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猪急性腹泻综合征冠状病毒诱导细胞自噬并增强病毒复制的研究 被引量：3
1
作者 曾苗苗 刘大凯 +8 位作者 张记宇 张燎原 冯廷帅 杨小曼 时洪艳 张鑫 陈建飞 石达 冯力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期61-69,共9页
为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV(MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证... 为研究猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)感染细胞是否诱导自噬及自噬对病毒复制的影响,本研究将SADS-CoV(MOI 0.1)接种Vero E6细胞培养36 h后,经透射电子显微镜观察可见,SADS-CoV感染的细胞中出现了包裹胞浆的自噬体样双层膜结构,证实SADS-CoV可以诱导Vero E6细胞发生自噬。构建pEGFP-LC3的真核表达质粒并经双酶切及测序鉴定正确后转染Vero E6细胞,24 h后以SADS-CoV感染,24 h后经激光共聚焦显微镜观察可见,与阴性对照组细胞相比,感染SADS-CoV的细胞出现绿色荧光的点状聚集。进一步将SADS-CoV(MOI 0.1)感染Vero E6细胞不同时间后通过western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和p62表达水平的变化,结果显示,与阴性对照组相比,SADS-CoV感染组LC3-Ⅱ的表达水平升高,LC3-Ⅱ/GAPDH比值呈上升趋势,而p62蛋白表达水平则显著降低(P<0.05),表明SADS-CoV感染能够诱导Vero E6细胞产生完整的自噬应答。为了探究自噬对病毒复制的影响,本研究分别采用自噬抑制剂3-MA和自噬诱导剂Rapamycin处理Vero E6细胞后以SADS-CoV感染,于感染后不同时间收获细胞,通过western blot和病毒滴度(TCID_(50))测定检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与仅感染病毒的对照组相比,采用3-MA处理Vero E6细胞后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)均显著降低(P<0.05),而采用Rapamycin处理后SADS-CoV N蛋白的表达水平及TCID_(50)则均显著升高(P<0.05)。针对ATG5基因设计3条特异性的ATG5 si RNA(siATG5-1/2/3),将干扰效率较好的siATG5-1转染Vero E6细胞后再以SADS-CoV感染,24 h后检测病毒滴度并利用western blot检测SADS-CoV N蛋白表达水平的变化。结果显示,与未转染siATG5的3组阴性细胞相比,转染细胞中SADS-CoV N蛋白的表达水平及病毒滴度均显著降低(P<0.05)。本研究首次表明SADS-CoV感染可以诱导宿主细胞自噬并促进病毒的复制,该结果为深入研究SADS-CoV感染与其致病机理以及防控该病毒的感染奠定了基础。 展开更多
关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 自噬 病毒复制 LC3-Ⅱ
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猪圆环病毒2型ORF1部分位点突变对病毒复制能力的影响 被引量：1
2
作者 李荷然 肖琦 +3 位作者 温立斌 朱雪蛟 芮荣 何孔旺 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第1期71-76,共6页
猪圆环病毒2型(PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,导致仔猪逐渐消瘦。PCV2 ORF1表达的Rep蛋白及其剪切体Rep′是PCV2复制所需的重要蛋白。为了研究PCV2 ORF1部分位点对PCV2复制能力的影响,本试验通过构建PCV2 ORF1区域点突变双拷贝... 猪圆环病毒2型(PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,导致仔猪逐渐消瘦。PCV2 ORF1表达的Rep蛋白及其剪切体Rep′是PCV2复制所需的重要蛋白。为了研究PCV2 ORF1部分位点对PCV2复制能力的影响,本试验通过构建PCV2 ORF1区域点突变双拷贝感染性克隆质粒,在无PCV2污染的PK-15细胞中进行病毒拯救,使用荧光定量PCR检测不同位点突变病毒培养不同代次上清液的Ct值。结果:将PCV2 Rep的17 aa、19 aa、20 aa和21 aa突变为丙氨酸后病毒无法成功拯救,2 aa突变后严重影响病毒的复制能力,3 aa、5 aa和18 aa突变后病毒的复制能力增强且细胞病毒载量高于PCV2原毒株,推测17 aa、19 aa、20 aa和21 aa是影响PCV2复制的关键作用位点。本研究结果为未来PCV2复制相关研究提供了试验依据。 展开更多
关键词 猪圆环病毒2型 REP蛋白 病毒复制
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IRES核心区12-bp非连续插入突变对猪塞内卡病毒复制和细胞嗜性的影响
3
作者 张晓战 董轩志 +10 位作者 吕楠楠 刘懿雯 马新甜 王林青 夏艳勋 蒋增海 郭运泽 赵攀登 宋予震 杨德成 边传周 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期1407-1416,共10页
