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FUS1和IL-12双基因真核共表达质粒的构建及对A549细胞促凋亡作用研究 被引量：2
1
作者 张冬梅 杨寒朔 +3 位作者 朱文 冯志华 邓洪新 魏于全 《四川大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期569-574,共6页
目的构建FUS1和人IL-12双基因真核共表达质粒并在肺癌A549细胞中检测基因表达及诱导细胞凋亡作用。方法采用RT-PCR技术从人肺成纤维细胞MRC-5中逆转录扩增全长FUS1基因,通过PCR技术从pORF-hIL-12质粒中扩增含双亚基的全长IL-12基因。FUS... 目的构建FUS1和人IL-12双基因真核共表达质粒并在肺癌A549细胞中检测基因表达及诱导细胞凋亡作用。方法采用RT-PCR技术从人肺成纤维细胞MRC-5中逆转录扩增全长FUS1基因,通过PCR技术从pORF-hIL-12质粒中扩增含双亚基的全长IL-12基因。FUS1和IL-12分别经酶切后定向插入真核细胞双顺反子载体pVITRO2的多克隆位点中,酶切和测序鉴定双基因共表达质粒pVITRO2-FUS1-IL-12的构建。以pVITRO2-FUS1-IL-12转染肺癌A549细胞,通过RT-PCR、ELISA和Western blot方法检测目的基因的表达,以Hoechst33258染色及流式细胞术验证pVITRO2-FUS1-IL-12在体外的促凋亡作用。结果酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达质粒pVITRO2-FUS1-IL-12,在转染后的细胞中同时检测到了FUS1和IL-12的表达,两种基因在双基因表达载体上的表达量基本不受影响。双基因共表达质粒pVITRO2-FUS1-IL-12具有明显诱导肺癌细胞凋亡的作用。结论成功构建pVITRO2-FUS1-IL-12双基因真核共表达质粒,为肺癌的多基因联合治疗提供了又一新的思路和方法。 展开更多
关键词 肺癌 FUS1 IL-12 真核共表达载体 联合基因治疗
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2A肽介导猪PID1与CuZnSOD双基因真核共表达载体的构建与细胞表达
2
作者 张哲 李同明 +6 位作者 曾勇庆 陈伟 徐正刚 杨云 房国锋 王守栋 楚青惠 《生物学杂志》 CAS CSCD 2014年第6期1-5,共5页
构建PID1基因与CuZnSOD基因的真核共表达载体,在PK15细胞中鉴定基因的表达。PCR扩增的PID1与CuZnSOD两基因分别经双酶切后定向插入pIRES2-AcGFP1空载体,构建pIRES2-CuZnSOD-PID1真核双表达载体并进行测序与酶切鉴定。采用脂质体转染法... 构建PID1基因与CuZnSOD基因的真核共表达载体,在PK15细胞中鉴定基因的表达。PCR扩增的PID1与CuZnSOD两基因分别经双酶切后定向插入pIRES2-AcGFP1空载体,构建pIRES2-CuZnSOD-PID1真核双表达载体并进行测序与酶切鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒转染至PK15细胞,细胞内荧光显微镜下观察其荧光的表达,RT-PCR、Westernblot技术分别检测PID1基因与CuZnSOD基因mRNA和蛋白表达情况。重组克隆载体插入目的片段序列与PID1基因与CuZnSOD基因序列完全一致。PIRES2-CuZnSOD-PID1真核双表达载体测序、酶切鉴定结果与预期结果一致。荧光显微镜下观察转染后的PK15细胞出现绿色荧光。RT-PCR检测结果显示,转染细胞中PID1基因与CuZnSOD基因表达量明显高于对照组(P<0.05)。Westernblot检测结果表明pIRES2-CuZnSODPID1真核双表达载体稳定有效表达。成功构建pIRES2-CuZnSOD-PID1真核共表达载体,且双基因在真核细胞独立稳定表达,为转基因猪等育种新材料的制备奠定基础。 展开更多
关键词 2A肽 PID1 CUZNSOD 真核共表达载体 PK15细胞
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犬新孢子虫MAG1与IFN-γ融合基因重组真核质粒的真核共表达及免疫学评价
