猪细小病毒体外感染外周血淋巴细胞(PBMC)后引起细胞免疫反应尚不清楚,为了更好的了解猪细小病毒(PPV)感染PBMC后引起猪白细胞介素18的反应,探讨宿主-病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析了PPV感染PBMC后引起的病毒DNA... 猪细小病毒体外感染外周血淋巴细胞(PBMC)后引起细胞免疫反应尚不清楚,为了更好的了解猪细小病毒(PPV)感染PBMC后引起猪白细胞介素18的反应,探讨宿主-病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析了PPV感染PBMC后引起的病毒DNA含量的变化和猪IL-18的分泌水平。结果猪IL-18的表达量在3,6,12,24 h增加,1,48,72 h下调。可见,猪细小病毒感染可引起PBMC分泌猪白细胞介素18的增加。 展开更多
关键词 外周血淋巴细胞 猪白细胞介素18 猪细小病毒 转录时相
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猪白细胞介素-18基因表达及重组蛋白的纯化 被引量：3
5
作者 裴仉福 陈瑞爱 +5 位作者 唐秀英 朱文冠 唐满华 李琳 程含波 温纳相 《中国兽药杂志》 2007年第2期5-9,共5页
以pcDNA3.1-IL18为模板进行PCR扩增获得猪白细胞介素-18(IL-18)的成熟肽基因,以KpnⅠ、SacⅠ双酶切PCR产物作为供体,KpnⅠ、SacⅠ双酶切的pET41c和pET32c作为载体,连接载体供体,转化DH5α,经双酶切、PCR鉴定及测序筛选出阳性重组质粒,... 以pcDNA3.1-IL18为模板进行PCR扩增获得猪白细胞介素-18(IL-18)的成熟肽基因,以KpnⅠ、SacⅠ双酶切PCR产物作为供体,KpnⅠ、SacⅠ双酶切的pET41c和pET32c作为载体,连接载体供体,转化DH5α,经双酶切、PCR鉴定及测序筛选出阳性重组质粒,并命名为pET41c-IL18和pET32c-IL18。将pET41c-IL18和pET32c-IL18转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),用1 mmol/L IPTG 37℃诱导表达。SDS-PAGE及W estern-blotting分析结果表明,所表达的重组蛋白主要以包涵体形式存在,pET32c-IL18重组蛋白分子质量约33 ku,与预期大小相符。将包涵体提取物用8 mol/L脲变性,经N i-NTA柱纯化,透析复性,得到了纯化的IL-18蛋白。 展开更多
关键词 猪白细胞介素-18 基因表达 蛋白纯化
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猪IL-18增强猪细小病毒灭活疫苗猪体细胞免疫效果的研究 被引量：2
6
作者 韩丽 何潇湘 +4 位作者 王瑞宁 曹贝贝 耿静微 陈红英 魏战勇 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期224-228,共5页
为了研究猪白细胞介素18是否增强猪细小病毒(PPV)灭活疫苗在猪体免疫效果,分别将猪白细胞介素18与自制猪细小病毒灭活疫苗和猪细小病毒灭活疫苗联合免疫仔猪,并设猪白介素18和生理盐水对照组。免疫后分别用间接ELISA方法和流式细胞技术... 为了研究猪白细胞介素18是否增强猪细小病毒(PPV)灭活疫苗在猪体免疫效果,分别将猪白细胞介素18与自制猪细小病毒灭活疫苗和猪细小病毒灭活疫苗联合免疫仔猪,并设猪白介素18和生理盐水对照组。免疫后分别用间接ELISA方法和流式细胞技术检测仔猪抗体水平变化和仔猪外周血T淋巴细胞亚群动态变化。结果显示,免疫后猪白细胞介素18联合灭活疫苗组抗体水平与无猪白介素18灭活疫苗组相似,但免疫后猪白介素18联合PPV灭活疫苗组的CD3^+、CD3^+CD4^+、CD3^+CD8^+T淋巴细胞所占比值均高于相应的PPV灭活疫苗组,但差异不显著,且CD4^+/CD8^+在正常范围内。研究证实猪白介素18主要增强PPV油乳剂灭活疫苗的细胞免疫应答。 展开更多
关键词 猪白细胞介素18 猪细小病毒 灭活疫苗
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猪IL-18在猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗中的免疫佐剂作用 被引量：4
7
作者 曹素芳 王岩 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2013年第8期13-16,20,共5页
为了探讨猪IL-18对猪繁殖与呼吸综合征灭活苗体液免疫和细胞免疫的影响,75头21日龄断奶仔猪随机分成5组,将重组猪IL-18蛋白、pcDNA3/pmIL-18质粒均分别以200μg/次和400μg/次剂量与猪繁殖与呼吸综合征灭活苗同时免疫,于免疫后7、15、30... 为了探讨猪IL-18对猪繁殖与呼吸综合征灭活苗体液免疫和细胞免疫的影响,75头21日龄断奶仔猪随机分成5组,将重组猪IL-18蛋白、pcDNA3/pmIL-18质粒均分别以200μg/次和400μg/次剂量与猪繁殖与呼吸综合征灭活苗同时免疫,于免疫后7、15、30、45、60d采集血液,以MTT法检测猪外周血淋巴细胞增殖情况,以流式细胞术检测猪外周血中CD4+和CD8+的变化,以ELISA法检测免疫猪猪繁殖与呼吸综合征抗体变化。结果显示,猪IL-18能够显著促进猪外周淋巴细胞增殖,可明显提高猪繁殖与呼吸综合征灭活苗免疫猪外周血中CD4+和CD8+的数量,无论是重组猪IL-18蛋白还是pcDNA3/pmIL-18质粒均可提高PRRSV灭活苗抗体水平,且重组猪IL-18高、低剂量组在免疫30d猪体中猪繁殖与呼吸综合征灭活苗的抗体水平达到高峰,随后下降,剂量越高提高作用越明显;而pcDNA3/pmIL-18高、低剂量组在免疫45d猪体中猪繁殖与呼吸综合征灭活苗的抗体水平达到高峰后下降,剂量越高促进作用越好。猪IL-18可作为猪繁殖与呼吸综合征灭活苗的免疫佐剂。 展开更多