【背景】塞内卡病毒(senecavirus A,SVA)是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区(untranslated region,UTR)中的内部核糖体进入位点(IRES)元件在病毒复制过程中发挥重要作用。2017年... 【背景】塞内卡病毒(senecavirus A,SVA)是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区(untranslated region,UTR)中的内部核糖体进入位点(IRES)元件在病毒复制过程中发挥重要作用。2017年我国出现IRES核心区Domain II 12个碱基非连续插入的自然突变SVA毒株,在病毒复制和致病性方面存在明显改变。【目的】探讨IRES Domain II区域发生的突变对SVA的复制及细胞嗜性的影响,为进一步了解SVA致病机制奠定基础。【方法】以实验室前期构建的含HeN-1/2018株全基因组感染性克隆pHeN-1/2018为基础,通过定点突变的方式,逐步将其IRES Domain II核心区域308—317 nt的9个碱基(ACTCAAGCG)替换为GD04/2017株基因组308—328 nt的21个碱基(CACGCCTGCCGATAGACGATT),构建重组载体pHeN-1/2018-i12并进行了病毒拯救。随后,利用病毒基因组克隆测序、间接免疫荧光试验和Western blot试验对所拯救病毒进行鉴定,同时验证了IRES核心区12个碱基插入突变对SVA病毒体外复制能力和细胞嗜性的影响。【结果】将构建完成的重组载体pHeN-1/2018-i12转染细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的IRES突变病毒rHeN-1/2018-i12。病毒连续传代后测序结果表明rHeN-1/2018-i12遗传稳定,P5代病毒基因组序列未发生碱基突变,P10代病毒IRES区域没有出现突变现象。用低代次的突变病毒rHeN-1/2018-i12体外感染本体动物猪源细胞系PK-15和IBRS-2,及仓鼠源细胞系BHK-21,进行细胞感染试验,结果表明rHeN-1/2018-i12与亲本毒株rHeN-1/2018在PK-15、IBRS-2和BHK-21中均能导致明显的细胞病变,表现出相似的生长曲线趋势,表明IRES核心区Domain II 12个碱基突变不能够改变对上述细胞的嗜性;但SVA突变病毒和亲本株在不同细胞中的病变时间及病毒滴度上存在较大的差异,rHeN-1/2018-i12株在细胞中生长能力较其亲本株rHeN-1/2018差,诱使细胞病变的时间较晚,在感染24 hpi,两者病毒滴度相差可达10倍。【结论】本研究基于SVA反向遗传操作系统构建并拯救SVA IRES突变毒株,确定了IRES突变对SVA生物学特性的影响,有助于我们更好地了解SVA致病机制,拓宽我们对病毒IV型IRES功能的认识。 展开更多
关键词 塞内卡病毒 内部核糖体进入位点 反向遗传操作系统 病毒复制 细胞嗜性
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干扰素刺激基因ISG15对猪流行性腹泻病毒复制的作用及机制分析
4
作者 刘莉莉 边缘 +2 位作者 吴圣龙 包文斌 吴正常 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期2545-2555,共11页
【目的】探究干扰素刺激基因ISG15在猪流行性腹泻病毒(PEDV)复制中所发挥的作用及机制。【方法】利用实时荧光定量PCR检测ISG15基因组织表达谱及肠道组织差异表达情况,同时以猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为研究模型,检测PEDV CV777毒株感染... 【目的】探究干扰素刺激基因ISG15在猪流行性腹泻病毒(PEDV)复制中所发挥的作用及机制。【方法】利用实时荧光定量PCR检测ISG15基因组织表达谱及肠道组织差异表达情况,同时以猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为研究模型,检测PEDV CV777毒株感染细胞不同时间点PEDV M基因mRNA和N蛋白表达量,并从RNA和蛋白水平检测ISG15表达变化;分别构建猪ISG15基因干扰和过表达细胞,通过实时荧光定量PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验检测ISG15基因表达对PEDV复制水平的影响;对ISG15基因过表达前后进行转录组测序分析,筛选其下游调控基因及信号通路。【结果】ISG15基因在仔猪肠道组织中特异性高表达,其中空肠和回肠中表达量极显著高于其他组织(P<0.01);PEDV感染组十二指肠、空肠及回肠中ISG15基因表达量显著或极显著高于健康组(P<0.05;P<0.01);M基因mRNA和N蛋白表达量出现上升趋势,与0 h相比,ISG15基因表达水平在24 h出现极显著上调(P<0.01);ISG15基因过表达后PEDV复制出现显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01),而ISG15基因干扰后PEDV复制出现极显著上调(P<0.01);转录组测序发现,过表达ISG15基因前后存在1 532个差异表达基因,且其主要富集在自噬、MAPK、内吞等信号通路中。【结论】本研究揭示了PEDV感染过程中ISG15基因的调控功能及作用机制,发现ISG15基因上调可显著抑制PEDV复制,增进了对PEDV与宿主细胞互作分子机制的认识。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) ISG15基因 病毒复制 转录组
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猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白纳米抗体的筛选及其对病毒复制的抑制效应
5
作者 宋雯妍 张瀚文 +5 位作者 吴澳迪 张丽燕 刘照 叶桐桐 陈创夫 盛金良 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期258-270,共13页