3
作者 焦石 贾立军 +4 位作者 张立霞 钱年超 刘明明 黄国明 张守发 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第8期662-666,共5页
为对犬孢子虫MAG1与IFN-γ融合基因重组真核质粒进行免疫学评价,本实验以含有MAG1-IFN-γ基因片段的克隆质粒为模板,扩增MAG1-IFN-γ目的片段,构建pVAX-MAG1-IFN-γ重组真核表达质粒,将其转染Vero细胞,采用间接免疫荧光(IFA)和western b... 为对犬孢子虫MAG1与IFN-γ融合基因重组真核质粒进行免疫学评价,本实验以含有MAG1-IFN-γ基因片段的克隆质粒为模板,扩增MAG1-IFN-γ目的片段,构建pVAX-MAG1-IFN-γ重组真核表达质粒,将其转染Vero细胞,采用间接免疫荧光(IFA)和western blot技术检测MAG1基因在Vero细胞中的表达,并免疫BALB/c小鼠,进行免疫学评价。结果表明,PCR扩增获得基因片段大小为1 536 bp,与GenBank中登录的MAG1和IFN-γ核苷酸序列的同源性为99%;IFA检测MAG1基因在Vero细胞中获得瞬时表达,转染的Vero细胞呈现特异性绿色荧光;western blot分析表达蛋白的分子量为57 ku,具有较好的反应原性。将构建的重组真核表达质粒免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA和T淋巴细胞亚群含量测定表明,重组质粒具有较好的免疫原性。本实验为新孢子虫病核酸疫苗的深入研究奠定了基础。 展开更多
关键词 犬新孢子虫 MAG1-IFN-γ 真核共表达
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口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达
4
作者 魏衍全 田宏 +5 位作者 吴锦艳 陈妍 尚佑军 窦永喜 刘湘涛 才学鹏 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期479-483,共5页
为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒... 为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 3C基因 增强型绿色荧光蛋白 真核共表达
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FUS1/hIL-12双基因阳离子脂质体复合物特性研究
5
作者 余川江 肖雯婧 +3 位作者 张冬梅 欧文婧 冯志华 朱文 《生物医学工程学杂志》 EI CAS CSCD 北大核心 2010年第4期859-864,共6页
研究FUS1/hIL-12双基因阳离子脂质体复合物的生物学和药剂学特性,评估其作为肺癌基因治疗药物的转染效率、稳定性以及毒性。阳离子脂质体与质粒以不同质量比配制后用凝胶阻滞实验和激光粒度仪测定粒径和zeta电位确定阳离子脂质体与质粒... 研究FUS1/hIL-12双基因阳离子脂质体复合物的生物学和药剂学特性,评估其作为肺癌基因治疗药物的转染效率、稳定性以及毒性。阳离子脂质体与质粒以不同质量比配制后用凝胶阻滞实验和激光粒度仪测定粒径和zeta电位确定阳离子脂质体与质粒DNA的最佳配比;通过分别转染增强型绿色荧光蛋白质粒EGFP和PVITO2-hIL12/FUS1双基因质粒入A549肺癌细胞,倒置荧光显微镜、细胞爬片免疫组化和酶联免疫法分别检测EGFP、FUS1和hIL-12在肺癌细胞中的表达;以琼脂糖凝胶电泳检测双基因脂质体复合物与血清和DNaseⅠ孵育的稳定性;通过双基因脂质体复合物与红细胞孵育后显微镜观察其对红细胞形态的影响。研究结果为将来FUS1/hIL-12双基因阳离子脂质体复合物用于肺癌的基因治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 FUS1/hIL-12 真核共表达质粒 阳离子脂质体 肺癌 基因治疗
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