关键词 猪白细胞介素18 猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗 CD4+ CD8+ 抗体
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猪IL-18基因真核表达质粒的构建及其表达产物的生物学活性
8
作者 邵攀峰 崔沛 +3 位作者 郑兰兰 魏战勇 盛敏 崔保安 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2009年第12期85-90,共6页
【目的】构建猪IL-18的重组质粒,检测其表达产物的生物学活性,为进一步研究猪IL-18基因的结构与功能奠定基础。【方法】通过PCR技术从含猪IL-18全基因的克隆质粒中扩增猪IL-18基因,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pIL... 【目的】构建猪IL-18的重组质粒,检测其表达产物的生物学活性,为进一步研究猪IL-18基因的结构与功能奠定基础。【方法】通过PCR技术从含猪IL-18全基因的克隆质粒中扩增猪IL-18基因,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pIL-18,在脂质体作用下转染猪肾PK15细胞。【结果】重组质粒pIL-18经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。通过RT-PCR检测,证实了猪IL-18在PK15细胞中的表达;SDS-PAGE分析结果表明,表达产物是与猪IL-18相符的约22 ku的蛋白条带;Western blot证实,表达产物能与猪IL-18单克隆抗体发生特异性反应。pIL-18对H1亚型猪流感灭活疫苗免疫增强作用的研究表明,pIL-18能够提高猪流感灭活疫苗诱发的细胞免疫应答。【结论】成功地构建了猪IL-18的重组质粒pIL-18,并在PK15细胞中获得了瞬时表达,且具有一定的免疫原性。 展开更多
关键词 猪白细胞介素18 真核表达 生物学活性 猪流感灭活疫苗
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猪IL-18基因的原核表达及重组蛋白的纯化 被引量：1
9
作者 裴仉福 陈瑞爱 +5 位作者 温纳相 唐秀英 唐满华 朱文冠 李琳 程含波 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期842-846,共5页
以pcDNA3.1-pIL-18为模板,采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18(IL-18)的成熟蛋白基因,通过KpnⅠ+SacⅠ双酶切及连接反应,构建了pET32c-pIL-18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中的基因片段连接... 以pcDNA3.1-pIL-18为模板,采用PCR技术扩增到了猪白细胞介素18(IL-18)的成熟蛋白基因,通过KpnⅠ+SacⅠ双酶切及连接反应,构建了pET32c-pIL-18原核表达质粒。经过限制性内切酶分析、PCR鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中的基因片段连接正确。之后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达。菌体裂解产物经SDS-PAGE分析,在分子质量约为33 ku处出现了预期的目的蛋白。用8 mol/L脲对表达产物变性,经Ni2+-NTA柱纯化,透析复性,得到了纯化的IL-18蛋白。Western-blot分析证实,纯化的重组IL-18蛋白具有反应活性。上述研究结果为重组IL-18的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 猪白细胞介素-18基因 原核表达 蛋白纯化
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猪IL-18在杆状病毒/昆虫细胞中的表达 被引量：1
10
作者 王振亚 王彦彬 +5 位作者 陈红英 邵攀峰 宁晓东 潘娜 韩利静 崔保安 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期118-123,共6页
IL-18作为一种多效性细胞因子,在机体免疫应答及各种生理功能中发挥着重要的调节作用,根据猪IL-18基因序列设计1对引物,将编码猪IL-18的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual中,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化,然后... IL-18作为一种多效性细胞因子,在机体免疫应答及各种生理功能中发挥着重要的调节作用,根据猪IL-18基因序列设计1对引物,将编码猪IL-18的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual中,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化,然后转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用。将重组质粒转染昆虫细胞,SDS-PAGE可检测到分子量为18 kDa左右的重组蛋白,Western blotting证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-18抗体发生特异性反应。纯化后蛋白能明显促进猪T淋巴细胞转化,表明所表达的IL-18具有较高的生物活性。此研究为进一步开发研制新型免疫佐剂奠定了基础。 展开更多
关键词 猪白细胞介素-18 昆虫细胞 表达
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