为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组... 为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并探究其对病毒复制的抑制效应。使用原核表达系统将PRRSV-GP5蛋白大量表达后经镍柱亲和层析法纯化,使用所获的重组GP5蛋白免疫羊驼,并于第0、14、28、42天时采血,检测羊驼体内抗体效价后分离全血淋巴细胞,提取细胞总RNA,反转录后使用巢式PCR扩增出重链抗体可变区(VHH)片段,并与pCANTAB-5E载体相连后转化入TG1感受态细胞,利用噬菌体展示技术构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库。经连续三轮特异性噬菌体的筛选与富集后,淘选出与PRRSV-GP5蛋白高结合力的纳米抗体,通过间接ELISA方法鉴定其反应原性,后将所获的纳米抗体基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,利用Lipofectamine3000转染至Marc^(-1)45细胞内,与PRRSV分别共孵育0、24、36、48、60、72 h,以探究所筛针对PRRSV-GP5蛋白的纳米抗体于胞内对病毒复制与转录产生的影响。结果表明,成功对PRRSV-GP5蛋白进行原核表达并纯化,得到浓度为2.16 mg·mL^(-1)的重组蛋白,对羊驼三次免疫14 d后,其体内抗体效价高达1∶819200,构建GP5-VHH噬菌体抗体展示文库,库容量达2.93×107 CFU·mL^(-1),插入率为98%。经对噬菌体抗体文库连续三轮淘选富集后,最终获得2株不同氨基酸序列的纳米抗体。间接ELISA结果显示,2株纳米抗体均与PRRSV-GP5蛋白具有良好的亲和力。将2株纳米抗体转染至Marc^(-1)45细胞内,它们分别于36与60 h时显著阻碍PRRSV的复制与转录,展现出了较好的阻碍病毒复制的能力。本研究首次筛选出针对PRRSV-GP5蛋白的特异性纳米抗体,且经验证所筛纳米抗体具备抑制PRRSV在细胞内复制的能力,研究结果为抗PRRSV新型药物的研发奠定了试验依据与物质基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5蛋白 纳米抗体 噬菌体展示技术 病毒复制
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E3泛素连接酶FBXL8对A亚群禽白血病病毒复制的影响
6
作者 郑诗龄 陈雪阳 +3 位作者 刘晶 方春 梁雄燕 杨玉莹 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1696-1705,共10页
【目的】制备鸡E3泛素连接酶FBXL8多克隆抗体,探究鸡源FBXL8对A亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A)在鸡胚成纤维细胞(DF-1)内复制的影响。【方法】以DF-1细胞cDNA为模板,通过PCR扩增FBXL 8基因,构建鸡源FBXL8原... 【目的】制备鸡E3泛素连接酶FBXL8多克隆抗体,探究鸡源FBXL8对A亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup A,ALV-A)在鸡胚成纤维细胞(DF-1)内复制的影响。【方法】以DF-1细胞cDNA为模板,通过PCR扩增FBXL 8基因,构建鸡源FBXL8原核表达重组质粒pET-28a-FBXL8,将其转化大肠杆菌表达菌株RIL进行诱导表达及纯化,将表达产物His-FBXL8免疫10月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体,利用Western blotting和间接ELISA分别检测抗体特异性及效价;针对已公布的FBXL 8基因序列设计过表达引物及靶向FBXL 8基因的干扰序列,构建过表达质粒psi-flag-FBXL8及干扰质粒pLKO.1-FBXL8-shRNA,使用Western blotting检测其表达效果。将构建成功的过表达质粒和干扰质粒转染DF-1细胞,24 h后感染ALV-A,通过半定量PCR、Western blotting分别检测ALV-A的结构蛋白P27、GP85表达水平。【结果】PCR成功扩增出大小为1182 bp的FBXL 8基因片段,并成功构建FBXL8原核表达重组质粒pET-28a-FBXL8,诱导表达的融合蛋白His-FBXL8大小为43 ku。Western blotting和间接ELISA结果显示,制备的FBXL8兔多克隆抗体可特异性识别外源蛋白,且抗体效价为1∶64000。成功构建了FBXL8过表达质粒和干扰质粒,其在DF-1细胞中能够实现对FBXL8的过表达和敲低。半定量PCR和Western blotting检测结果显示,过表达FBXL8可抑制ALV-A复制,而敲低FBXL8则促进其复制。【结论】本研究制备的FBXL8多克隆抗体具有良好特异性及反应性;在DF-1细胞中,FBXL8负向调控ALV-A复制,研究结果为进一步深入探究FBXL8生物学特性提供了重要参考,并为揭示FBXL8抗ALV-A感染分子机制奠定了基础。 展开更多
关键词 FBXL8 A亚群禽白血病病毒(ALV-A) 多克隆抗体 病毒复制
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SYNPO2蛋白在狂犬病病毒复制过程中的功能初探
7
作者 王姝捷 谢鑫 +4 位作者 张曦 陈明 雷桃红 邓俊杰 许运斌 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期154-160,共7页
目的探明SYNPO2蛋白对狂犬病病毒复制的影响。方法通过免疫印迹分析病毒感染后SYNPO2蛋白的差异表达情况;构建SYNPO2基因真核表达载体和shRNA干扰载体,转染SK-N-SH细胞后进行病毒感染,免疫印迹分析过表达或干扰SYNPO2对病毒蛋白表达的影... 目的探明SYNPO2蛋白对狂犬病病毒复制的影响。方法通过免疫印迹分析病毒感染后SYNPO2蛋白的差异表达情况;构建SYNPO2基因真核表达载体和shRNA干扰载体,转染SK-N-SH细胞后进行病毒感染,免疫印迹分析过表达或干扰SYNPO2对病毒蛋白表达的影响,荧光定量PCR分析过表达或干扰SYNPO2对病毒基因组复制和转录水平的影响,病毒滴度测定分析过表达或干扰SYNPO2对感染性病毒粒子释放能力的影响;SYNPO2真核表达载体转染SK-N-SH细胞后进行病毒感染,或与构建成功的病毒M基因真核表达载体共转染SK-N-SH细胞,间接免疫荧光实验结合激光共聚焦拍照技术分析SYNPO2与M蛋白在病毒感染或真核表达细胞中的亚细胞定位情况。结果狂犬病病毒感染可诱导SYNPO2蛋白的下调表达;SYNPO2过表达可促进病毒M蛋白表达,但未影响病毒基因组的复制、转录及感染性病毒粒子释放的能力;干扰SYNPO2则在未影响病毒基因组复制和转录的情况下显著抑制了病毒M蛋白的表达和感染性病毒粒子的释放;进一步经共定位分析发现SYNPO2与病毒M蛋白存在明显共定位现象。结论确定了SYNPO2蛋白对狂犬病病毒复制起着正向调控作用,为挖掘狂犬病治疗潜在的药物靶标奠定基础数据。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 病毒复制 SYNPO2蛋白 病毒M蛋白
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黄曲霉毒素B1对仔猪体内流感病毒复制、器官损伤和肠道菌群的影响
8
作者 赵文硕 张金龙 +5 位作者 姚兆然 宋宇琪 吕顺 刘迎雪 袁聪聪 孙雨航 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第20期4145-4160,共16页
【背景】黄曲霉毒素B1(AFB1)是由寄生曲霉菌产生的次级代谢产物,广泛存在于世界各地受污染的食品和饲料中,被认为是影响人类和动物健康的主要风险因素之一。猪流感病毒(SIV)是目前世界上传播最为广泛的病毒之一,其复制易受环境和营养等... 【背景】黄曲霉毒素B1(AFB1)是由寄生曲霉菌产生的次级代谢产物,广泛存在于世界各地受污染的食品和饲料中,被认为是影响人类和动物健康的主要风险因素之一。猪流感病毒(SIV)是目前世界上传播最为广泛的病毒之一,其复制易受环境和营养等多种因素影响。然而,饲料中AFB1污染与SIV感染的关系尚不明确。【目的】探究AFB1暴露对SIV感染的仔猪体内SIV复制、器官损伤和肠道菌群的影响,为研究霉菌毒素中毒机制奠定基础,也为探讨其他感染性疾病易感性增加原因提供参考。【方法】选取保育期雄性仔猪32头,随机分为4组(每组8头),在试验开始第1和第4天分别滴鼻接种低致病性SIV病毒稀释液,建立SIV感染仔猪(本体动物)模型。每天新鲜稀释AFB1,按照0、10、20和40μg·kg^(-1)(饲料)浓度灌服给仔猪,持续21 d。分别在第7、14和21天饲喂前对仔猪进行称重,然后应用多种技术手段检测各组仔猪器官脏器指数、剖检变化和病理特征,并在此基础上,进一步使用免疫印迹分析肺部SIV的核衣壳蛋白(NP)的表达情况以及16S rRNA检测肠道菌群变化,阐明AFB1暴露对SIV感染、脏器损伤和肠道菌群的影响。【结果】暴露于40μg·kg^(-1)AFB1的仔猪较对照组仔猪(无AFB1)体增重显著降低(P<0.01),NP蛋白表达以及肺脏指数显著升高(P<0.01),而脾脏指数显著降低(P<0.01)。剖检结果显示,暴露于40μg·kg^(-1)AFB1仔猪的脾脏、肝脏和肺脏损伤严重。H.E染色也表现出相似的结果,与SIV对照组相比,40μg·kg^(-1)AFB1处理组仔猪脾脏出现淤血,红白髓界限不清;肝组织出血、炎症细胞浸润;肺脏小肺泡融合成形态不规则的大肺泡,肺泡间质增厚,炎性细胞浸润增多;此外,肠绒毛形状不规则,结缔组织松散,有淋巴细胞浸润。16S rRNA测序结果显示,暴露于40μg·kg^(-1)AFB1显著提高了仔猪肠道放线菌门和梭状芽孢杆菌的相对丰度,降低了乳酸菌属和拟杆菌属的丰度。【结论】AFB1暴露降低了SIV感染仔猪的体增重,促进SIV复制,加剧了肺组织等器官损伤,并引起肠道菌群紊乱,该发现为研究AFB1的毒性作用机制提供理论参考依据。 展开更多
关键词 黄曲霉毒素B1 猪流感病毒 病毒复制 脏器损伤 16S rRNA 肠道菌群
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DEAD-box解旋酶21对猪传染性胃肠炎病毒复制的调控作用
9
作者 谢立兰 尹杰 +1 位作者 黄冬蛾 李么明 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2024年第4期215-222,共8页
旨在探究DEAD-box解旋酶21(DDX21)对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)复制的调控作用。首先通过蛋白免疫印迹(Western Blot)分析了TGEV感染对DDX21表达的影响;进一步构建了猪DDX21真核表达质粒以及建立稳定敲低DDX21的PK-15细胞系,运用荧光定量... 旨在探究DEAD-box解旋酶21(DDX21)对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)复制的调控作用。首先通过蛋白免疫印迹(Western Blot)分析了TGEV感染对DDX21表达的影响;进一步构建了猪DDX21真核表达质粒以及建立稳定敲低DDX21的PK-15细胞系,运用荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹、间接免疫荧光(IFA)和半数细胞培养物感染量(TCID 50)探究外源过表达DDX21及敲低DDX21对TGEV体外复制的调控作用;构建一系列DDX21截短突变体真核表达质粒,鉴定了DDX21调控TGEV增殖的关键功能域。Western Blot分析显示,在TGEV WH-1株感染早期,PK-15细胞内源性DDX21蛋白的表达水平显著上调;RT-qPCR、Western Blot、IFA和TCID 50试验显示,超表达DDX21可以显著提高TGEV N基因的mRNA水平、N蛋白的表达及病毒滴度,且呈剂量依赖性,其601-784 aa区域是其影响TGEV复制的关键;与阴性对照相比,在相应DDX21敲低细胞系中TGEV的增殖显著被抑制,而回补试验逆转了DDX21敲低细胞系中TGEV的滴度。该研究首次揭示了猪DDX21对TGEV增殖的促进作用并鉴定了其调控TGEV复制的关键结构域,为今后研究DDX21蛋白的功能及TGEV的致病机理提供了理论依据。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 DEAD-box解旋酶21 宿主蛋白 病毒复制
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eEF1A1调控水疱性口炎病毒和单纯疱疹病毒复制的初步研究
10
作者 陈美桦 徐含翠 +4 位作者 王林旭 罗洪 齐琦 王勃 段小涛 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS 北大核心 2024年第3期170-176,共7页
目的 探讨真核翻译延伸因子1A1(eEF1A1)对水疱性口炎病毒(VSV)和单纯疱疹病毒(HSV-1)复制的影响,以确定一个广谱抗病毒新靶点。方法 在人皮肤成纤维细胞(BJ-5ta)中转染小干扰RNA(sieEF1A1)抑制eEF1A1表达,同时设置阴性对照组,用实时荧... 目的 探讨真核翻译延伸因子1A1(eEF1A1)对水疱性口炎病毒(VSV)和单纯疱疹病毒(HSV-1)复制的影响,以确定一个广谱抗病毒新靶点。方法 在人皮肤成纤维细胞(BJ-5ta)中转染小干扰RNA(sieEF1A1)抑制eEF1A1表达,同时设置阴性对照组,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)与Western印迹法检测转染效率,制备eEF1A1基因沉默的细胞模型。用VSV感染细胞模型,检测细胞内VSV的基因拷贝数和蛋白水平;用HSV-1感染细胞模型,检测细胞内HSV-1的mRNA水平和蛋白水平。用聚胞苷酸[poly(I:C)]或脱氧核糖核酸钠盐(HT-DNA)分别转染细胞模型,RT-qPCR检测干扰素β(IFN-β)、趋化因子10(CXCL10)和干扰素刺激基因56(ISG56)的mRNA水平,Western印迹法检测干扰素调节因子3(IRF3)和TANK结合激酶1(TBK1)蛋白磷酸化水平。结果 与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组eEF1A1的mRNA水平和蛋白水平显著降低(P<0.01),eEF1A1基因沉默的细胞模型构建成功。与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组的VSV基因拷贝数下降70%~80%,VSV蛋白水平显著降低(P<0.01);HSV-1的mRNA水平下降50%~60%,HSV蛋白水平显著降低(P<0.01)。poly(I:C)或HT-DNA刺激后,与阴性对照组相比,eEF1A1基因沉默组的IFN-β、ISG56和CXCL10的mRNA水平以及IRF3与TBK1的蛋白磷酸化水平无显著差异。结论 eEF1A1调控VSV和HSV-1病毒复制,提示eEF1A1对RNA病毒和DNA病毒具有潜在的广谱调控作用,且可能不通过胞内核酸识别激活的免疫通路。 展开更多
关键词 真核翻译延伸因子1A1 水疱性口炎病毒 单纯疱疹病毒 病毒复制
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人β防御素3对绿色荧光蛋白标记水疱性口炎病毒复制的作用
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作者 张乙进 安利娟 +2 位作者 罗红 舒莉萍 江滟 《贵州医科大学学报》 CAS 2024年第9期1299-1304,共6页
目的探讨人β防御素-3(HBD3)对绿色荧光蛋白(GFP)-水疱性口炎病毒(VSV)病毒株复制的作用。方法取对数生长期非洲绿猴肾细胞(Vero)分为Control组、1.00感染复数(MOI)组、0.10 MOI及0.01MOI组,Control组为无病毒对照组,后3组Vero细胞用1.0... 目的探讨人β防御素-3(HBD3)对绿色荧光蛋白(GFP)-水疱性口炎病毒(VSV)病毒株复制的作用。方法取对数生长期非洲绿猴肾细胞(Vero)分为Control组、1.00感染复数(MOI)组、0.10 MOI及0.01MOI组,Control组为无病毒对照组,后3组Vero细胞用1.00 MOI、0.10 MOI、0.01MOI VSV-GFP感染,采用噬斑形成实验观察感染第3天时各组Vero细胞存活情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测感染24 h时1.00、0.10及0.01 MOI组Vero细胞内病毒基质蛋白(M)和GFP信使RNA(mRNA)表达;取对数生长期人非小细胞肺癌细胞(A549)分为未处理组、VSV-GFP组及VSV-GFP+HBD3组,采用Imag J软件对各组镜下A549荧光进行相对定量分析,使用RT-PCR检测各组A549细胞内M和GFP mRNA表达。结果随着病毒滴度的增加,Vero细胞内空斑形成数目增多;Vero细胞内M和GFP mRNA表达表现为0.01 MOI组<0.10 MOI组<1.00 MOI组(P<0.05);VSV-GFP+HBD3组A549细胞单位面积内的荧光强度较VSV-GFP组减弱(P<0.05),M和GFP mRNA表达较VSV-GFP组降低(P<0.05)。结论HBD3可抑制VSV-GFP进入细胞后的病毒复制。 展开更多
关键词 水疱性口炎 病毒 感染 病毒复制 抗菌肽 人β防御素-3 抗病毒
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口蹄疫等病毒可操纵细胞加速病毒复制
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《甘肃畜牧兽医》 2024年第3期58-58,共1页
小RNA病毒能够在人类和动物中引起不同传染性疾病,其进化出多种策略来操纵细胞自噬和凋亡以促进病毒复制和致病,但宿主细胞凋亡和自噬影响病毒复制和致病的机制尚不清楚。近日,中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队... 小RNA病毒能够在人类和动物中引起不同传染性疾病,其进化出多种策略来操纵细胞自噬和凋亡以促进病毒复制和致病,但宿主细胞凋亡和自噬影响病毒复制和致病的机制尚不清楚。近日,中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队解析了一种小RNA病毒的结构蛋白诱导自噬促进病毒复制增强致病性的作用机制。相关研究成果发表在《自噬(Autophagy)》上。 展开更多
关键词 中国农业科学院 口蹄疫 病毒复制 结构蛋白 小RNA病毒 传染性疾病 流行病学 细胞自噬
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天然小分子药物小檗胺影响牛肠道病毒复制的研究 被引量：6
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作者 李泽宇 段卓凡 +7 位作者 邰安然 刘芯怡 刘心愿 于婷婷 文静 杨莉 付强 史慧君 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期881-888,904,共9页
为分析天然小分子药物小檗胺(BBM)是否影响牛肠道病毒(BEV)的复制,本研究以不同浓度的BBM与牛肾细胞(MDBK)共孵育后,采用MTT法检测BBM对MDBK细胞的影响,结果显示,与对照浓度相比,1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L BBM对细胞增殖抑制作用... 为分析天然小分子药物小檗胺(BBM)是否影响牛肠道病毒(BEV)的复制,本研究以不同浓度的BBM与牛肾细胞(MDBK)共孵育后,采用MTT法检测BBM对MDBK细胞的影响,结果显示,与对照浓度相比,1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L BBM对细胞增殖抑制作用均较小(P>0.05)。因此选择上述3种浓度的BBM分别处理MDBK 12 h后以103TCID50BEV感染,24 h后采用间接免疫荧光试验(IFA)检测BEV双链RNA(dsRNA),以确定BBM对BEV的最佳抑制浓度。MDBK细胞经10μmol/L BBM处理后感染BEV,观察48 h内BEV致细胞病变效应(CPE),采用荧光定量PCR检测BEV 5'UTR m RNA转录水平及测定子代病毒滴度,以确定BBM体外对BEV的抑制效果。IFA结果显示,与对照组相比,10μmol/L BBM对BEV ds RNA具有极显著性抑制作用(P<0.01);细胞形态观察结果显示,BBM对BEV引起的细胞大面积脱落具有一定的抑制效果;荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,在感染48 h的细胞中BEV 5'UTR m RNA转录水平极显著降低(P<0.01);子代病毒滴度测定结果显示,在BEV感染24 h和36 h时子代病毒滴度极显著降低(P<0.01)。小鼠预防试验时将24只BALB/c小鼠均分为3组,分别为对照组(0)、低剂量组(50 mg/kg)、高剂量组(100 mg/kg),每日将BBM灌胃1次。给药后3 d滴鼻感染1015TCID50BEV,间隔48 h重复感染一次。感染后分别于5 d、10 d剖杀各组小鼠并采集各组织,采用荧光定量PCR检测BEV 5'UTR m RNA的转录水平。小鼠感染治疗试验时将48只BALB/c小鼠均分为BEV阳性对照组(BEV/DMSO)、感染给药组(BEV/BBM)、给药对照组(BBM),BEV阳性对照组和BEV/BBM组小鼠滴鼻感染1015TCID50BEV后,各组每天按原剂量灌胃BBM一次,感染后0、3 d、6 d和10 d剖杀各组小鼠并采集各组织,检测BEV 5'UTR m RNA的转录水平,并制备病理切片观察各组织的病变。BALB/c小鼠预防试验结果显示,各浓度BBM均具有显著或极显著抑制BALB/c小鼠肝、脾、肾、小肠组织中BEV 5'UTR m RNA转录水平升高的作用(P<0.05或P<0.01);与对照组相比,各浓度BBM均具有减轻各组织病变作用。其中高剂量组预防效果最明显,且随给药时间延长预防效果也最好。小鼠治疗试验结果显示,感染BEV后灌胃BBM当日即可抑制BEV在小鼠组织中的复制;病理学观察结果显示,对感染对照组相比,BBM可减轻小鼠各组织充血、出血、炎性细胞浸润等情况。综上所述,本研究首次证实BBM在体内外均具有抑制BEV复制的作用,为牛腹泻病的治疗及开发BBM抗病毒药物提供参考依据。 展开更多
关键词 天然小分子药物 小檗胺 牛肠道病毒 病毒复制 双链RNA
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MicroRNA调控抗病毒免疫和病毒复制 被引量：1
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作者 王岚 何明宇 +1 位作者 张敏 丁军涛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期463-472,共10页
MicroRNA(miRNA)是一类高度保守的内源性非编码单链小RNA分子,长度约为19~25 nt,通常在基因表达的转录后水平起调控作用,参与细胞发育、增殖、凋亡、免疫等多种生命活动。大量的研究表明,多种miRNAs通过直接或间接的方法在病毒感染期间... MicroRNA(miRNA)是一类高度保守的内源性非编码单链小RNA分子,长度约为19~25 nt,通常在基因表达的转录后水平起调控作用,参与细胞发育、增殖、凋亡、免疫等多种生命活动。大量的研究表明,多种miRNAs通过直接或间接的方法在病毒感染期间调节病毒复制、细胞增殖或凋亡以及肿瘤发育等生物反应。本文主要对病毒感染期间miRNA在免疫反应、病毒复制中的调控机制进行综述,旨在为miRNA的开发应用和抗病毒相关治疗策略提供参考。 展开更多
关键词 MICRORNA 病毒感染 病毒复制 免疫调控
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替米考星体内抑制猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒复制的效果研究 被引量：1
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作者 赵永祥 宋旭 +3 位作者 周金柱 范宝超 赫文龙 李彬 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第12期50-54,共5页
前期研究表明替米考星可在体外抑制猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的复制,为进一步了解替米考星在体内抑制PRRSV复制的效果,本研究选取健康仔猪为试验动物,使用添加替米考星的饲料和无添加的饲料分组饲养,仔猪饲喂7 d后人工感染PRRS... 前期研究表明替米考星可在体外抑制猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)的复制,为进一步了解替米考星在体内抑制PRRSV复制的效果,本研究选取健康仔猪为试验动物,使用添加替米考星的饲料和无添加的饲料分组饲养,仔猪饲喂7 d后人工感染PRRSV高致病性毒株,对比分析饲喂替米考星对猪感染PRRSV后的临床表现、体内病毒复制情况、病死率以及生长性能等方面的影响。结果显示,替米考星可显著抑制PRRSV在猪体内的复制,减轻发病症状,降低20%的病死率,并提升仔猪的日增重。相关结果可为临床使用替米考星防控PRRSV感染提供参考。 展开更多
关键词 替米考星 PRRSV 体内 抑制作用 病毒复制
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E3泛素连接酶RNF165在A亚群禽白血病病毒复制中的作用 被引量：1
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作者 王兴明 王后坤 +3 位作者 陈雪阳 方春 梁雄燕 杨玉莹 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期3781-3789,共9页
【目的】探明鸡源环指蛋白165(ring finger protein 165,RNF165)在A亚群禽白血病病毒(ALV-A)复制中的作用,为进一步研究鸡源RNF165对ALV-A致病性的影响提供参考。【方法】将ALV-A接种于DF-1细胞和1日龄雏鸡,通过Western blotting和实时... 【目的】探明鸡源环指蛋白165(ring finger protein 165,RNF165)在A亚群禽白血病病毒(ALV-A)复制中的作用,为进一步研究鸡源RNF165对ALV-A致病性的影响提供参考。【方法】将ALV-A接种于DF-1细胞和1日龄雏鸡,通过Western blotting和实时荧光定量PCR方法分别从体外和体内两个方面验证ALV-A对宿主RNF165表达的影响;参考已公布的RNF165基因序列设计过表达引物,通过PCR扩增RNF165基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1;将验证表达的重组质粒转染DF-1细胞,1 d后接种ALV-A,使用Western blotting检测过表达RNF165对病毒复制的影响;最后设计突变引物,构建RNF165功能结构域突变质粒,将过表达质粒和突变质粒分别转染DF-1细胞,1 d后接种ALV-A,Western blotting测定gp85蛋白表达差异。【结果】ALV-A感染DF-1细胞后未能检测到内源性的RNF165蛋白,但基因转录水平较对照组明显下调(P<0.01)。在体内试验中,与对照组相比,感染病毒雏鸡肝脏中RNF165基因和蛋白表达水平均有所下调(P<0.01);通过PCR成功扩增到大小为1068 bp的目的片段并成功克隆至pcDNA3.1,Western blotting结果显示,在39 ku处出现目的条带,RNF165过表达后促进了病毒复制;测序结果显示,成功构建出功能结构域突变质粒,与过表达质粒组相比,RNF165突变质粒组病毒的复制水平受到显著抑制。【结论】ALV-A感染抑制DF-1细胞和雏鸡肝脏RNF165的表达,在体外试验中,过表达RNF165会促进ALV-A的复制,且这种影响与其保守结构域有关。 展开更多
关键词 环指蛋白165 A亚群禽白血病病毒(ALV-A) 病毒复制 功能结构域突变
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环状RNA hsacirc0000290调控寨卡病毒复制的分子机制的初步探究
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作者 康澜 叶海艳 +4 位作者 黄怡可 徐敏 陈利民 段晓琼 李世林 《中国输血杂志》 CAS 2023年第4期289-294,共6页
目的探究可经血液传播的寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)在体外感染细胞后对环状RNA hsa_circ_0000290表达的影响及hsa_circ_0000290对寨卡病毒复制的影响。方法ZIKV感染A549或U251细胞后,连续1~4 d收集细胞并提取细胞总RNA。通过RT-qPCR检测... 目的探究可经血液传播的寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)在体外感染细胞后对环状RNA hsa_circ_0000290表达的影响及hsa_circ_0000290对寨卡病毒复制的影响。方法ZIKV感染A549或U251细胞后,连续1~4 d收集细胞并提取细胞总RNA。通过RT-qPCR检测hsa_circ_0000290的表达变化;hsa_circ_0000290由PDHX转录产生。通过转染siRNA敲低hsa_circ_0000290的表达后,通过RT-qPCR和Western blot检测对ZIKV和PDHX表达的影响。通过核质定位实验验证hsa_circ_0000290在细胞中的定位。结果与对照组相比,hsa_circ_0000290在感染ZIKV 1~4 d的A549和U251细胞中表达上调;hsa_circ_0000290主要定位于细胞核,敲低细胞内hsa_circ_0000290的表达水平可以抑制ZIKV RNA复制和ZIKV NS1蛋白的表达,促进PDHX的表达。结论ZIKV感染细胞后,hsa_circ_0000290表达水平显著升高;hsa_circ_0000290定位于细胞核中,特异性敲低hsa_circ_0000290表达水平后,明显抑制ZIKV复制。 展开更多
关键词 寨卡病毒 输血传播 环状RNA hsa_circ_0000290 病毒复制
原文传递
衰老细胞促进病毒感染诱导的炎症并抑制病毒复制
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作者 崔湘铧 邬开朗 祝成亮 《微循环学杂志》 2023年第2期9-15,共7页
目的:探究衰老对病毒感染和病毒复制的影响及机制。方法:利用阿霉素(DOX)诱导人非小细胞肺癌细胞(A549)衰老(衰老组),常规培养的A549细胞为对照组。利用带绿色荧光蛋白标签的水疱性口炎病毒(VSV)和单纯疱疹病毒(HSV)感染对照组和衰老组A... 目的:探究衰老对病毒感染和病毒复制的影响及机制。方法:利用阿霉素(DOX)诱导人非小细胞肺癌细胞(A549)衰老(衰老组),常规培养的A549细胞为对照组。利用带绿色荧光蛋白标签的水疱性口炎病毒(VSV)和单纯疱疹病毒(HSV)感染对照组和衰老组A549细胞。选取无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠,8周龄为年轻组(n=3),15月龄以上为年老组(n=3),腹腔注射VSV病毒1×10~7PFU/只,24h后采集肝、脾、肺组织。应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测干扰素-β(IFN-β)、白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)以及病毒复制;蛋白质印迹法(WB)检测核因子κB(NF-κB)信号通路关键蛋白核因子κB p65蛋白、磷酸化核因子κB p65(p-p65)蛋白表达量;荧光倒置显微镜观察VSV病毒和HSV病毒复制。结果:与对照组相比,衰老组细胞周期阻滞蛋白P16、P21显著升高;β-半乳糖苷酶染色阳性细胞也明显增多;两组细胞同时感染VSV病毒,衰老组细胞IFN-β显著降低,而IL-6、IL-1β显著升高;同时NF-κB通路关键蛋白p65、p-p65表达较对照组明显增加。两组细胞感染VSV及HSV病毒,衰老组细胞相应的病毒复制水平也显著降低(P<0.05或P<0.01)。与年轻组小鼠相比,年老组小鼠感染VSV病毒后脾和肺中炎症反应显著增强,肝中无明显变化。结论:DOX可以诱导细胞衰老。衰老细胞和衰老个体感染病毒后表现为较高的炎症反应,衰老细胞感染病毒还表现较低的抗病毒反应,这些可能是衰老导致病毒疾病进程延长的潜在原因。 展开更多
关键词 衰老 病毒感染 炎症反应 干扰素 病毒复制
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人类免疫缺陷病毒/乙型肝炎病毒合并感染者CD4^(+)T细胞计数和乙型肝炎病毒复制、中性粒细胞与淋巴细胞比值水平的相关性 被引量：3
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作者 杨杨 刘付弟 曾方林 《中国医药导报》 CAS 2023年第10期145-148,共4页
目的探讨人类免疫缺陷病毒(HIV)/乙型肝炎病毒(HBV)合并感染者CD4^(+)T细胞计数和HBV复制、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)的相关性。方法回顾性分析2018年2月至2022年1月扬州大学附属医院收治的59例HBV单纯感染者(HBV组)与76例HIV/HBV... 目的探讨人类免疫缺陷病毒(HIV)/乙型肝炎病毒(HBV)合并感染者CD4^(+)T细胞计数和HBV复制、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)的相关性。方法回顾性分析2018年2月至2022年1月扬州大学附属医院收治的59例HBV单纯感染者(HBV组)与76例HIV/HBV合并感染者(HIV/HBV组)的临床资料。HIV/HBV组根据CD4^(+)T细胞计数分为A组(CD4^(+)T细胞计数>200个/μl,31例)和B组(CD4^(+)T细胞计数≤200个/μl,45例)。比较HBV组与HIV/HBV组CD4^(+)T细胞计数、HBV DNA水平及NLR,进一步比较A组与B组的HBV DNA水平及NLR,分析HIV/HBV合并感染者CD4^(+)T细胞计数与HBV DNA水平及NLR的相关性。结果HIV/HBV组CD4^(+)T细胞计数、HBV DNA水平低于HBV组,NLR高于HBV组,差异有统计学意义(P<0.05)。A组HBV DNA水平及NLR均低于B组,差异有统计学意义(P<0.05)。HIV/HBV组CD4^(+)T细胞计数与HBV DNA水平及NLR均呈负相关(r<0,P<0.05)。结论HIV/HBV合并感染者CD4^(+)T细胞计数降低,HBV DNA复制更加活跃,对临床指导用药具有重要意义。 展开更多
关键词 人类免疫缺陷病毒 乙型肝炎病毒 CD4^(+)T细胞 病毒复制 中性粒细胞与淋巴细胞比值 相关性
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A型流感病毒2009年大流行株NS1蛋白通过诱导宿主细胞自噬促进病毒复制 被引量：1
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《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期220-220,共1页
A型流感病毒属于正黏病毒科、流感病毒属,是分节段、有囊膜、负链RNA病毒。流感可在人群中引起广泛流行甚至大流行,严重威胁人类公共卫生安全。2009年一种新型四源重组流感病毒A/(H1N1)pdm09在世界各地出现并引起21世纪的第一次流感大... A型流感病毒属于正黏病毒科、流感病毒属,是分节段、有囊膜、负链RNA病毒。流感可在人群中引起广泛流行甚至大流行,严重威胁人类公共卫生安全。2009年一种新型四源重组流感病毒A/(H1N1)pdm09在世界各地出现并引起21世纪的第一次流感大流行。A/(H1N1)pdm09株具有较高复制能力,传播速度极快,在一个月内即传播至一百多个国家。然而,针对A/(H1N1)pdm09的研究大多是基于临床数据的分子流行病学分析,在病毒的复制机制及与宿主细胞相互作用机制方面存在诸多未知。因此,A/(H1N1)pdm09株区别于其他病毒株引起流感大流行的原因和机制是本领域亟待解决的核心问题。 展开更多
关键词 A型流感病毒 NS1蛋白 病毒株 公共卫生安全 病毒复制 细胞自噬 传播速度 流感大流行
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